第五章 亲和层析分离技术

1、第五章 亲和层析技术北京化工大学北京化工大学 谭天伟教授谭天伟教授亲和层析技术5.1 简介5.2 亲和层析理论5.3 亲和层析介质活化5.4 常见底亲和层析技术 利用生物大分子之间的专一性识别性或特定的利用生物大分子之间的专一性识别性或特定的相互作用的分离技术称为亲和层析分离技术相互作用的分离技术称为亲和层析分离技术5.1 简介简介简介亲和配基 单专一性的小分子配基 基团专一性小分子亲和配基 专一性的大分子亲和配基 免疫亲和配基 基因专一性的大分子亲和配基参数生物专一性（AC）拟生物专一性配基亲和层析IMACDLACHLAC专一性很高很高较高较高中等中等较高，较高，取决于吸附条件取决于吸附条件

2、配基交联技术很多很多环氧化物环氧化物直接吸附或直接吸附或对氧化物对氧化物解吸难易中等中等容易容易化学化学交联容易交联容易容易容易吸附容量低，低，0.1-1.0%0.1-1.0%配配基利用基利用高高高高中等中等再生及稳定性较差，易变性较差，易变性高高高高高，可用浓或处理高，可用浓或处理成本高高较低较低最低最低较低较低不同亲和层析分离方法的比较简介亲和洗脱 亲和洗脱是和亲和吸附亲和洗脱是和亲和吸附（Affinity Adsorption）对应的，对应的，即利用在洗脱液中加入和吸附目标蛋白有专一性的物质，即利用在洗脱液中加入和吸附目标蛋白有专一性的物质，而只将目标分子解吸下来。亲和洗脱可用于亲和层吸

3、，也而只将目标分子解吸下来。亲和洗脱可用于亲和层吸，也可以用于普通的层析如离子交换等的解吸。亲和洗脱一般可以用于普通的层析如离子交换等的解吸。亲和洗脱一般采用和目标分子具有识别性的小分子或类似物。采用和目标分子具有识别性的小分子或类似物。亲和层析分离技术 亲和层析的理论亲和层析的理论 亲和介质的制备亲和介质的制备 常见的亲和层析常见的亲和层析LMELMEElmKKd1 EEKd1LMELMEKlm15.2 亲和层析的理论亲和层析的理论当蛋白质在非凝胶相和凝胶相之间达到平衡亲和层析的理论对正常的凝胶过滤色谱而言idEVKVV0亲和色谱中，固定配基在蛋白和凝胶之间产生的额外亲和作用idEVKVV0

4、亲和层析的理论 EELMEKd1lmEEEKLMVVVV0lmEEKLMVV1 实际上，实际上，Ve/VeVe/Ve很难测定，但在洗脱液中，很难测定，但在洗脱液中，加入可活性配基或竞争性抑制剂，使固定配基的加入可活性配基或竞争性抑制剂，使固定配基的表边的亲和力降低，其数值可以测得表边的亲和力降低，其数值可以测得 LMELMEElmdKK11EIIEK11111IEIEik亲和层析的理论推导得到 IkKKLMVVVVVilmEEEE101 在可溶性亲和竞争性配基的存在下，固定在可溶性亲和竞争性配基的存在下，固定配基对酶的阻滞作用降低，其程度取决于可溶配基对酶的阻滞作用降低，其程度取决于可溶性配基

5、和固定配基的相对浓度和解离常数。性配基和固定配基的相对浓度和解离常数。亲和层析的理论5.3 亲和介质的制备亲和介质的制备 介质的选择介质的选择 介质的活化和偶联介质的活化和偶联 亲和配基固定偶联的密度的测定亲和配基固定偶联的密度的测定 间臂分子的选择间臂分子的选择介质的选择通常而言，亲和色谱的介质应具备下面四个条件： 具有多孔网络结构具有多孔网络结构 非特异吸附小，基质化学性质应是惰性，表面非特异吸附小，基质化学性质应是惰性，表面 电荷尽可能低；电荷尽可能低； 理化性质稳定，不因共价偶联反应的条件及吸理化性质稳定，不因共价偶联反应的条件及吸 附条件的变化而发生变化；附条件的变化而发生变化； 基

6、质必须能够活化或功能化基质必须能够活化或功能化介质是亲和配基附着的基础，起着支撑和骨架作用介质的选择 多糖类： 纤维素纤维素（cellulose）、）、葡聚糖葡聚糖（dextrin） 琼脂糖琼脂糖（agarose） 聚丙烯酰胺 无机基质 可控制孔径多孔玻璃可控制孔径多孔玻璃（CPG）、）、 陶瓷和硅胶陶瓷和硅胶介质的选择 用于分析时，专一性比容量及稳定性重要，而用于分析时，专一性比容量及稳定性重要，而应用制备时，吸附剂的稳定性是最主要的指标，同应用制备时，吸附剂的稳定性是最主要的指标，同时还要考虑成本因素。对于不同的介质而言，这些时还要考虑成本因素。对于不同的介质而言，这些要求不可能同时满足。

7、所以在介质的选取时，应该要求不可能同时满足。所以在介质的选取时，应该根据具体的分离要求选择合适的介质。根据具体的分离要求选择合适的介质。专一性（Specifcity）、）、容量（capacity）及稳定性（stability）是衡量所选介质好坏的三个标准介质的活化和偶联介质的活化和偶联多糖基质 溴化氰法，三嗪法溴化氰法，三嗪法 高碘酸盐法高碘酸盐法 环氧化物法环氧化物法 苯醌法苯醌法 其他活化剂其他活化剂聚丙烯酰胺基质 戊二醛法戊二醛法 肼法肼法多孔玻璃与硅胶溴化氰法 多糖基质三嗪法 多糖基质高碘酸盐法 多糖基质环氧化物法 多糖基质苯醌法多糖基质其他方法甲苯磺酰氯 多糖基质戊二醛法 聚丙烯酰胺

8、基质聚丙烯酰胺基质肼法多孔玻璃与硅胶亲和配基固定偶联的密度的测定p 分光光度法p 重量差法分析p 水解作用分析p 元素分析法间臂分子的选择 由于生物大分子的空间结构及层析介质本身由于生物大分子的空间结构及层析介质本身孔结构的因素，往往在配基和基质骨架之间引入孔结构的因素，往往在配基和基质骨架之间引入一个间臂分子，可显著地提高配基的空间利用度，一个间臂分子，可显著地提高配基的空间利用度，即提高吸附容量。即提高吸附容量。间臂分子的引入时要考虑两个因素：空间位阻，空间位阻， 疏水作用疏水作用5.4 常见的亲和层析常见的亲和层析p 核苷酸及辅酶和层析 p 固定化金属离子亲和层析 p 染料亲和层析 p

9、免疫亲和层析 p 基团专一性大分子亲和层析p 共价色谱常见的核苷酸及辅酶亲和层析介质 配基分类配基生产公司典型应用腺苷腺苷腺苷33，55环化单磷环化单磷酸（酸（CAMPCAMP）PL Biochemical SIGMA腺苷激酶及脱氨酸腺苷激酶及脱氨酸腺苷腺苷33，55二磷酸二磷酸（33，55ADPADP）PL Biochemical SIGMA Pharmcia依赖辅酶依赖辅酶A A的酶的酶腺苷腺苷55单磷酸（单磷酸（AMPAMP）PL Biochemical磷酸化酶磷酸化酶腺苷腺苷55三磷酸（三磷酸（AIPAIP）PL Biochemical激酶激酶辅酶辅酶辅酶A A（CoACoA）PL B

10、iochemical CoA CoA转移酶，转移酶，乙酸乙酸-CoA-CoA酶酶氧化型辅酶氧化型辅酶I I（NADNAD）PL BiochemicalSIGMA5-5-核苷酸酶核苷酸酶氧化型辅酶氧化型辅酶（NADPNADP）PL Biochemical核酸酶核酸酶核苷酸鸟苷鸟苷-5-5-三磷酸三磷酸SIGMA谷氨酸脱氢酶谷氨酸脱氢酶5.4.1 核苷酸及辅酶亲和层析N6（6-氨己基）氨甲酰-AMP-Sepharose间接偶联法示意图 核苷酸及辅酶亲和层析核苷酸及辅酶亲和层析 核苷酸亲和层析的合成 碳二亚胺直接法偶联碳二亚胺直接法偶联 间接偶联法间接偶联法 核苷酸亲和层析的吸附和解吸5.4.2 固

11、定化金属离子亲和层析p 螯和基团和金属离子的选择 p 亲和层析介质的合成 p 固定化金属离子亲和层析的 吸附和解吸条件5.4.3 染料亲和层析 染料亲和层析介质的制备 蛋白质的吸附和解吸染料亲和层析SO3HNNNClNHSO3HNHNH2SO3HNHOOCibacron Blue F3G-A 结构图结构图 HNRSO3HHO3SNNNClNHNNNClHNNHSO3HROH3SHOOHNNSO3H其中其中R R为为: :染料亲和层析Procion Red H-E3B 结构图结构图染料配基和蛋白质作用大小排列染料配基和蛋白质作用大小排列 第一组第二组第三组第四组第五组Procion Blue M

12、X-7RXCibacron Blue 2-RAProcion Yellow MX-6GRemazol Organe 3RCibacron Brown 3-GRAProcion Red MX-4RProcion Yellow MX-4RRemazol Organe RCibacron Blue F3-GAProcion Red H-E3GRemazol Blue RProcion Yellow H-E6RProcion Blue MXGProcion Organge MX-2RProcion Red MX-7BProcion blue H-ERDProcion Green H-E4BDProci

13、on Red H-3B染料亲和层析5.4.4 免疫亲和层析 免疫亲和层析介质的制备 免疫亲和层析的吸附和解吸比较项目单抗多抗设备需求多多简单简单手工时间多多少少抗体数量大大中等中等提供的持久性长期长期短短抗体质量高高低低亲和专一性可高可低可高可低多数专一性高多数专一性高免疫亲和层析单抗和多抗的比较单抗和多抗的比较5.4.5 基团专一性大分子亲和层析 Protein A 亲和层析 Ig G抗体 解吸：1M acetate buffer 0.1 M glyceicine HCl buffer Con A 亲和层析 糖蛋白：免疫球蛋白，IgM 低密度酯蛋白 肝素亲和层析原理原理（a）吸附过程；（吸附过程；（b）洗脱过程；（洗脱过程；（c）再生过程再生过程 5.4.6 共价色谱引入硫醇基引入硫醇基引入双硫键引入双硫键 共价介质的合成共价介质的合成共价色谱的吸附和解吸共价色谱的吸附和解吸1、上样预处理2、