为了确保引物和探针的特异性最好将设计好的序列在WWW

1、一、单重Taqman引物探针设计：（为了确保引物和探针的特异性，最好将设计好的序列在www.ncbi.nlm.nih/blast 中核实一次）1、探针：探针的设计应该在引物的设计之前 长度：1835（1830之间最好、最常见），最长37；太长淬灭效果不好。 TM值：Primer Express软件计算出来的Tm值在6672之间（最常见6870），最好为70，确保探针的Tm值要比引物的Tm值高出510，GC含量在3080%（最好40%70%），因此探针最好是富含GC的保守片段；（Primer Express：Do not expand the Tm range by more than 2 &#

2、176;C from the default range）。 探针位置：尽可能地靠近上游引物,上游引物的3' 端离探针的5' 端为1-20bp（一般10个以内），最好是探针的5'端离上游引物的3' 有1个碱基。 5'端应避免使用碱基G，5' G会有淬灭作用，即使被切割下来这种淬灭作用也还会存在；如果选择FAM-dye在5'端第二个序也能为G（G in the second position on the 5' end in FAM dye-labeled probes can reduce fluorescent normaliz

3、ed reporter signal）。 可选：整条探针中，碱基C的含量要明显高于G的含量，G的含量多于C会降低反应效率，这时就应选择配对的另一条链作为探针。要同时考虑在正反两条链上设计引物与探针。若找不到完全保守的片段，也只能选取有一个碱基不同的片段，且这个不同的碱基最好在探针的中间，且最好为A或T。 Repeating oligonucleotides：a. 避免探针中同一碱基重复过多，尤其是要避免4个或超过4个的G碱基出现，即3（Avoid runs of identical nucleotides. If repeats are present, there must be fewer

4、 than four consecutive G residues.）；b. 避免连续的6个A出现（Consecutive A residues：Avoid six consecutive A residues anywhere in the probe. Consecutive A residues can cause a high No Template Control (NTC) signal）；c. 避免探针的中间区域含有2个或以上的CC dinucleotides（Avoid two or more CC dinucleotides in the middle of the prob

5、e, which can sometimes reduce signal）。 检测探针的DNA折叠和二级结构（最大连续的碱基配对数=4：Maximum number of consecutive base pairings allowed in a primer=4；最大的总的碱基配对数=8：Maximum number of base pairings allowed in a primer=8）：a. 避免自身形成环状发卡结构（Hairpin Loops：If a DNA strand possesses a self-complementary sequence, it may form

6、 a secondary structure, often called a hairpin loop. When designing primers or probes, avoid regions that tend to form secondary structures. If secondary structures are present, primers or probes must compete against the complementary strand for binding to the target sequence, which reduces PCR effi

7、ciency.），b. 避免自身二聚体形成（Self-Dimers：Primers or probes that possess 3´ complementarity with themselves in the PCR reaction may form another type of nonspecific product, a self-dimer. Nonspecific product formation decreases the quantity of specific product produced and may add ambiguity to the PCR

8、results. The Primer Express® software calculates and eliminates from consideration most of the primers and probes that are self-complementary or possess strong self-dimer tendencies.），c. 避免交叉二聚体形成（Cross-Dimers：Primers or probes that possess 3´ complementarity with themselves or another pri

9、mer or probe in the PCR reaction may form another type of nonspecific product, a cross-dimer. Nonspecific product formation decreases the quantity of specific product produced and may add ambiguity to the PCR results. The Primer Express software® calculates and eliminates from consideration mos

10、t of the primers and probes that are self-complementary or possess strong dimer tendencies.）。 可选：3' 端的淬灭基团也可以标记在探针的内部核酸上。5' 端染料最好连接在T或C碱基上。 可选：探针应高度纯化（HPLC）；探针储存液应为100um浓度，工作液为10um浓度并分装25ul/份。 反应体系中探针浓度的优化主要依靠背景信号强度、探针与靶的结合效率、PCR扩增的效率、引物的浓度等进行优化。一般探针浓度在0.10.4uM范围内进行优化。若用新合成的探针进行优化时，一般从0.2uM开

11、始对探针进行优化。目的是既使背景荧光最小化，又没有降低实验的敏感性，从而得到最佳实验结果。Smart cycler II的荧光背景信号应低于500个荧光单位，若高于500，说明探针的商家对探针的纯化不好，或探针加的太多，或探针降解。2、引物：在探针确定以后再选择引物 长度：1830（1825之间最好、最常见），最长35，最佳20bp；两条引物长度相差最好不超过4bp（Tm of both primers should be close to each other to easily achieve an optimal annealing temperature）。 TM值：Primer Ex

12、press软件计算出来的Tm值在5662（最常见5860，这非常重要，因为我们的试验一般都使用退火温度为60，在这个温度下，5' 核酸外切酶的活性最高），最佳59，GC含量在3080%（最好40%60%）；上下游引物之间的Tm相差避免超过2，最好相差0.5以内。（Primer Express：Do not expand the Tm range by more than 2 °C from the default range）。 Repeating oligonucleotides：避免同一碱基重复过多，特别是G，不可超过4个及以上，即3（Avoid runs of iden

13、tical nucleotides. If repeats are present, there must be fewer than four consecutive G residues.）。 3' end：引物的3' 端最好不为GC（即：Primer 3' GC Clamp Residues=0，以免错误引发）；3' 端的5个碱基中G+C碱基的总数不能超过2个（Make sure the last five nucleotides at the 3' end contain no more than two G + C residues）。可选：3

14、' 端避免使用碱基A；3' 端避免出现3个或3个以上连续相同的碱基。 引物DNA折叠和二级结构（最大连续的碱基配对数=4：Maximum number of consecutive base pairings allowed in a primer=4；最大的总的碱基配对数=8：Maximum number of base pairings allowed in a primer=8）：a. 避免引物自身形成环状发卡结构（Hairpin Loops：If a DNA strand possesses a self-complementary sequence, it may f

15、orm a secondary structure, often called a hairpin loop. When designing primers or probes, avoid regions that tend to form secondary structures. If secondary structures are present, primers or probes must compete against the complementary strand for binding to the target sequence, which reduces PCR e

16、fficiency），b. 避免引物自身二聚体形成（Self-Dimers：Primers or probes that possess 3´ complementarity with themselves in the PCR reaction may form another type of nonspecific product, a self-dimer. Nonspecific product formation decreases the quantity of specific product produced and may add ambiguity to the

17、PCR results. The Primer Express® software calculates and eliminates from consideration most of the primers and probes that are self-complementary or possess strong self-dimer tendencies.），c. 避免交叉二聚体形成（Cross-Dimers：Primers or probes that possess 3´ complementarity with themselves or another

18、 primer or probe in the PCR reaction may form another type of nonspecific product, a cross-dimer. Nonspecific product formation decreases the quantity of specific product produced and may add ambiguity to the PCR results. The Primer Express software® calculates and eliminates from consideration

19、 most of the primers and probes that are self-complementary or possess strong dimer tendencies.）。注意：引物二聚体绝对值超过4.5kcal/mol易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行)；不必考虑引物与探针之间的配对与发夹结构，因为探针的Tm值非常之高。 最好能够设计多对引物与设计好的探针相匹配，来测试哪对引物最适合。选择能够给出最低Ct值，但是却能给出最高反应终点荧光值的引物。 引物浓度可以在0.1uM1.0uM范围能进行优化，最佳的引物浓度是0.2uM0.5uM3

20、、扩增子：Primer Express：Do not set higher than 300 base pairs 50200（70150之间最常用，这个范围有最佳的扩增效率），最长不可超过300。扩增片段越短，有效的扩增反应就越轻易获得，较短的扩增片断也轻易保证分析的一致性。 扩增子GC含量在4055%最好。 扩增值最大Tm值85。二、多重Taqman引物探针设计（用一样的引物和探针设计原则设计）： 1、探针： 除单重应注意的问题外，多重实时PCR的荧光探针应为同一类型，如同时为Taqman 探针：CY5-BHQ3，Texas Red-BHQ2，FAM-BHQ1。 探针之间不能互相干扰。2、引物： 除单重应注意的问题外，不同靶引物对之间Tm值要接近，差控制在5以内；引物长度最好在2025bp之间。 引物之间不能互相干扰，引物二聚体也要避免。 每对引物的靶序列是保守的、唯一的。 每对引物的浓度要调整，以使每个扩增子的指数增长期的扩增率相同。 3、