高效液相色谱讲义

1、第七章第七章 高效液相色谱法高效液相色谱法第一节第一节 概述概述一、史程、专用术语一、史程、专用术语二、色谱分离过程和类型二、色谱分离过程和类型液固吸附色谱液固吸附色谱液液分配色谱液液分配色谱离子交换色谱离子交换色谱离子对色谱离子对色谱空间排阻色谱空间排阻色谱三、色谱流程和仪器三、色谱流程和仪器四、四、HPLCHPLC的特点的特点速度快，分辨率高，灵敏度高、柱子可反复使用速度快，分辨率高，灵敏度高、柱子可反复使用第二节第二节 基本理论基本理论一、色谱分离过程一、色谱分离过程（一）液（一）液- -固吸附色谱固吸附色谱流动相为液体，固定相为固体吸附剂，根据物质吸流动相为液体，固定相为固体吸附剂，根

2、据物质吸附作用的不同来分离物质。附作用的不同来分离物质。流动相和固定相都是液体的色谱法即为液流动相和固定相都是液体的色谱法即为液- -液液色谱，是利用样品组分在两种不相溶的液相间色谱，是利用样品组分在两种不相溶的液相间的分配来进行分离。一种液相为流动相，另一的分配来进行分离。一种液相为流动相，另一种是涂渍于载体上的固定相。种是涂渍于载体上的固定相。（二）液（二）液- -液分配色谱液分配色谱流动相极性小于固定相极性的液流动相极性小于固定相极性的液- -液色谱法称为正相液色谱法称为正相分配色谱法分配色谱法流动相极性大于固定相极性的液流动相极性大于固定相极性的液- -液色谱法称为反相液色谱法称为反相

3、分配色谱法分配色谱法（三）离子交换色谱（三）离子交换色谱（四）离子对色谱法（四）离子对色谱法（五）分子排阻色谱法（五）分子排阻色谱法二、色谱流出曲线和保留值二、色谱流出曲线和保留值（一）色谱流出曲线及相关术语（一）色谱流出曲线及相关术语（二）保留值（二）保留值三、分离度三、分离度第三节第三节 定性和定量分析定性和定量分析一、定性分析一、定性分析（一）利用已知物对照法定性（一）利用已知物对照法定性1 1、利用保留特性、利用保留特性2 2、利用不同柱比较、利用不同柱比较（二）色谱法和其他方法结合定性（二）色谱法和其他方法结合定性1 1、利用化学反应定性、利用化学反应定性2 2、利用二极管陈列检测器

4、、利用二极管陈列检测器3 3、收集峰的流出物、收集峰的流出物4 4、HPLC-MSHPLC-MS二、定量分析二、定量分析（一）峰面积或峰高的测量方法（一）峰面积或峰高的测量方法1 1、手测峰高、手测峰高2 2、峰高乘半峰宽、峰高乘半峰宽3 3、剪纸称重、剪纸称重4 4、积分仪测定、积分仪测定5 5、微处理机测定、微处理机测定（二）定量方法（二）定量方法1 1、峰面积归一法、峰面积归一法2 2、外标法、外标法3 3、内标法、内标法4 4、内加法（或追加法）、内加法（或追加法）第四节第四节 高效液相色谱的分离模式高效液相色谱的分离模式一、基本原理一、基本原理二、分类二、分类1 1、吸附色谱、吸附色

5、谱2 2、分配色谱、分配色谱3 3、离子交换色谱、离子交换色谱4 4、分子排阻色谱、分子排阻色谱5 5、亲和色谱、亲和色谱三、三、HPLCHPLC在生物大分子中的应用在生物大分子中的应用在生物大分子中的在生物大分子中的HPLCHPLC中，中，体积排阻色谱体积排阻色谱，离离子交换子交换、反相液相和亲和色谱反相液相和亲和色谱是最常用的分离是最常用的分离模式。模式。第五节第五节 液液- -固色谱法固色谱法液液- -固色谱法通常称为吸附色谱固色谱法通常称为吸附色谱1 1、载体：硅胶、载体：硅胶2 2、吸附剂吸附试样的能力、吸附剂吸附试样的能力3 3、原理、原理第六节第六节 键合相色谱法键合相色谱法一、

6、正相色谱法一、正相色谱法1 1、在正相色谱法中共价结合到载体上的基团、在正相色谱法中共价结合到载体上的基团都是极性基团。都是极性基团。2 2、分离机制属于分配色谱、分离机制属于分配色谱3 3、主要用于分离极性不同的化合物，特别是、主要用于分离极性不同的化合物，特别是用来分离不同类型的化合物。用来分离不同类型的化合物。二、反相色谱二、反相色谱1 1、分离机理、分离机理2 2、固定相、固定相3 3、流动相、流动相第七节第七节 离子交换色谱离子交换色谱离子交换色谱是以离子交换色谱是以离子交换树脂离子交换树脂作为固定相，作为固定相，树脂上具有树脂上具有固定离子基团固定离子基团及及可交换的离子基团可交换

7、的离子基团，当流动相带着组分电离生成的离子通过固定相时，当流动相带着组分电离生成的离子通过固定相时，组分离子与树脂上可交换的离子基团进行可逆交组分离子与树脂上可交换的离子基团进行可逆交换，根据组分离子对树脂亲和力不同而得到分离。换，根据组分离子对树脂亲和力不同而得到分离。按结合的基团不同，离子交换树脂可分为按结合的基团不同，离子交换树脂可分为阳离子阳离子交换树脂交换树脂和和阴离子交换树脂阴离子交换树脂。 种类种类阳离子交换树脂阳离子交换树脂强酸性强酸性弱酸性弱酸性阴离子交换树脂阴离子交换树脂强碱性强碱性弱碱性弱碱性NR2NHRNH2N (CH3)3XNC2H4OH(CH3)2X-SO3HCOO

8、H-PO3H离子交换层析适用性离子交换层析适用性 能在水溶液或含水极性溶剂中产生游能在水溶液或含水极性溶剂中产生游离离子基团的酸、碱及两性成分。可用于离离子基团的酸、碱及两性成分。可用于氨基酸、肽类、生物碱、有机酸、酚类等氨基酸、肽类、生物碱、有机酸、酚类等水溶性成分的分离。水溶性成分的分离。使用离子交换剂使物质分离表使用离子交换剂使物质分离表 样品样品 强酸型强酸型(磺酸型磺酸型) 稀稀NH4OH洗脱洗脱 通过液通过液 酸性、中性化合物酸性、中性化合物 解离型、两性化合物解离型、两性化合物 稀稀NaOH洗脱洗脱 强碱型强碱型(季铵型季铵型) 强碱型强碱型 稀稀HCl洗脱洗脱 通过液通过液 通

9、过液通过液 酸性化合物酸性化合物 中性化合物中性化合物 解离型物质解离型物质 两性化合物两性化合物 (盐、生物碱盐、生物碱)一、离子交换色谱的分离机理一、离子交换色谱的分离机理1、qxyP + L PL不足之处不足之处：忽略了在填料表面上形成复合物时：忽略了在填料表面上形成复合物时溶质被流动相中小分子饱和并不断进行计量置溶质被流动相中小分子饱和并不断进行计量置换反应的重要因素。换反应的重要因素。2 2、P0 + ZD0 Pb + ZDbP P0 0：流动相中溶质的浓度：流动相中溶质的浓度P Pb b：填料表面上被吸附的溶质浓度：填料表面上被吸附的溶质浓度D D0 0：流动相中洗脱剂的浓度：流动

10、相中洗脱剂的浓度D Db b：填料表面上洗脱剂的浓度：填料表面上洗脱剂的浓度Z Z：是蛋白质在吸附过程中从填料表面上被置换的：是蛋白质在吸附过程中从填料表面上被置换的洗脱剂的数目洗脱剂的数目。K=Pb X (Db)zP0 X (D0)z Z可以小到忽略不计，反应常数变为分配系数可以小到忽略不计，反应常数变为分配系数Kd=Pb P0 在Z值不能忽略时值不能忽略时K= (Db)z (D0)zKdx在等度洗脱蛋白质的过程中，容量因子在等度洗脱蛋白质的过程中，容量因子KK与保与保留留体积成比例，同时洗脱过程中，体积成比例，同时洗脱过程中，K Kd d， D Db b是常数，是常数，用用K Kz z表示

11、。表示。K= 1 (D0)zKzx 1 D0lgK = lg Kz + Zlg3 3 结论结论二、离子交换色谱的固定相二、离子交换色谱的固定相1 1、高分子类型填料、高分子类型填料 优点优点a填料的使用寿命长填料的使用寿命长b具有较高的色谱容量具有较高的色谱容量c 很少有非特异性吸附，对于保持样品生物活性很少有非特异性吸附，对于保持样品生物活性有利。有利。 结构结构以交联共聚的苯乙烯以交联共聚的苯乙烯- -二乙烯苯为基质，同时二乙烯苯为基质，同时也出现了许多其他交联高聚物基质的固定相。也出现了许多其他交联高聚物基质的固定相。 类型类型Mono BeadsTSK-gel DEAE-5PW SP-

12、5PWCM-5PW2 2、无机基质型、无机基质型三、离子交换色谱的流动相离子交换色谱的流动相1 1、流动相的、流动相的PHPH值值 离子交换容量受离子交换容量受流动相的流动相的PHPH值影响值影响 改变流动相改变流动相PHPH值，也会影响弱电离的酸值，也会影响弱电离的酸性或碱性组分的电离情况，因而改变组分的性或碱性组分的电离情况，因而改变组分的保留值。保留值。流动相流动相PHPH值的变化也能改变分离的选择性值的变化也能改变分离的选择性 对流动相对流动相PHPH值的控制，通常采用缓冲溶液值的控制，通常采用缓冲溶液来实现。来实现。2 2、流动相的离子强度、流动相的离子强度四、离子交换色谱的影响因素

13、四、离子交换色谱的影响因素1 1、填料孔径的影响、填料孔径的影响2 2、柱长的影响、柱长的影响3 3、流速的影响、流速的影响4 4、PHPH值的影响值的影响无论在强的还是弱的阴离子交换柱上，蛋白质无论在强的还是弱的阴离子交换柱上，蛋白质均显示不同均显示不同PHPH值影响结果，因此决定了它的保值影响结果，因此决定了它的保留选择性、分离度和回收率等因素。留选择性、分离度和回收率等因素。5 5、离子强度的影响、离子强度的影响第八节第八节 体积排阻色谱法体积排阻色谱法一、分离机理一、分离机理1、体积排阻色谱法（体积排阻色谱法（SECSEC） 或空间排阻色谱法（或空间排阻色谱法（SECSEC） 或凝胶色

14、谱法或凝胶色谱法2、凝胶过滤色谱法（凝胶过滤色谱法（GFCGFC）Sephadex 葡聚糖凝胶3、凝胶渗透色谱法（凝胶渗透色谱法（GPCGPC）4 4、空间排斥理论、空间排斥理论Xm Xsk = Xs/XmVR =V0 + K VSV V0 0 死体积，相当于凝胶的粒间体积死体积，相当于凝胶的粒间体积V Vs s 色谱柱中凝胶的孔穴总体积色谱柱中凝胶的孔穴总体积二、体积排阻色谱法的特点二、体积排阻色谱法的特点三、体积排阻色谱法的固定相三、体积排阻色谱法的固定相（一）（一）固定相的分类固定相的分类1 1、按固定相基质分类、按固定相基质分类2 2、按固定相机械强度分类、按固定相机械强度分类（二）凝

15、胶固定相的特性参数（二）凝胶固定相的特性参数1 1、渗透极限、渗透极限2 2、分离范围、分离范围3 3、固流相比、固流相比在在SECSEC中常将柱中中常将柱中凝胶孔体积凝胶孔体积中的溶剂称为中的溶剂称为固定相固定相，而将柱中，而将柱中凝胶颗粒间空隙体积凝胶颗粒间空隙体积中称为中称为流动相流动相，而凝胶孔体积与凝胶颗粒间空隙体积，而凝胶孔体积与凝胶颗粒间空隙体积的比值称作固流相比。的比值称作固流相比。4 4、柱效、柱效（三）凝胶色谱柱的制备及谱图的特点（三）凝胶色谱柱的制备及谱图的特点物理因素物理因素影响凝胶色谱柱的性能影响凝胶色谱柱的性能 扩大分离范围扩大分离范围使用两根以上的串联色谱使用两根

16、以上的串联色谱柱柱。更换流动相更换流动相谱图的特点：在凝胶渗透色谱中，对不同分子量谱图的特点：在凝胶渗透色谱中，对不同分子量聚合物色谱峰的谱带展宽不同于其它液相色谱。聚合物色谱峰的谱带展宽不同于其它液相色谱。 在低效排租色谱法，样品分子大小随在低效排租色谱法，样品分子大小随V的增加的增加而急剧减小，而柱效却随样品分子量的增加而增而急剧减小，而柱效却随样品分子量的增加而增大因此在色谱图上，不同分子量组分的谱带宽度大因此在色谱图上，不同分子量组分的谱带宽度保持不变。保持不变。 在高效排租色谱法，峰宽却是个变量。在高效排租色谱法，峰宽却是个变量。四、体积排租色谱法的流动相四、体积排租色谱法的流动相在

17、体积排租色谱法中，流动相的性质对保留值在体积排租色谱法中，流动相的性质对保留值和分离选择性无影响。和分离选择性无影响。 溶解样品的良溶剂溶解样品的良溶剂 低黏度溶剂低黏度溶剂 柱填料不能在溶剂作用下收缩或溶胀柱填料不能在溶剂作用下收缩或溶胀 控制流动相的控制流动相的PH值和离子强度值和离子强度 凝胶渗透色谱凝胶渗透色谱示差折光检测器示差折光检测器流动相的折射率必须尽可能与样品的折射率流动相的折射率必须尽可能与样品的折射率有较大的差别。有较大的差别。凝胶过滤色谱凝胶过滤色谱紫外吸收检测器紫外吸收检测器使用在检测波长无紫外吸收的溶剂作流动相。使用在检测波长无紫外吸收的溶剂作流动相。（一）凝胶渗透色

18、谱的流动相（一）凝胶渗透色谱的流动相凝胶渗透色谱常采用凝胶渗透色谱常采用甲苯，四氢呋喃和氯仿甲苯，四氢呋喃和氯仿等等有机溶剂作流动相。有机溶剂作流动相。在用于高聚物分子量测定的凝胶渗透色谱中，在用于高聚物分子量测定的凝胶渗透色谱中，四氢呋喃四氢呋喃是最常用的流动相，它对样品有良好是最常用的流动相，它对样品有良好的溶解性能和低的黏度，并可使小孔径聚苯乙的溶解性能和低的黏度，并可使小孔径聚苯乙烯凝胶溶胀，因此被优先推荐使用。烯凝胶溶胀，因此被优先推荐使用。（二）凝胶过滤色谱的流动相（二）凝胶过滤色谱的流动相在凝胶过滤色谱中，使用以水作基体具有不同在凝胶过滤色谱中，使用以水作基体具有不同PH值的多种

19、缓冲溶液作流动相。值的多种缓冲溶液作流动相。五五、体积排租色谱的影响因素体积排租色谱的影响因素1、填料、填料 化学键合的硅胶化学键合的硅胶 亲水树脂凝胶亲水树脂凝胶2、柱长、柱长体积排租色谱的分离度与柱长的平方根成正比。体积排租色谱的分离度与柱长的平方根成正比。3、洗脱液、洗脱液 以硅胶为基质的填料，以硅胶为基质的填料，PH值范围在值范围在2.0-8.0。 键合硅胶如键合硅胶如TSK系列凝胶柱在分离蛋白质时系列凝胶柱在分离蛋白质时保留时间主要取决于填料表面上的硅醇基与离保留时间主要取决于填料表面上的硅醇基与离子的反应。子的反应。a) 洗脱液离子强度低时洗脱液离子强度低时b) 洗脱液离子强度低增

20、加到洗脱液离子强度低增加到0.3-0.5mol/Lc) 常用磷酸盐和硫酸盐进行离子强度的调节常用磷酸盐和硫酸盐进行离子强度的调节d) 用氯化钠作离子剂，疏水作用最小用氯化钠作离子剂，疏水作用最小e) PH值不能太低，因为值不能太低，因为H+会腐蚀不锈钢柱会腐蚀不锈钢柱4、流速、流速蛋白质分离时，流速对分离度的影响是一个很蛋白质分离时，流速对分离度的影响是一个很重要的因素，一般在低流速下蛋白质分离是比重要的因素，一般在低流速下蛋白质分离是比较理想。较理想。5、样品容量、样品容量进样体积和样品的浓度将明显地影响蛋白质的进样体积和样品的浓度将明显地影响蛋白质的分离度。分离度。样品的浓度范围一般在样品

21、的浓度范围一般在0.01%-0.5%.最好是高浓度、小体积、在一般范围内可以得最好是高浓度、小体积、在一般范围内可以得到好的分离效果。蛋白质的样品体积为柱体积到好的分离效果。蛋白质的样品体积为柱体积的的1%-3%比较合适。比较合适。6、蛋白质在变性条件下的分离、蛋白质在变性条件下的分离 变性溶剂如变性溶剂如6mol/L盐酸胍盐酸胍、8mol/L脲脲、0.1%十二烷基硫酸钠十二烷基硫酸钠(SDS)等有助于精确地确定蛋白等有助于精确地确定蛋白质的分子量。质的分子量。 在变性溶剂中，柱的分离范围因此而移到在变性溶剂中，柱的分离范围因此而移到低分子量范围内。低分子量范围内。示例：用高效凝胶过滤色谱法示

22、例：用高效凝胶过滤色谱法(HPGFC)测定重组测定重组人肿瘤坏死因子人肿瘤坏死因子(rh-TNF)衍生物的相对分子量衍生物的相对分子量rh-TNF属基因工程药物，其相对分子量的测定属基因工程药物，其相对分子量的测定是该药质量控制的主要指标之一。是该药质量控制的主要指标之一。仪器与色谱条件：岛津仪器与色谱条件：岛津LC-10A HPLC色谱柱：色谱柱：Beckman Ultraspherogel SEC 3000(30cm7.5cm)流动相流动相 0.1mmol/L KH2PO4 :0.1mmol/L Na2SO4(1 : 1) + 0.05% NaN3流速流速: 1mL/min 检测波长检测波

23、长:280nm标准蛋白相对分子量曲线的制备标准蛋白相对分子量曲线的制备：选用四种蛋白：选用四种蛋白：醛缩酶醛缩酶、血清白蛋白血清白蛋白、碳酸酐碳酸酐酶酶及及抑蛋白酶肽抑蛋白酶肽制成的混合标样。考虑流速等制成的混合标样。考虑流速等因素对保留时间因素对保留时间T的影响而选用了的影响而选用了内标法内标法、既、既在混合标样中加入在混合标样中加入右旋糖酐蓝右旋糖酐蓝和和酪氨酸酪氨酸作为内作为内标，进样后可同时测的完全排阻和完全进入填标，进样后可同时测的完全排阻和完全进入填料孔的两种内标的保留时间料孔的两种内标的保留时间T0和和Tt，用分配系，用分配系数数Kd对相对分子量对数作图，从而保证结果有对相对分子

24、量对数作图，从而保证结果有良好的重现性。良好的重现性。Kd=T-T0/(Tt-T0)样品测定样品测定:根据样品的保留时间根据样品的保留时间T求出其分配系数求出其分配系数Kd，由，由Kd从标准蛋白相对分子质量曲线上查出相应的从标准蛋白相对分子质量曲线上查出相应的lgMr，计算相对分子质量。计算相对分子质量。第九节第九节 亲合色谱法亲合色谱法亲合色谱法是利用或模拟生物分子之间的专亲合色谱法是利用或模拟生物分子之间的专一性作用，从复杂生物样品中分离和分析特一性作用，从复杂生物样品中分离和分析特殊物质的一种色谱方法。殊物质的一种色谱方法。亲合色谱的概念可以理解为配位体以共价键亲合色谱的概念可以理解为配

25、位体以共价键形式与不溶性载体连接作为色谱介质，高选择形式与不溶性载体连接作为色谱介质，高选择性地吸附分离具有生物活性的物质，它将传统性地吸附分离具有生物活性的物质，它将传统亲合色谱的亲合色谱的专一性专一性与与HPLC的的快速快速，稳定稳定，检测检测方便方便等优点结合起来。等优点结合起来。一、亲合色谱分离机理一、亲合色谱分离机理亲合色谱是基于样品中各种物质与固定在载体亲合色谱是基于样品中各种物质与固定在载体的配基之间的亲合作用的差别而实现分离的。的配基之间的亲合作用的差别而实现分离的。亲合色谱的过程是待分离物质与配基间的亲合亲合色谱的过程是待分离物质与配基间的亲合复合物形成及其解离的过程。复合物

26、形成及其解离的过程。载体载体LX配基配基待分离物质待分离物质通过选择适当的流动相将结合在配基固定相的通过选择适当的流动相将结合在配基固定相的组分洗脱下来：组分洗脱下来：a) 如果亲合复合物的亲合力不强如果亲合复合物的亲合力不强b) 当配基与被分离组分的亲合力较强当配基与被分离组分的亲合力较强c) 非常紧密地结合在固定相配基上的物质洗脱非常紧密地结合在固定相配基上的物质洗脱配基与待分离物质的亲合作用的强弱可以用亲合配基与待分离物质的亲合作用的强弱可以用亲合复合物的结合常数来表示。这一常数不宜太低，复合物的结合常数来表示。这一常数不宜太低，也不宜太高。太低专一性太差，太高则洗脱困难。也不宜太高。太

27、低专一性太差，太高则洗脱困难。R = LKR R：结合在亲合色谱固定相上的生物分子的活力：结合在亲合色谱固定相上的生物分子的活力K K：复合物的离解常数：复合物的离解常数 L L：固定化配基的浓度：固定化配基的浓度二、亲合色谱的固定相二、亲合色谱的固定相亲合色谱作为液相色谱的一个重要分支，对于生亲合色谱作为液相色谱的一个重要分支，对于生物大分子的分离具有特殊的意义。原则上讲，如物大分子的分离具有特殊的意义。原则上讲，如果在固相载体上连接一种具有生物特异性的配基，果在固相载体上连接一种具有生物特异性的配基，就可以建立一种亲合色谱方法，用于分离与配基就可以建立一种亲合色谱方法，用于分离与配基相对应

28、的物质。相对应的物质。1 1、有机高分子类：多孔的硬质凝胶、有机高分子类：多孔的硬质凝胶交联聚交联聚苯乙烯，交联聚甲基丙烯酸酯，亲水性高聚性苯乙烯，交联聚甲基丙烯酸酯，亲水性高聚性等树脂。等树脂。优点优点具有均匀的粒度、较大的孔径、良好的刚性，具有均匀的粒度、较大的孔径、良好的刚性，广泛的广泛的PH值的适应性值的适应性对于生物大分子样品都有较好的相溶性。对于生物大分子样品都有较好的相溶性。填料容易合成填料容易合成2、无机基质、无机基质多孔硅胶多孔硅胶可控孔径玻璃可控孔径玻璃3、高效亲合色谱兼具亲合色谱和高效液相色谱、高效亲合色谱兼具亲合色谱和高效液相色谱的特点的特点可以提高效率，还可以改善回收

29、产物纯度和可以提高效率，还可以改善回收产物纯度和浓度浓度检测灵敏度得以大幅度提高检测灵敏度得以大幅度提高具有更高的选择性具有更高的选择性配基结合的牢固性也可以延长填料的寿命并配基结合的牢固性也可以延长填料的寿命并提高产物的质量，这对生物工程的分离、纯化提高产物的质量，这对生物工程的分离、纯化工作是非常有利。工作是非常有利。三、亲合色谱影响因素三、亲合色谱影响因素1、平衡和平衡缓冲溶液、平衡和平衡缓冲溶液选择平衡缓冲溶液所具有的选择平衡缓冲溶液所具有的PH值值，离子强度离子强度，温度温度和和化学组成化学组成都应使配体与蛋白质之间能发都应使配体与蛋白质之间能发生比较强的相互作用。生比较强的相互作用。2、蛋白质的浓度和温度效应、蛋白质的浓度和温度效应对亲合力一般或较高的蛋白质，其互补酶的浓对亲合力一般或较高的蛋白质，其互