基因工程原理第123章讲义

1、基因工程原理第一章 绪论（基因与基因工程概论）第一节 基因概念的发展1基因学说基因工程或称基因操作，是在分子生物学和分子遗传学等学科综合发展的基础上、于本世纪70年代诞生的一门崭新的生物技术学科。它的创立与发展，直接地依赖于基因分子生物学的进步，两者之间有密切而不可分割的内在联系。根据不同历史时期的水平和特点，基因研究大体上可分为三个不同的发展阶段：在上个世纪50年代以前，主要是细胞染色体水平上进行研究，属于基因的染色体遗传学阶段；50年代之后，则主要从DNA大分子水平上进行研究，属于基因的分子生物学阶段；最近30多年，由于重组DNA技术的完善和应用，人们已经改变了从表型到基因型的传统研究基因

2、的途径，而能够直接从克隆目的基因出发，研究基因的功能及其表型间的关系，使基因的研究进入反向生物学阶段。基因最初是遗传学概念，随着生物学科的不断发展及生命科学理论与技术研究的不断深入与完善，人们对基因本质的认识及其定义也在不断深化。很多先驱科学家及其开创性的科学研究为基因研究的发展建立了功不可没的丰功伟绩。1866年，奥地利遗传学家G. Mendel(孟德尔)根据豌豆杂交试验，首次提示了遗传学的基本规律，如分离定律和自由组合定律。阐明了遗传不是性状本身，而是决定性状的遗传因子。1909年，丹麦生物学家W. Johannsen根据希腊文“给予生命”之义，创造了基因(gene)一词，这一术语却一直沿

3、用至今，并发展为决定遗传性状的物质基础。1910年，美国著名遗传学家T.H. Morgan(摩尔根)和他的助手们以国蝇为材料，确认遗传物质的基础存在于染色体中并提出基因连锁和互换定律。第一次将代表某一特定性状的基因同某一特定的染色体联系起来，创立了遗传的染色体理论。2DNA是遗传信息的载体1928年，F. Griffith首先发现了肺炎双球菌的转化现象。转化因子是什么？1944年，美国著名微生物学家O.T. Avery与他的合作者们重复了Griffith的转化实验，并进一步对无毒细菌变成有毒细菌的转化物质进行了分离和化学上的鉴定，证明使细菌性状发生转化的因子是DNA而不是蛋白质或RNA分子。A

4、very等人的工作在遗传学理论上树起了全新的观点，即DNA分子是遗传信息的载体。1952年，美国冷泉港卡内基遗传学实验室的科学家A.D. Hershey和他的学生用他们的噬菌体感染实验进一步肯定了Avery的结论。他们用放射性同位素35S和32P分别标记噬菌体的外壳蛋白质和核心DNA，用双标记的噬菌体感染大肠杆菌，结果表明噬菌体的蛋白外壳没有进入细菌体内，只有DNA进入到了细菌细胞中，进一步证实了遗传物质是DNA，而不是蛋白质。证明了DNA是遗传物质和基因的载体之后，遗传学家和分子生物学家进而着手研究维系生命现象的基础DNA分子的自我复制的过程，以揭示遗传信息是如何从亲代准确地传递到子代的本质

5、。1953年，J. Watson和F. Crick的DNA双螺旋结构模型成为解密DNA分子的复制过程的钥匙，特别是DNA半保留复制规律的揭示使遗传学家长期感到困惑的基因自我复制问题得到了最后的解决，也为基因存在于DNA，遗传信息可以通过DNA的半保留复制而传代下去的认识提供了基础。至此，基因以一种真正的分子物质呈现在人们面前，科学家能够像研究其它大分子一样，客观地探索基因的结构及功能，从分子层次上研究基因的遗传现象，进入了基因的分子生物学新时代。基因在DNA顺序上的多样性：（1）基因的不连续性；（2）基因的重叠性；（3）重复序列(repeated sequence)。3基因及其产物最初基因的功

6、能是如何同蛋白质联系在一起的呢？早在1902年，A. Garrod在研究人类黑尿病(alkaptonurea)时指出：这种病是由于缺乏某种酶催化代谢反应所致。这是最早把基因的功能同蛋白质的作用联系在一起。但是，第一次明确提出“一个基因一种酶”假说的学者则是G.W. Beadle和E.L. Tatum。直到1957年，英国剑桥的科学家V.M. Ingram对镰形细胞贫血症(sickle cell anemia)的血红蛋白和正常的血红蛋白的氨基酸序列作了对比研究，才第一次用实验证实了基因同蛋白质之间的直接联系。1958年，F. Crick在综合分析了50年代末期关于遗传信息流向的各种研究结果的基础

7、上，提出了描述DNA、RNA和蛋白质三者关系的中心法则(central dogma)。1970年，H.M. Temin和D. Baltimore发现一些RNA病毒在寄主细胞中的复制过程是先以病毒的RNA分子为模板，在反转录酶的作用下合成DNA互补链，然后以DNA链为模板合成新的病毒RNA。这说明遗传信息可以从RNA反向传递到DNA。为此，1971年，F. Crick修改了中心法则。当我们思考转录和转译这两个过程时会发现，转译和转录不同，它不是简单的核苷酸顺序的抄写，而是将RNA分子上的核苷酸语言翻译成蛋白质分子上的氨基酸语言的复杂过程，是涉及到两种不同语言信号之间的更换问题。在转译过程中，必定

8、存在着一种特殊的遗传密码系统，才可以将RNA分子上的核苷酸顺序，同蛋白质分子上的氨基酸顺序联系起来。在50年代末和60年代初，关于遗传密码的研究是基因分子生物学中最活跃的课题。到1961年底，有关遗传密码的若干主要问题都得到了解决。第一个问题是密码比，证实是由3个碱基编码一种氨基酸，我们称这种碱基三联体为密码子。第二个问题是密码是否重叠，结论是不重叠。第三个问题是相邻的2个三联体之间是否存在着“逗号”之类的分割符，碱基的缺失和增加突变研究表明，这种想法不符合事实。在解决了上述问题之后，剩下的就是要设法弄清每一种氨基酸到底是由哪一种三联密码子编码的。至1966年，所有64种密码子便全部破译出来了

9、。除了线粒体和叶绿体存在的个别特例外，所有生物，包括病毒、原核的和真核的，它们的密码子同氨基酸之间的关系都是同样的，因此说遗传密码是通用的。遗传密码的通用性是我们赖以开展基因工程的最重要的理论基础之一。第二节 基因工程1基因工程的诞生人们公认基因工程诞生于1973年。从40年代到70年代初基因工程的诞生，其中现代分子生物学领域理论上的三大发现及技术上的三大发明起了决定性的作用。（1）理论上的三大发现第一，40年代确定了遗传信息的携带者，即基因的分子载体是DNA而不是蛋白质，从而明确了遗传的物质基础问题。第二，在50年代揭示了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制机理，解决了基因的自我复制和传递

10、问题。第三，在50年代末期和60年代，相继提出了“中心法则”和操纵子学说，并成功地破译了遗传密码，从而阐明了遗传信息的流向和表达问题。（2）技术上的三大发明第一，DNA分子的体外切割与连接技术是基因工程诞生的第一个技术发明。应用核酸内切限制酶和DNA连接酶对DNA分子进行体外是切割和连接，这是在60年代末期和70年代初期发展起来的一项重要的基因操作技术，有人甚至说它是重组DNA的核心技术。1970年，H.O. Smith和K.W. Wilcox, T.J. Kelley从流感嗜血杆菌中分离并纯化了限制性核酸内切酶Hind II，使DNA分子的切割成为可能。1972年，H. Boyer实验室发现

11、了核酸内切酶EcoR I，识别GAATTC序列，切割DNA分子后形成具有粘性末端的片段，具有相同粘性末端的任何不同来源的DNA片段，都可以通过末端之间的碱基互补作用而彼此“粘合”起来。以后，又相继发现了大量类似于EcoR I这样的核酸内切酶，这就使研究者可以获得所需的DNA特殊片段，为基因工程提供了技术基础。对基因工程技术突破的另一发现是DNA连接酶。1967年，世界上有5个实验室几乎同时发现了DNA连接酶，这种酶能够参与DNA裂口的修复，而在一定条件下还能连接DNA分子的自由末端。连接的功能是通过合成相邻核苷酸之间的磷酸二酯键，从而修复缺口(nick)或单链的裂口(gap)。1970年，美国

12、威斯康星大学的H.G. Khorana实验室发现了一种具有更高连接活性的DNA连接酶T4DNA连接酶，有时甚至能够催化完全分离的两段DNA分子进行平末端的连接。第二，基因工程载体的使用是基因工程诞生的第二项技术发明。大多数DNA片段不具备自我复制的能力，为了能够在寄主细胞中进行繁殖，就必须将DNA片段连接到具备自我复制能力的DNA分子上。这种DNA分子就是所谓的基因克隆载体。根据当时（1972年前后）微生物遗传学的研究成果，有可能作基因克隆载体的有病毒、噬菌体和质粒等不同的小分子量的复制子。鉴于多年以来，分子生物学家一直把注意力集中在病毒同其寄主细菌之间的相互关系上，因此很自然地在一开始就选定

13、噬菌体作基因克隆最有希望的载体。其中研究得最为深入，而且业已被改建成实用克隆载体的是大肠杆菌l噬菌体载体。然而第一个将外源基因导入寄主的却不是l噬菌体，而是质粒载体。将外源DNA分子导入细菌细胞的现象叫转化，早在肺炎链球菌中发现，但对大肠杆菌却迟至1970年才获得成功。当时M. Mandel和A. Higa发现大肠杆菌的细胞经过氯化钙的适当处理，便能够吸收l噬菌体的DNA。两年后（1972年），斯坦福大学的S. Cohen等人报道，经氯化钙处理的大肠杆菌细胞同样也能够摄取质粒的DNA。从此，大肠杆菌便成了分子克隆的良好的转化受体。大肠杆菌转化体系的建立，对基因工程的创立具有特别重要的意义，因为

14、早期使用的克隆载体都是在大肠杆菌细胞中增殖的复制子。第三，DNA分子的核苷酸序列分析技术、琼脂糖凝胶电泳和Southern转移杂交等技术对基因工程的开展起到了促进的作用。1972年，美国斯坦福大学的P. Berg领导的研究小组，在世界上第一次成功地实现了DNA体外重组，并因此与W. Gilbert, F. Sanger分享了1980年度的诺贝尔化学奖。他们用核酸内切限制酶EcoR I，在体外对猿猴病毒SV40的DNA和l噬菌体的DNA分别进行酶切，然后再用T4DNA连接酶将两种消化片段连接起来，结果获得了包括SV40和l噬菌体DNA的重组的杂种DNA分子。1973年，斯坦福大学的S. Cohe

15、n等人也成功地进行了另一个体外DNA重组实验并实现了细菌间性状的转移。他们将大肠杆菌的抗四环素质粒pSC101和抗卡那霉素质粒R6-5，在体外用EcoR I酶切后，用T4DNA连接酶将它们连接成重组的DNA分子。连接混合物转化大肠杆菌，结果在含四环素和卡那霉素的平板中，选出了双抗的重组菌落。这种双抗性的大肠杆菌转化子细胞中分离出来的重组质粒DNA带有完整的pSC101分子和来自R6-5质粒编码卡那霉素抗性基因的DNA片段。这是基因工程发展史上第一次实现重组转化成功的例子。基因工程从此诞生，这年被定为基因工程诞生的元年。S. Cohen与H. Boyer合作，用类似的方法把非洲爪蟾的编码核糖体基

16、因的DNA片段同pSC101重组后导入大肠杆菌。转化子分析结果表明，动物的基因的确进入了大肠杆菌，并转录出相应的mRNA产物。Cohen的工作，是第一次成功的基因克隆实验，其重要意义在于：说明了像pSC101这样的质粒分子是可以作为基因克隆的载体，能够将外源的DNA导入寄主细胞；说明了像非洲爪蟾这样的真核动物的基因是可以被成功地转移到原核细胞中去，并实现其功能表达的；说明了质粒大肠杆菌细胞是一种成功的基因克隆体系，可以作为基因克隆的模式系统进行深入的研究。2基因工程的定义和主要研究内容基因工程是指在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其他载体分子，构成遗传物质的新组合，并使之掺入到原先没有这类分子的

17、寄主细胞内，而能持续稳定地繁殖的技术。供体、受体和载体称为基因工程的三大要素。基因工程有两个特征，第一个是它将外源DNA的新组合引入到一种新的寄主生物中进行繁殖。这种DNA的新组合就可以按照工程学的方法进行设计和操作，可以跨越天然物种的屏障，为定向创造新生物提供了可能性。第二个是，一种确定的DNA小片段能够在新寄主细胞中进行扩增。正是具备了这种特征，我们才能制备到大量纯化的DNA片段，从而拓宽了分子生物学的研究领域。基因工程包括如下几个主要的内容或步骤（简称六字方针）：分、切、接、转、筛和表。（1）分：从复杂的生物有机体基因组中，分离出带有目的基因的DNA片段。（2）切：在体外，用限制性内切核

18、酸酶切割目的基因和基因载体，以利于将两者连接形成重组体。（3）接：在体外，将带有目的基因的外源DNA片段连接到能够自我复制并具有选择记号的载体分子上，形成重组DNA分子。（4）转：将重组DNA分子转移到适当的受体细胞（亦称寄主细胞），并与之一起增殖。（5）筛：从大量的细胞繁殖群体中，筛选出获得了重组DNA分子的受体细胞克隆。进一步提取出已经得到扩增的目的基因，供进一步分析研究使用。（6）表：将目的基因克隆到表达载体上，导入寄主细胞，使之在新的遗传背景下实现功能表达，产生出人类想要的物质。从基因工程定义上来讲，以上6个步骤已包括了这项技术的完整过程，但是，从基因工程的最终目的来讲，以上6个步骤还

19、不是它的全部内容，因为一个基因工程产品的完成至少还涉及到表达产物的纯化、复性、规模化生产工艺等内容的探索。因此，人们习惯把以上6个步骤称作是基因工程的上游研究。而下游技术则涉及到含有重组外源基因的生物细胞的大规模培养以及外源基因表达产物的分离纯化过程。上游DNA重组的设计必须以简化下游操作工艺和装备为指导思想，而下游过程则是上游基因重组蓝图的体现与保证，这是基因工程产业化的基本原则。基因工程的理论依据：（1）不同基因具有相同的物质基础。（2）基因是可切割的。（3）基因是可以转移的。（4）多肽和基因之间存在对应关系。（5）遗传密码是通用的。（6）基因可以通过复制把遗传信息传递给下一代。3基因工程

20、的应用与发展关于基因组核苷酸全序列的测定和分析，是重组DNA技术促进基础生物学研究的一个很好的范例。1977年，英国分子生物学家F. Sanger领导的研究小组首先完成了全长5387bp的fX174噬菌体基因组全序列测定工作，揭开了大规模基因组测序工作的序幕。80年代末期，日本科学家先后于1987年完成了全长155.844bp的烟草叶绿体，1988年完成了全长121.024bp的地钱叶绿体，1989年又完成了全长134.525bp的水稻叶绿体基因组全序列的测定。然而这些细胞器无论在大小上还是在复杂性方面，都无法同人类基因组相比拟。人类染色体基因组（在单倍体的情况下）全长3*109bp，编码近1

21、05个基因。如果考虑到经过千百万年的分化与繁衍，今天全世界已有50多亿人口，人类基因之正常和异常的突变形式更是千百倍于基因的基本数目。由此可见，人类基因组的全序列测定工作是一项何等艰巨而庞大的工程。1984年美国科学家首先提出研究人类基因组的设想，在经过长达4年的广泛调查和反复论证的基础上，1988年美国国会终于批准了人类基因组作图和测序计划（简称人类基因组计划），开始了令全世界瞩目的人类基因组研究。这一项被新闻界喻为“基因圣战”的规模空前的科研计划，预计投资30亿美元，将历时15年才可以完成。我国于1999年9月也获准参与这一国际性计划，在北京和上海分别成立了人类基因组研究中心，承担人类基因

22、组1%的测序任务。直到2000年6月，才宣告人类基因组计划DNA测序草图完成，同时已破译了近万个基因。一般认为人类基因组含有数万个基因，各司其职，控制着人的生长、发育、繁殖，一旦人类基因组全部被破译，就可以了解人类几千种遗传性疾病的病因，为基因治疗提供可靠的依据，并且将保证人类的优生优育，提高人类的生活质量。在人类基因组计划的影响下，以稻米为主食的我国自1992年开始执行的水稻基因组作图和测序计划也已取得良好的进展。1997年成功地构建了高分辨率的水稻基因组物理图谱，使我国的水稻基因组研究工作继续保持世界领先的水平。并于2001年10月12日，中国科学院、国家计委、科技部联合召开新闻发布会，宣

23、布具有国际领先水平的中国水稻（籼稻）基因组“工作框架图”和数据库在我国已经完成。这一成果标志着我国已成为继美国之后，世界上第二个能够独立完成大规模全基因组测序和组装分析能力的国家。籼稻全基因组“工作框架图”的完成，将带动小麦、玉米等所有粮食作物的基础与应用研究。早在基因工程发展的初期，人们就开始探讨将该技术应用于大规模生产与人类健康水平密切相关的生物大分子，这些物质在人体内含量极小，但却具有非常重要的生理功能。1977年，加州大学（Keiichi Itakura和Herber Boyer）首次在大肠杆菌中表达了人的生长激素释放抑制素基因，1978年，克隆表达了人的胰岛素基因，同年美国Genen

24、tech公司开发出利用重组大肠杆菌合成人胰岛素的先进工艺，从而揭开了基因工程产业化的序幕。利用基因工程技术开发新型治疗药物是当前最活跃和发展最快的领域。基因工程药物主要指基因工程活性多肽、基因工程疫苗和DNA药物等。一些人体活性多肽（如激素、神经多肽、淋巴因子、凝血因子等）在疾病诊断、预防和治疗中具有重要的价值，但是以往只能用传统的技术从动物中提取，由于原料来源有限，不同批次质量不一，有的还有较大的毒副作用，所以临床应用受到很大限制。基因工程问世后，首先用此技术在生产人体活性多肽方面显示了威力，编码人体活性多肽的基因通过重组转化，获得了能高效表达的工程菌株，可大批量生产人们需要的人体活性多肽。

25、至2000年统计，应用基因工程技术生产和上市的人体活性多肽有：人生长激素、a-干扰素、白细胞介素-2、生长因子、肿瘤坏死因子、凝血因子、人粒细胞集落刺激因子、促红细胞生成素、组织非蛋白纤溶酶原、胰岛素和心钠素等。原来使用的疫苗主要是由被杀死或减毒的病原微生物组成，或者由细菌毒素组成。由于在制备过程中因减毒不充分或培养病毒出现问题，有的疫苗具有不良反应。利用基因工程技术，获得了一系列无毒性作用的新疫苗。细菌方面有霍乱弧菌、百日咳杆菌、麻风杆菌、淋球菌、绿脓杆菌、脑膜炎双球菌、链球菌、志贺菌属某些菌种等的疫苗；病毒方面有流感病毒、人免疫缺陷病毒、甲肝病毒、乙肝病毒、带状疱疹病毒和巨细胞病毒等的疫苗

26、；寄生虫方面有疟原虫、丝虫、血吸虫、利值曼原虫等疫苗。此外，不少科技工作者正在开展癌症和爱滋病等顽症疫苗的研制工作。近年来在基因工程疫苗研究领域，转基因植物疫苗异军突起，将抗原基因导入植物，让其在植物中表达，人或动物摄入这种植物或其中的抗原蛋白质，以产生对某抗原的免疫应答。乙肝病毒表面抗原基因和大肠杆菌肠毒素基因等已导入马铃薯中表达，用这样的薯快喂小鼠，均产生了免疫应答。为了获得人可以生吃的能产生疫苗的植物，1995年以来，开展了以番茄和香蕉生产口服食品疫苗的研究，番茄中已表达了狂犬病毒糖蛋白和天花病毒表面抗原。有些抗原基因在香蕉中也表达成功。由于口服食品疫苗具有成本低、保持自然状态免疫原性和

27、使用方便安全等优点，将会迅速发展起来。用作DNA药物有腺苷脱氨酶基因、白介素基因和淋巴细胞因子基因以及反义寡核苷酸药物等。随着人类基因组研究的深入，由于提供大量的遗传信息，必将大大加速DNA药物的迅速发展。生产基因工程药物，早期采用转基因微生物发酵或转基因动物细胞培养，从中提取有效成分，近年来发展了用转基因动物的乳腺生物反应器来生产基因工程药物。至今在以下转基因动物的乳汁中获得了一些人类活性多肽：牛奶中有抗凝血酶、纤维蛋白原、人血清蛋白、胶原蛋白、生育激素、糖基转移酶、蛋白质C等，山羊奶中有抗凝血酶原、抗胰蛋白酶生育激素、血清白蛋白、组织型溶纤维原激活因子、单克隆抗体，绵羊奶中有抗胰蛋白酶、凝

28、血因子IX、纤维蛋白原、蛋白质C，猪奶中有蛋白质C、凝血因子IX、纤维蛋白原、血红蛋白。此外，正在研究含基因工程药物的绿藻和蓝藻，不必提取就可服用。从80年代以来，基因工程已开始朝着高等动植物物种的遗传特征改良以及人体基因治疗等方向发展。转基因植物研究方面，1983年利用农杆菌介导法培育出世界上第一例转基因植物转基因烟草。如今，利用基因工程技术，将一些具有实用价值的外源基因分别导入多种作物，获得了一批转基因植物。如培育成功了一批分别具有抗病（包括病毒病：烟草花叶病毒、细菌和真菌病：小麦的白粉病、赤霉病、黄矮病）、抗虫（应用最广的是苏云金芽孢杆菌的Bt杀虫晶体蛋白基因和豇豆等作物的胰蛋白酶抑制基

29、因：转基因棉花：抗田菜夜蛾、棉铃虫，转基因烟草对烟草文蛾的抗性可达死亡率100%；转基因玉米对玉米螟也具有明显抗性）和抗除草剂性状的转基因农作物。另外在作物抗旱、抗寒、抗热和抗盐方面都有研究进展。在改善作物品质方面，尝试改变植物中氨基酸组成和含量，提高作物的营养价值。如将豆科植物的贮藏蛋白基因转入牧草，奶牛吃了以后，牛奶中含有较多的人体必须氨基酸，转入谷类作物，获得了氨基酸组成更适合人体需要的转基因作物。此外还有抗腐烂的番茄和柿子等。转基因动物研究方面，早在1980年首次通过显微注射培育出世界上第一个转基因动物转基因小鼠，由于动物不像植物那样容易通过体细胞培养再生新的个体，所以对转基因动物的研

30、究远不如转基因植物那样广泛，主要集中在改良家畜、家禽和鱼的经济性状，以及生产某些药物和蛋白质。如将牛的基因导入猪体内，猪不仅生长快，个体大，而且瘦肉率高，饲料的利用率高，给养猪业带来丰厚的经济效益。近年来，成功地将人的基因导入猪体内，可望能解决动物器官移植到人体后的异体排斥问题。转基因动物生产活性多肽和药物等上面已经介绍。克隆羊“多莉”的问世，证实高等动物体细胞同植物细胞一样具有全能性，在合适的培养条件下，一个体细胞同样可以再生成新的个体。基因工程也有力地促进了医学科学的研究，这方面的重要突破是发现了致癌基因，弄清了肿瘤的起因。随着医学和分子遗传学研究的不断进步，人们逐渐认识到，遗传病其实只是

31、基因突变综合症（分子病）中的一类，目前一些严重威胁人类健康的所谓“文明病”或“富贵病”，如心脑血管病、糖尿病、癌症、过度肥胖综合症、老年性痴呆症、骨质疏松症等等，都属分子病范畴，分子病治疗有两种：一是定期向患者体内输入病变基因的原始产物，以对抗病变基因造成的危害；二是利用基因转移技术更换病变基因，达到标本兼治的目的。基因疗法实施的前提条件是对人类病变基因的精确认识，随着人类基因组测序草图的完成，揭示人体125000个基因的全部奥秘具有极大的诱惑力。基因芯片在临床的应用对于遗传病等诊断和早期防治方面都显示了巨大的价值。基因工程还在酶制剂工业、食品工业、化学和能源工业及环境保护等方面也有其用武之地

32、。4基因工程的安全性问题自基因工程诞生之日起，基因工程的安全性问题就受到人们极大的关注。关于重组DNA潜在的危险性问题的讨论，在基因工程还处于酝酿阶段时就已经开始了。争论的焦点是担心基因工程的杂种生物会从实验室逸出，在自然界造成难以控制的危害。有趣的是，首先产生这种担心的却是直接从事DNA重组研究的科学工作者，1972年，美国斯坦福大学的P. Berg首次实现了在体外将猿猴病毒SV40的DNA和l噬菌体的DNA连接成功，就是出于安全性方面的考虑，他主动放弃了将重组基因转入大肠杆菌细胞的想法。美国的公众也公开表示，担心重组DNA技术会培养出具有潜在危险性的新型微生物，而给人类带来难以预料的后果。

33、而且几乎所有的报刊杂志都在发表大量的争论文章和政府及科学团体的报告，担忧和反对开展重组DNA研究。在这种背景下，美国国家卫生研究院举行了一次有160名来自美国和16个国家有关专家学者参加的国际会议。对重组DNA的潜在危险性展开了针锋相对的辩论，最后总算在如下三个重要问题上取得了一致的看法：第一，新发展的基因工程技术，为解决一些重要的生物学和医学问题，以及令人普遍关注的社会问题（如环境污染、食品和能源问题）展现了乐观的前景；第二，新组成的重组DNA生物体的意外扩散，可能会出现不同程度的潜在危险，因此，开展这方面的研究要采取严格的防范措施，并建议在严格控制的条件下，进行必要的DNA重组实验，来探讨

34、这种潜在危险性的实际程度；第三，目前进行的实验，即使采取最严格的控制措施，其潜在的危险性仍然极大。因此，会议要求制订一份统一管理重组DNA研究的实验准则，并要求尽快发展出不会逃逸出实验室的安全寄主细菌和质粒载体。1976年6月23日，美国国家卫生研究院（NIH）在会议的基础上制订并正式公布了“重组DNA研究准则”。除了规定禁止若干类型的重组DNA实验以外，还制订了许多具体的规定条文。如明确规定了物理防护和生物防护两个方面的统一标准。由于该准则过于严格，甚至过于脱离实际，再加上一直没有发生重组DNA危险事件，以后NIH对“安全准则”作了多次修改，放宽了许多限制。就目前的情况看，只要重组DNA的实

35、验规模不大，不向自然界传播，实际上已经不受任何法则限制了。当然，这在任何意义上讲，都不是说重组DNA研究已不具有潜在的危险性了。相反地，作为负责的科学工作者，坚持不懈地保持防护意识仍然是十分必要的，对此应保持清醒的认识。第二章 基因克隆载体基因克隆载体是指用来进行基因克隆、cDNA克隆或亚克隆的DNA分子，是将外源DNA携带进入宿主细胞并进行复制的工具。绝大多数分子克隆实验所使用的载体是DNA双链分子，其功能是： （1） 为外源基因提供进入受体细胞的转移能力。（2） 外源基因提供在受体细胞中的复制能力或整合能力。（3）为外源基因提供在受体细胞中的扩增和表达能力。上述三大功能并非所有的载体分子都

36、必需具备，DNA重组克隆的目的不同，对载体分子的性能要求也不同。一个理想的载体至少应具备以下几个条件：（1）能自我复制并能带动插入的外源基因一起复制。（2）具有合适的限制性内切酶位点。在载体上单一的限制性内切酶位点越多越好，这样可以将不同限制性内切酶切割后的外源DNA片段方便地插入载体。（3）具有合适的筛选标记，如抗药性基因等。（4）在细胞内拷贝数要多，这样才能使外源基因得以扩增。（5）载体的相对分子质量要小，这样可以容纳较大的外源DNA插入片段。载体的相对分子质量太大将影响重组体或载体本身的转化效率。（6）在细胞内稳定性高，这样可以保证重组体稳定传代而不易丢失。载体在基因工程中占有十分重要的

37、地位。目的基因能否有效转入受体细胞，并在其中维持和高效表达，在很大程度上取决于载体。第一节 质粒载体质粒载体是以细菌质粒的各种元件为基础组建而成的基因工程载体。细菌质粒是存在于细胞质中的一类独立于染色体的自主复制的共价、闭合、环状双链DNA分子，其大小通常在1-500 kb范围内。质粒并不是细菌生长所必需的，但赋予细菌某些抵御外界环境因素不利影响的能力，如抗菌素的抗性、重金属离子的抗性、细菌毒素的分泌以及复杂化合物的降解等。1 质粒的基本特征野生型质粒具有下列基本特征：1）自主复制性：质粒DNA含有自己的复制起始位点（Origin，简称ori）以及控制复制频率的调控基因，有些质粒还携带特定的复

38、制因子编码基因，形成一个独立的复制子结构。2）可扩增性：在革兰氏阴性细菌中，质粒的复制一般有两种形式，即严紧型复制和松弛型复制。严紧型质粒在宿主细菌的正常生长过程中，每个细胞通常只能复制少数几个拷贝；而松弛型质粒当宿主细胞内蛋白质合成减弱或完全中断时，质粒复制仍能持续进行，因此这类质粒在每个宿主细胞中通常具有较高的拷贝数（3050）。作为一种极端的情况，当宿主细胞进入生长后期，加入氯霉素（终浓度为10170ug/ml）抑制蛋白质的生物合成，阻断宿主菌的大部分代谢途径，则松弛型质粒利用丰富的原料及能量大量复制，最终每个细胞可以积累上千个DNA分子，这种操作称为质粒的氯霉素扩增。3）可转移性：部分

39、质粒含有tra基因，指令宿主细胞产生菌毛，合成细胞表面物质，促使宿主细胞与受体细胞接合，导致遗传物质从一个细胞转移到另一细胞中。含tra基因的质粒称为接合质粒。一般说来，这类质粒的分子量比较大，拷贝数比较少，并且宿主广，比较不安全。用于构建克隆载体的质粒一般是非接合质粒，虽不含有tra基因，但是有bom位点（oriT位点）和mob基因，当宿主细胞同时存在含有mob基因的质粒和接合质粒时，mob基因产物可打开非接合质粒的oriT位点，借助于接合质粒tra基因的产物，使非接合质粒被动迁移到受体细胞中，这种现象称为迁移作用。4）不相容性：具有相同或相似复制子结构及特征的两种不同的质粒不能稳定地存在于

40、同一受体细胞内，这种现象称为质粒的不相容性。2构建理想质粒载体必须具备的条件1）质粒拷贝数较高：质粒拷贝数是指生长在标准的培养基条件下,每个细菌细胞中所含有的质粒DNA分子的数目。2）分子量较小：一般说来，分子量低的通常拷贝数较高，克隆时所预期的基因产物的数量较大，质粒的限制性酶的切点相应减少，有可能找到合适的单一限制性酶切位点，外源DNA容量较大，且转化效率高，当质粒大于15 kb时，将成为转化效率的制约因素。另外，小分子量质粒在进行遗传工程操作时容易掌握，容易分离，不易断裂。3）带有可供选择的标记：常采用的标记是对某种抗生素的抗性，如氨苄青霉素抗性(Ampr)、卡那霉素抗性(Kanr)、四

41、环素抗性(Tetr)等，而且希望各抗性基因内有若干单一限制酶切点。在克隆时通过单一酶切点插入外源基因，使该抗性基因失活、宿主菌变为对该抗生素敏感的菌株，这样极易检查到克隆是否成功。还可利用-半乳糖苷酶筛选系统来选择。载体上带有一个来自大肠杆菌的lac操纵子的DNA区段，这一区段编码-半乳糖苷酶氨基端的一个蛋白片段。IPTG(异丙基-D-硫代半乳糖苷)可以诱导该片段的合成，而该片段能与宿主细胞所编码的-半乳糖苷酶羧基端的一个蛋白片段互补(互补)。故暴露于诱导物IPTG的细菌含有编码lacZ基因的质粒可同时合成该酶的两种片段，该菌在含生色底物X-ga1(5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷)的培

42、养基上生长，将形成蓝色菌落。在麦康凯培养基上利用乳糖产酸生成红色菌落。将多克隆位点克隆入-半乳糖苷酶氨基端的基因中，外源DNA插人质粒的多克隆位点后可使-半乳糖苷酶氨基端片段灭活，从而破坏了互补作用。带有重组质粒的细菌将产生白色菌落。利用这种筛选方法可方便地将含目的基因的重组子筛选出来。4）带有尽可能多的单一限制性酶切位点：单一的限制性酶切位点可供外源DNA定点插人；较多不同的单一限制酶酶切位点可有选择地供带有不同末端的外源基因插入。目前常用载体上的多克隆位点(MCS)即具有该功能。5）具有复制起始点：这是质粒自我增殖所必不可少的基本条件，也是决定质粒拷贝数的重要元件，可使繁殖后的细胞维持一定

43、数量的质粒拷贝数。一般情况下,一个质粒只含有一个复制起始点，构成一个独立的复制子。但穿梭质粒含有两个复制子，以确保其在两类细胞中均能得到扩增。3质粒载体的改造与构建外源基因克隆的目的不同，对质粒载体的性能要求也不同。野生型质粒存在着这样或那样的缺陷，不能满足需要，必须对之进行修饰和改造，其指导思想是：1）删除不必要的DNA区域，尽量缩小质粒的分子量，以提高外源DNA片段的装载量。2）灭活某些质粒的编码基因，如促进质粒在细菌种间转移的mob基因，杜绝重组质粒扩散污染环境，保证DNA重组实验的安全，同时灭活那些对质粒复制产生负调控效应的基因，提高质粒的拷贝数。3）加入易于识别的选择标记基因，最好是

44、双重或多重标记，便于检测含有重组质粒的受体细胞。4）在选择性标记基因内引入具有多种限制性内切酶识别及切割位点的DNA序列，即多克隆接头，便于多种外源基因的重组，同时删除重复的酶切位点，使其单一化，以便环状质粒分子经酶处理后，只在一处断裂,保证外源基因的准确插入。5）根据外源基因克隆的不同要求，分别加装特殊的基因表达调控元件。载体质粒的改造通常需要一系列体内体外的重组程序，可参见质粒pBR322及其衍生物的构建过程。4质粒的命名原则1976年提出了一种质粒命名的原则，用小写字母p代表质粒，在p字母后面用两个大写字母代表发现这一质粒的作者或实验室名称。如pUC19，UC是构建该质粒研究单位的名称（

45、University of California），19代表构建的一系列质粒的编号。5质粒的分类及用途人工构建的载体质粒根据其功能和用途可分为下列几类。1）克隆质粒。这类质粒常用于克隆和扩增外源基因。2）测序质粒。这类质粒通常高拷贝复制，并含有多种酶切口的接头片段，便于各种DNA 片段的克隆与扩增，在多酶切口接头片段的两端邻近区域，设有两个不同的引物序列，使得重组质粒经碱变性后，即可进行DNA测序反应。3）整合质粒。含有整合酶编码基因以及整合特异性的位点序列，克隆在这种质粒上的外源基因进入受体细胞后，能准确地重组整合在受体细胞染色体DNA的特定位点上。4）穿梭质粒。这类质粒分子上含有两个亲缘关

46、系不同的复制子结构以及相应的选择性标记基因，能在两种不同种属的受体细胞中复制并检测，如大肠杆菌-链霉菌穿梭质粒、大肠杆菌-酵母菌穿棱质粒等。5）探针质粒。这类载体被设计用来筛选克隆基因的表达调控元件，如启动子和终止子等。它通常装有一个可以定量检测其表达程度的报告基因(如抗生素的抗性基因)，但缺少相应的启动子或终止子，因此载体分子本身不能表达报告基因，只有当含有启动子或终止子的外源DNA片段插入到载体合适的位点上，报告基因才能表达，而且其表达量的大小直接反映了被克隆的基因表达控制元件的强弱。6）表达质粒。这类载体在多克隆位点的上游和下游分别装载转录效率较高的启动子、合适的核糖体结合位点(SD-序

47、列)以及强有力的终止子结构，使得克隆在合适位点上的任何外源基因均能在受体细胞中高效表达。6常用的质粒载体（一）克隆载体1）pSC101质粒pSC101质粒是一种严紧型复制控制的低拷贝数的大肠杆菌质粒载体，平均每个寄主细胞仅有l一2个拷贝。其分子大小为9.09kb，编码有一个四环素抗性基因。现已知道，该质粒对于EcoR、Hind III、BamH I、Sal、hol、Pvu II等几种核酸内切限制酶，都只具有单切割位点，其中在Hind III、BamH I和Sal等3个位点克隆外源DNA，都会导致四环素抗性基因失活。pSC101质粒具有可插入外源DNA的EcoR单克隆位点的优越性，而且不影响四环

48、素抗性的选择记号。它就被选用为第一个真核基因的克隆载体。但是这个质粒载体也有其明显的缺点，它是一种严紧型复制控制的低拷贝质粒，从寄主细胞中提取pSC101 DNA，其产量就要比通常使用的其它质粒载体低得多。2）ColEl质粒研究得最为详尽的Col类质粒是ColEl，ColEl质粒是属于松弛型复制控制的多拷贝的质粒，用它作基因克隆的载体，可以克服pSC101质粒载体的低拷贝、低产量的缺点。在正常的生长条件下，加入氯霉素扩增，每个寄主细胞中所累积的ColEl质粒拷贝数可达10003000个之多，此时质粒DNA大约可占细胞总DNA的50%左右。3）pBR322质粒载体 pBR322质粒载体是人工构建

49、的较为理想的大肠杆菌质粒载体。具有低分子量、高拷贝、两种抗生素抗性基因作为选择标记以及外源DNA插入不影响复制功能的多种限制性核酸内切酶单切割位点等优点。pBR322质粒载体来源于3个亲本质粒：质粒上的氨苄青霉素抗性基因来自于pSF2124，四环素抗性基因来自于pSC101，ColE松弛型复制子（ori）来自于pMB1。4）pUC系列多克隆位点(multiple cloning sites，MCS)技术的使用，极大地简化了质粒载体的改造过程。pUC载体就是以pBR322质粒载体为基础，在其5-端加入了一段带有多克隆位点的lacZ基因，而发展成为具有双功能检测特性的新型质粒载体系列。一种典型的p

50、UC系列的质粒载体，包括如下四个组成部分：（1）来自pBR322质粒的复制起点(ori)；（2）氨苄青霉素抗性基因，但它的DNA核苷酸序列已经发生了变化，不再含有原来的核酸内切限制酶的单识别位点；（3）大肠杆菌b-半乳糖苷酶基因(lacZ)的启动子及其编码该基因氨基端a-肽链的DNA序列，此结构特称为lacZ基因；（4）位于lacZ基因中的靠近5端的一段多克隆位点(MCS)区段，内含十几个单一的限制性内切酶识别切割位点，使含有不同粘端的目的DNA片段可方便地定向插入载体中。但它并不破坏该基因的功能。pUC质粒载体系列是目前基因工程研究中最通用的克隆载体之一，与pBR322载体相比pUC质粒载体

51、具有以下优点：（1）具有更小的分子量和更高的拷贝数。在pBR322载体基础上构建pUC质粒载体时，仅保留其中的氨苄青霉素抗性基因及复制起点，使其分子大小相应地缩小了许多。同时，pUC18质粒的拷贝数比带有pMBl或ColEl复制起点的质粒载体都要高得多，不经氯霉素扩增，平均每个细胞即可达500700个拷贝。（2）便于重组子的检测。pUC18质粒结构中具有来自大肠杆菌lac操纵子的lacZ基因，所编码的a-肽链可参与a-互补作用，用X-gal显色法一步实现对重组子克隆的鉴定。（3）具有多克隆位点(MCS)区段。正是由于具有MCS序列，可以使具两种不同粘性末端(如EcoR和BamH l)的外源DN

52、A片段，无需借助其它操作而直接克隆到pUC18质粒载体上。由于PCR产物的两端并非绝对平整，在绝大多数的产物分子的3端均突出一个碱基A，如果用平整末端的载体与其连接效率极低。因此，目前许多生物试剂公司推出PCR产物的专用克隆载体，包括pUC-T。它们的基本骨架与相应的载体系列基本相同，只是在线形化的质粒载体的平整末端的5端有一突出的碱基T，利用该特点，使载体与PCR产物之间产生了小的互补粘端，使PCR产物的克隆效率大幅度提高。（二）表达载体表达载体需要有一个强启动子及其两侧的调控序列；有SD序列且该序列与起始密码子ATG之间要有合适的距离；在克隆基因与启动子之间有正确的阅读框架；外源基因下游有

53、转录终止子等。pKK表达质粒载体：pKK质粒的启动子为Ptac。由大肠杆菌强启动子Ptrp和Plac杂合组成。pKK233-3表达载体含有Ptac启动子、lacE的RBS、pUC8的多克隆位点，在远端还有一个rrnB的转录终止信号。pET载体：对全世界许多研究者，Novagen的pET系统已成为在大肠杆菌中蛋白表达的首选。该系统成功的一个主要原因是目标基因被克隆到不为大肠杆菌RNA聚合酶识别的T7启动子之下，在加入T7 RNA聚合酶之前几乎没有表达发生。克隆到载体的目标基因是关闭的，不会因产生的蛋白对细胞有毒性而引起质粒的不稳定。重组质粒转移到染色体上含有一拷贝由lacUV5控制的T7 RNA

54、聚合酶基因的表达宿主中并通过加入IPTG诱导表达；也可通过ICE6感染原始克隆宿主菌来提供T7 RNA聚合酶。使用大肠杆菌启动子系统（如tac、lac、trc、pL）有困难的许多基因已在该系统稳定克隆和表达。T7 RNA聚合酶的选择性和活性使得几乎所有细胞资源都用于目标基因的表达，诱导后几小时目标基因产物就可超过细胞总蛋白的50。第二节 病毒（噬菌体）载体噬菌体(bacteriophage，简称phage)是一类细菌病毒的总称。其结构比质粒要复杂，噬菌体的DNA分子除了复制起点之外，还有编码外壳蛋白质的基因。噬菌体也可以用于克隆和扩增特定的DNA片段，是一种良好的基因克隆载体。噬菌体颗粒外壳是

55、蛋白质分子，内部的核酸一般是双链线性DNA分子，也有的是双链环形DNA、单链线性DNA、单链环形DNA及单链RNA等多种形式。噬菌体的感染效率极高，达到了令人生畏的地步。一个噬菌体颗粒感染了一个细菌细胞之后，便可迅速地形成数百个子代噬菌体颗粒，而每一个子代颗粒又能够各感染一个新的细菌细胞，再产生出数百个子代颗粒，如此只要重复4次感染周期，一个噬菌体颗粒便能够使数十亿个的细菌细胞致死。若是在琼脂平板上感染生长的细菌，释放出来的噬菌体便可以迅速地吸附到邻近的细菌细胞上，重复发生感染周期，这种细菌的裂解反应是以最初被感染的细胞所在的位置为中心，慢慢地向四周扩展，最后在琼脂平板上形成大量的噬菌斑，即感

56、染的细菌细胞被噬菌体裂解之后留下的空斑。噬菌体的生命周期分为溶菌周期和溶原周期两种不同的类型。溶菌周期是指噬菌体吸附到寄主细胞表面后，注入DNA，噬菌体DNA进行复制及蛋白质合成，并组装成子代噬菌体颗粒，最后使寄主细胞破裂，释放出子代噬菌体颗粒。我们将只具有溶菌生长周期的噬菌体叫做烈性噬菌体。溶原生长周期是指在感染过程中没有产生出子代噬菌体颗粒，噬菌体DNA整合到寄主细胞染色体DNA上，成为它的一个组成部分。温和噬菌体是既能进入溶菌生命周期又能进入溶原生命周期的噬菌体。溶原性细菌是具有一套完整的噬菌体基因组的细菌。用温和噬菌体感染细菌培养物使之形成溶原性细菌的过程，叫做溶原化。在溶原性细菌内存

57、在的整合或非整合的噬菌体DNA叫原噬菌体。整合是指噬菌体DNA已插入到寄主细菌染色体之中。以游离DNA分子形式存在的噬菌体DNA叫非整合噬菌体DNA。1l-双链DNA噬菌体载体 l噬菌体，可能是迄今为止研究得最为详尽的一种大肠杆菌双链DNA噬菌体。有关l噬菌体的研究历史，是同现代分子生物学及分子遗传学的创立与发展的过程密切相关的。大家所熟悉的DNA双向复制机理的揭示、转录的终止作用和抗终止作用蛋白质的分离、DNA连接酶和促旋酶的发现，以及位点特异的重组作用和SOS复制修复机理的阐明等等，都是以l噬菌体为材料做出的重要的研究成果。l噬菌体是一种中等大小的温和噬菌体。lDNA为线状双链分子，长度为

58、48502bp。迄今已经定位的l噬菌体的基因至少有61个，其中有一半左右参与了噬菌体生命周期的活动，我们称这类基因为l噬菌体的必要基因；另一部分基因，当它们被外源基因取代之后，并不影响噬菌体的生命功能，我们称这类基因为l噬菌体的非必要的基因。取代了非必要基因的外源基因可以随寄主细胞一道复制和增殖，这是l噬菌体赖以发展作为基因克隆载体的一种重要特性。lDNA两端具有由12个核苷酸组成的粘性末端（这种由粘性末端结合形成的双链区段称为cos位点），可用来构建柯斯质粒，这种质粒能容纳大片段的外源DNA插入，对构建真核基因组片段的基因文库是特别有用的载体。1）l DNA载体的构建 lDNA可通过噬菌体特异性感染高效进入宿主细胞或受体细胞，噬菌体空壳蛋白对lDNA的包装与其序列无关，以及l-DNA在大肠杆菌细胞中的高拷贝复制，这是l-DNA在分子克隆技术发展早期就被选作载体使用的原因。野生型的l-DNA本身存在着种种缺陷，必须对之进行多方面的改造，才能满足一个理想载体的要求，这些改造的内容包括如下几个方面：（1）缩短野生型l-DNA的长度，提高外源DNA片段的有效装载量。l-DNA的包装范围为l-DNA总长的75%105%，即（