均匀设计优化聚谷氨酸与表阿霉素的交联条件

1、均匀设计优化聚谷氨酸与表阿霉素的交联条件摘要目的:优化聚谷氨酸与表阿霉素的交联条件。方法:采用均匀实验设计,考察a.表阿霉素的投量(mg),b.反应时间(h),c.反应体系的pH值对交联率的影响。结果:表阿霉素的交联率(Y)在实验范围内与各因素之间符合方程:Y=76.70+0.337 8a-2.28510-2b-8.141c,=0.988 8。此方程在pH5.4以上适用,药物交联率最高可达到39 %。结论:本实验定量地确定了各交联条件对药物交联率的影响程度。关键词表阿霉素,聚谷氨酸,均匀设计Optimizing the conjugating condition of polyglutamic

2、 acid and epirubicin by uniform designXu Fenghua,Jiang Xuetao,Zhu Hao(Department of Pharmaceutical,Second Millitary Medical University,Shanghai 200433)OBJECTIVES: To optimize the conjugating condition of polyglutamic acid(PGA) and epirubicin(EPR).METHODS:Arranging three experimental factors accordin

3、g to uniform design:milligram of epirubicin involved,duration of the reaction(h),and the pH value of the reaction solution.RESULTS:The conjugating rate of epirubicin and the three experimental factors conform to the following equation:Y=76.700.3378a-2.28610-2b-8.141c,r=0.988 8.The equition is adapta

4、ble when the pH value of the reaction solution is above 5.4,and the maximum conjugating rate can be up to 39 %.CONCLUSIONS:The influence of the experimental factors to the conjugating rate is determined quantitively.Key wordsepirubicin,polyglutamic acid,uniform design制备单克隆抗体-药物免疫偶合物时,为了在保留抗体识别抗原的活性的

5、前提下提高其载药量,常在药物和抗体之间引入大分子载体,于是,大分子载体载药量的多少直接关系到免疫偶合物的载药量。均匀设计是一种适用于多因素、多水平试验的设计方法,它保留了正交设计的“均匀分散”的特点,舍弃了其“整齐可比性”。其实验次数少,可定量地预测优化条件和结果。因此,在制备抗肝癌细胞单克隆抗体-聚谷氨酸-表阿霉素免疫偶合物时,我们采用均匀实验设计,优化聚谷氨酸(Poly-glutamic acid)与表阿霉素(Epirubicin)的交联条件,以达到最终提高抗体载药量的目的。1材料与方法1.1试剂与仪器表阿霉素(意大利爱宝药厂);聚谷氨酸钠(Sigma产品);已二酰肼(自制,熔点180.5

6、 185 );N-(3-二甲氨基丙基)-N乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI),MERCK-Schuchardt产品;PD-10柱(SephadeG-25填料,Pharmacia产品);751分光光度计(上海分析仪器厂)。1.2聚谷氨酰肼的制备聚谷氨酸钠溶于水,用0.1 mol.L-1醋酸酸化至pH4.8,加入已二酰肼(3倍于聚谷氨酸量),振荡溶解,再加入溶于0.2 ml水的2030 mgEDCI,醋酸维持pH4.85.4,反应约半小时,至pH几无变化,对磷酸盐缓冲液透析以终止反应。用比色法测定引入聚谷氨酸的酰肼基的总含量,为每45个谷氨酸单体连接1个酰肼基。1.3聚谷氨酸-表阿霉素的制备聚谷氨酰肼

7、溶液中加入浓度为10 mg*ml-1的盐酸表阿霉素,调节至不同pH值,4 过夜得沉淀;碱性条件下使沉淀溶解,过PD-10柱,收集大分子流份,于495 nm波长处测定表阿霉素的含量,计算药物交联率。实验中,聚谷氨酰肼用量为10 mg,考察的因素及范围如下:a.表阿霉素的用量38 mg,b.反应时间1272 h,c.反应体系pH5.67.6,将各因素平均分成6个水平,列于表1。选择U7(76)表,根据其使用表的规定,选择1,2,3列,同时去掉一行组成U6(63)表,按此表安排实验条件,列于表2。按表中条件进行实验,表阿霉素的交联率(交联量/投药量)见表2。表1因素和水平因素水平123456a345

8、678b122436486072c5.66.06.46.87.27.6表2实验条件和结果实验号因素及实验条件交联率/%abc11(3)2(24)3(6.4)25.3422(4)4(48)6(7.6)15.9533(5)6(72)2(6.0)26.7444(6)1(12)5(7.2)18.6855(7)3(36)1(5.6)33.5266(8)5(60)4(6.8)22.952结果用实用药理学计算程序将收率对各因素的各水平进行多元线性回归,得到回归方程式:Y=76.70+0.337 8a-2.28610-2b-8.141cr=0.988 8P0.05从方程式可以看出,pH值对交联率的影响最为显著

9、。在所考察的条件范围内,降低反应混合物的pH值能够提高交联率。提高表阿霉素的用量亦可提高交联率,反应时间的影响则几乎为零。故选择最佳反应条件为:a=8,c=5.6,b=12。回归方程,得最佳反应条件下交联率的计算值Y=33.54 %。交联率Y的区间估计为Y=Y1U.S;a=0.05时,U=1.96,故Y=33.5 %2.9 %,即在最佳条件下安排实验,所得交联率应在30.65 %36.43 %范围之内。本实验第5组的条件与最佳条件接近,所得产率亦在预测值范围内。3讨论3.1pH值是影响交联率的关键因素。在本实验设计中,pH值最低定为5.6。pH值低于4.4,聚谷氨酸会从溶液中析出。酸性条件下表阿霉素不稳定。实验用的表阿霉素是其粉针剂,在pH值不低于5的情况下方可保证其中的乳糖不参与交联反应。所以,反应液的pH值通常不低于5.4。当pH5.4,药物投量8 mg,反应12 h时,理论交联率为35.17 %,其可信区间为32.28 %38.06 %。在此条件下进行实验,交联率分别为36.76 %,38.7 %,38.97 %,39.41 %,与计算结果极为相符。故认为所得回归方程在pH5.4时仍然适用,pH值低于5时,交联率下降。3.2由于聚谷氨酸