第18章色谱分离原理

1、仪器分析仪器分析王 红光分析其它冯钰锜色谱分析电分析课程报告课程报告题目：题目：“我想象中的一种我想象中的一种未来仪器分析方法未来仪器分析方法 ”要求：要求：文体不限；文体不限；100100 100100分分时限：时限：期末考试前期末考试前参考书目参考书目 仪器分析武汉大学化学系 2001 仪器分析赵藻藩等 高教出版社 1996 仪器分析教程 北京大学出版社 仪器分析（第三版）朱明华 高教出版社 仪器分析原理方惠群等 南京大学出版社。 相关仪器分析方法的专著第第1818章章 色谱法导论色谱法导论18-1 概述18-2 色谱基本术语18-3 色谱法基本理论18-4 分离度18-5 定性和定量分析

2、本章学习要点本章学习要点色谱基本术语色谱基本术语三大关系式：三大关系式： 保留方程保留方程 速率理论方程速率理论方程 基本分离方程基本分离方程色谱定量方法色谱定量方法本章作业本章作业1. 请解释保留时间和调整保留含义。请解释保留时间和调整保留含义。2. 2. 衡量色谱柱柱效能的指标是什么衡量色谱柱柱效能的指标是什么? ?衡量色衡量色谱柱选择性的指标是什么？谱柱选择性的指标是什么？3. 3. 请写出色谱基本理论中的三个基本方程，请写出色谱基本理论中的三个基本方程，并指出各符号含义。并指出各符号含义。18-5，7, 9, 13, 2018-1 18-1 概述概述色谱发展简史色谱发展简史色谱法在工业

3、生产和科学研究中的作用色谱法在工业生产和科学研究中的作用色谱法的定义与分类色谱法的定义与分类一、一、 色谱发展简史色谱发展简史色谱法的出现色谱法的出现 色谱法的发展色谱法的发展 色谱法的现状和未来？色谱法的现状和未来？色谱法的出现色谱法的出现 1903年 Tswett （茨维特）Tswett (18721919).In this building of Warsaw University, Mikhail Semenovich Tswett invented the chromatographic technique. There is amemorial plaque on the wall

4、 of the building.色谱法的出现色谱法的出现1903年 Tswett （茨维特）研究植物叶子组成时发明了色谱法19061906年年 Tswett Tswett 的研究成果发表的研究成果发表 Chromatographie (德语） Chromatography (英语） 色谱 玻璃管=“色谱柱色谱柱”column 碳酸钙=“固定相固定相”stationary phase 石油醚=“流动相流动相”mobile phase色谱法的发展色谱法的发展19311931年年 Kuhn Kuhn 等用氧化铝和碳酸钙分离了等用氧化铝和碳酸钙分离了-,-,-,-,-胡萝卜素等胡萝卜素等6060多种

5、植物色素多种植物色素19411941年年 Martin Martin 和和 SyngeSynge建立了液液分配色谱法建立了液液分配色谱法并提出气相色谱的设想并提出气相色谱的设想19521952年年 MartinMartin等等发明了气液色谱法发明了气液色谱法19521952年年 Martin Martin 和和 Synge Synge 获得诺贝尔化学奖获得诺贝尔化学奖A.J.P. MartinR.L.M. Synge色谱法的发展色谱法的发展1957年年Goley开创了毛细管气相色谱开创了毛细管气相色谱1960年代末出现高效液相色谱法年代末出现高效液相色谱法1980年代超临界流体色谱得到发展年代

6、超临界流体色谱得到发展1980年代年代Jorgeson发展了高效毛细管电泳发展了高效毛细管电泳1990年代后期毛细管电色谱得到重视和发年代后期毛细管电色谱得到重视和发展展液相色谱分离速度的变化液相色谱分离速度的变化色谱法的现状和未来色谱法的现状和未来气相色谱和高效液相色谱发展最好气相色谱和高效液相色谱发展最好超临界流体色谱处于失利地位超临界流体色谱处于失利地位毛细管电泳与毛细管电色谱处于发展与完毛细管电泳与毛细管电色谱处于发展与完善阶段善阶段,已经在部分应用领域发挥重要作用已经在部分应用领域发挥重要作用气相色谱和高效液相色谱发展最好气相色谱和高效液相色谱发展最好气相色谱仪及备件全球市场: 约1

7、0亿美元/年; 3-4%年增长高效液相色谱仪及备件6-8%年增长超临界流体色谱处于失利地位超临界流体色谱处于失利地位发展晚于GC和HPLC虽然具有一些独特用途，但大多数功能可由GC和HPLC代替毛细管电泳与毛细管电色谱毛细管电泳与毛细管电色谱为基因组学研究作出了杰出贡献目前存在的主要问题： 分析结果偏差大 比HPLC大一个数量级机遇：分离分析生物大分子色谱法在工业生产和科学研究中的作用色谱法在工业生产和科学研究中的作用1930-1940年代为分离复杂的生物组成发挥了独特作用1950年代为石油工业的发展作出了贡献1960-1970年代成为石油化工、化学工业等部门的分析检测手段目前，色谱法已成为生

8、命科学、医药科学、环境科学、材料科学、食品科学、法庭科学以及航天科学等研究领域的重要手段发展趋势发展趋势进一步发展高效分离技术进一步发展高效分离技术小型化、微型化、自动化小型化、微型化、自动化各种联用技术各种联用技术样品处理技术样品处理技术高通量高通量超高效液相色谱（超高效液相色谱（UPLCUPLC）chromatogram obtained under isocratic conditions on a 43 cm long capillary column packed with1.0 m non-porous C18 particles (Eichrom Scientific).超高效液

9、相色谱（超高效液相色谱（UPLCUPLC）The sample was run using constant-flow pumps at 52 000 psi on a 38cm long capillary packed with 1.0 m C18 particles.芯片液相色谱芯片液相色谱ZORBAX 300SBC18 5 m particlesH.-F. Yin et al., presented at the 18th International Symposium onMicroscale Separations and Analysis, HPCE, San Diego, Ja

10、nuary 2003.多肽分离图多肽分离图自动化自动化分离分析新技术分离分析新技术毛细管电泳全二维气相色谱液相色谱气相色谱联用液相色谱液相色谱联用色谱质谱联用*样品处理技术色谱法的定义与分类色谱法的定义与分类 色谱法是一种物理化学分析方法，它利用色谱法是一种物理化学分析方法，它利用混合物中各物质在两相（固定相和流动相）混合物中各物质在两相（固定相和流动相）间的间的分配系数的差别分配系数的差别，当两相作相对运动，当两相作相对运动时，各物质随流动相运动，并在两相间进时，各物质随流动相运动，并在两相间进行多次分配，从而使个组分得到分离行多次分配，从而使个组分得到分离。色谱法的分类色谱法的分类按固定相

11、的使用形式按固定相的使用形式按流动相的物理状态按流动相的物理状态按分离机理按分离机理按色谱操作方式不同按色谱操作方式不同按流动相和固定相的极性不同按流动相和固定相的极性不同按用途不同分类按用途不同分类按固定相的使用形式分类按固定相的使用形式分类柱色谱柱色谱 (column chromatography)平板色谱平板色谱 (planar chromatography) 纸色谱 (paper chromatography) 薄层色谱 (thin layer chromatography)按流动相的物理状态分类按流动相的物理状态分类气相色谱 气固色谱 气液色谱 液相色谱 液液色谱 液固色谱超临界流体

12、色谱按分离机理分类按分离机理分类分配色谱 (partition chromatography)吸附色谱 (adsorption chromatography)离子交换色谱(ion exchange chromatography)排阻色谱 (size exclusion chromatography)亲和色谱 (affinity chromatography)按色谱操作方式不同分类按色谱操作方式不同分类迎头色谱迎头色谱 (frontal chromatography)顶替色谱顶替色谱 (displacement chromatography)洗脱色谱洗脱色谱 (elution chromatog

13、raphy)迎头色谱（前沿色谱） 将样品连续不断地通入色谱柱中，在柱后可得到台阶形的浓度变化曲线。根据台阶的位置定性，根据台阶的高度进行各组分的定量。顶替色谱（置换色谱） 当试样加入色谱柱后，再将一种吸附能力比所有样品组分都强的物质加入色谱柱中。此后各组分依次顶替流出，吸附能力最弱的组分将首先流出。这种方法可以得到大量的纯物质，适合于制备分离。洗脱色谱（冲洗）洗脱色谱（冲洗） 这是色谱过程最常用的方法。将试样加入色谱柱的入口端，然后用流动相冲洗柱子，由于各组分在固定相上的吸附（或溶解）能力不同，于是被流动相带出的时间不同。 流动相与固定相的作用力小于样品组分与固定相的作用力。按流动相和固定相的

14、极性不同正相色谱 （流动相极性小于固定相）反相色谱 （流动相极性大于固定相）按用途不同分类按用途不同分类分析型色谱制备型色谱流程色谱18-2 18-2 色谱基本术语色谱基本术语多环芳烃HPLC色谱图气相色谱流程图气相色谱流程图一、基线（一、基线（baseline)baseline) 仅有流动相通过时，检测器响应信号的记录值二、峰高h三、保留值 死时间 (tM) 和保留时间 (tR)三、保留值 死体积 (VM) 和保留体积 (VR) 死体积: 色谱柱中不被固定相占据的空间以及进样系统管道和检测系统的总体积 （VM = tM Fc） 保留体积: 从注射样品到色谱峰顶出现时，所通过色谱系统的流动相体

15、积（VR = tR Fc）三、保留值 调整保留时间 (tR)和调整保留体积(VR)tR = tR - tM (溶质在固定相中停留的总时间)VR = VR - VM三、保留值相对保留值 (2,1) relative retention 在一定色谱条件下两个组分的调整保留时间（体积）的比2,1 = tR2/tR1分离因子 () separation factor = tR2/tR1四、溶质保留方程四、溶质保留方程 保留因子 k (retention factor) （容量因子，分配比） 在平衡状态下组分在固定相与流动相中的质量之比k = ns / nm 四、溶质保留方程四、溶质保留方程 溶质通过色

16、谱柱的速度或保留值的大小是由每一瞬间该溶质在流动相中的分子分数决定的。 设流动相的平均流速为 u，溶质 x 谱带在色谱柱中的移动速度为 uxux = Ru四、溶质保留方程四、溶质保留方程流动相平均流速u和溶质谱带移动速度ux smmnnnRRxMtLutLuR为溶质 x 在流动相中分子数与总分子数之比四、溶质保留方程四、溶质保留方程 溶质保留方程 MRMMRMmsRMsmmRxtttttktnnttLnnntLuRu1111kt四、溶质保留方程四、溶质保留方程 分离因子 = tR2 / tR1 = k2 / k1 分配系数 K称为相比*KVVKkVnVnCCKMSMmSsms/四、溶质保留方程

17、四、溶质保留方程 根据保留体积与保留时间的关系k = (VR-VM)/VMVR = KVS+VMK温度固定相性质流动相性质溶质形态五、区域宽度五、区域宽度 标准偏差 半峰宽 Y1/2 基线宽度 Y色谱流出曲线色谱流出曲线标准偏差半峰宽基线宽度半峰宽度、基线宽度半峰宽度、基线宽度与标准偏差的关系与标准偏差的关系4354. 22/1YY18-3 色谱法基本理论色谱分离过程塔板理论速率理论色谱分离过程改进分离的两种途径改进分离的两种途径塔板理论塔板理论(Martin & Synge) 色谱柱是由一系列连续的、相等的水平理论塔板组成 在每一块塔板(高度H)中溶质可以在流动相与固定相中迅速达到平衡。H称

18、为称为理论塔板高度理论塔板高度。 流动相进入色谱柱不是连续进行的，而是脉动式，每次进入的流动相体积为一个塔板体积。 所有组分开始时存在于第0号塔板上，且试样的纵向扩散可忽略。 分配系数在所有塔板上是常数，与组分在某一塔板上的量无关。流出曲线方程 当塔板数 n 50, 色谱流出曲线趋于正态分布 c0 进样浓度，c为时间t时柱出口浓度22202Rttecc色谱流出曲线色谱流出曲线理论塔板数与理论塔板高度理论塔板数与理论塔板高度 由塔板理论可以得到理论塔板数 n 与色谱峰半峰宽度或基线宽度的关系 色谱峰越窄，理论塔板数越多，理论塔板高度越小，柱效能越高 n 和 H可作为描述柱效能的指标nLHYtYt

19、nRR222/11654.5有效塔板数和有效塔板高度 同一色谱柱对不同物质的柱效能是不一样的，当用塔板数和塔板高度表示柱效能时，必须说明对什么物质而言 有效有效有效nLHYtYtnRR222/11654.5塔板理论的成功与不足塔板理论的成功与不足 成功点：流出曲线的形状浓度极大点的位置计算和评价柱效能的指标（n, H)塔板理论的成功与不足不足：无法回答的问题1.实验参数如填料的大小、分子结构、温度等对色谱峰形以及塔板数和塔板高度的影响2.理论塔板高度与流速有关速率理论 (van Deemter)色谱峰展宽的因素速率理论方程其它因素（一）色谱峰展宽的因素涡流扩散 （多流路扩散）分子扩散 （纵向扩

20、散）传质阻力流动相传质阻力固定相传质阻力涡流扩散涡流扩散 dp 是填料的平均直径 填充不规则因子 L 色谱柱长度Ldp221分子扩散 （纵向扩散）分子扩散 气体分子扩散对色谱峰宽的贡献 弯曲因子 Dg溶质在气相中的扩散系数 u 流动相流速uLDg222传质阻力 物质系统由于浓度不均匀而发生物质迁移过程，称为传质。影响这个过程进行速度的阻力，叫传质阻力。流动相传质阻力固定相传质阻力传质阻力流动相传质阻力 k 保留因子kkkfuLDdkfggpg101.0)()(2223固定相传质阻力 df 固定液的液膜厚度 Dl溶质在液膜中的扩散系数2224132)()(kkkfuLDdkfllfl（二）气相色

21、谱速率理论方程 正态分布色谱峰的理论塔板高度可以定义为每单位柱长的方差242322212LH2气相色谱速率理论方程 uCuBAHuDdkfDdkfuDdHgpglflgp2222流速对理论塔板高度的影响（三）液相色谱速率理论方程气相色谱与液相色谱的区别：溶质在液相中的扩散系数比在气相中小105倍液体粘度比气体约大102倍液体的表面张力比气体约大104倍液体密度比气体约大103倍液体不可压缩流动区域中的流动相传质阻力流动区域中的流动相传质阻力uMDpdmCHm2Cm: 与填充性质有关的因子流动相滞留区的传质阻力流动相滞留区的传质阻力uMDpdsmCHsm2Csm: 微孔中流动相及保留因子有关的常

22、数液相色谱速率理论方程uMDpdmCMDpdsmCsDfdsCuMDdCdHp2222液相色谱速率理论方程uCuBAH不同粒径填料色谱柱的H-u曲线液相色谱分离速度的变化（三）其它因素 色谱峰的不对称性色谱峰的不对称性 柱外效应柱外效应吸附等温线KVR = KVS+VM不对称因子(Asymmetry factor)As= A/B As 1 拖尾色谱峰；As 1 前伸色谱峰柱外效应 除了色谱柱中发生的谱带展宽外，柱外区域也会造成谱带的展宽，这种现象称作柱外效应。 主要原因：柱外体积 进样器体积 检测器体积 一些连接管道体积柱外效应216RextcolextcolVVLHHHHH柱外效应 VR 增

23、大时，柱外效应的重要性减低 n 较大时，柱外效应有较大的影响2161RextcolVVnHH柱效和选择性对分离的影响色谱分离效果色谱峰的位置-色谱热力学色谱峰的宽窄- 色谱动力学18-4 分离度（分辨率） 分离度：相邻两色谱峰保留值之差与两峰底宽平均值之比2112)(2YYttRRRs不同分离度时色谱峰的分离程度影响分离度的因素 色谱分离基本方程式 I 柱效因子项； II 分离因子项； III 保留因子项(III)(II) I (11422kknRs基本分离方程式的推导基本分离方程式的推导 设两相近的色谱峰基线宽度相等，则有2122112)(2YttRYYttRRRsRRs色谱分离基本方程式的

24、推导2122414116RRRssRRtttnRRtnYYtn方程代入基本分离方程式的推导 由溶质保留方程得 分离因子为： = k2 / k1tR = k tM + tM 基本分离方程式 I 柱效因子项； II 分离因子项； III 容量因子项(III)(II) I (11422kknRs有效理论塔板数表示的基本分离方程式有效有效nkknnRs2114I 柱效因子项 分离度与柱效的关系 Rs n1/2 增加柱长可提高分离度（分析时间增加，柱压降增大） 减小色谱柱的H值，可提高分离度 （有效途径）4nII 分离因子项 分离度与色谱柱选择性的关系 =1，Rs = 0 不能分离 越大， 分离度越大，

25、分离效果越好 Rs确定且已知，可由色谱分离基本方程式计算所需理论塔板数1II 分离因子项222221116 kkRns需要III 保留因子项010203040500.00.20.40.60.81.0k/(k+1)k221kk液相色谱流动相对分离的影响液相色谱流动相对分离的影响分析速度uHkkRtsR2232221116分析速度 分离时间tR是所要求的分离度、组分分离因子、容量因子、柱效以及流动相速度的函数。 在其它变量保持恒定时， 分离度增加一倍，分离时间增加4倍 分离因子对分离时间影响很大分离因子对分离时间影响1.051.101.151.201.251.301.350100200300400

26、500(/(-1)2保留因子对分离时间的影响当k在2-5时，可在较短的分析时间，取得良好的分离度 0246810121402468101214161820222426(1+k)3/k2k基本分离方程的应用例 有一根1m长的色谱柱，分离组分1和2，得到下列色谱图。图中横坐标l为记录纸走纸距离。若欲得到Rs=1.2的分离度，有效塔板数应为多少？色谱柱应加到多长？解 先求分离因子： = tR2/tR1 = (49-5)/(45-5) = 1.1 求分离度：Rs = 2(tR2-tR1)/(Y1+Y2) = (49-45)/5 = 0.8 求有效塔板数：n有效=16(tR/Y)2=16(49-5)/5

27、)2=1239 若要使R=1.2,所需有效塔板数为：n有效=16 Rs2 (/(-1)2n有效=16 1.22 （1.1/0.1)2 = 2788 所需柱长为：L=2788/1239=2.25 m18-5 色谱定量分析方法 在一定的操作条件下，分析组分i的质量（mi）或在流动相中的浓度与检测器的信号（峰面积Ai 或峰高 hi）成正比：f 绝对校正因子色谱定量的依据ihiiiAiihfmAfmihiiiAiihfmAfm 准确测量峰面积（峰高） 准确求出比例系数（校正因子） 根据上式正确选定定量计算方法，将测得组分的峰面积（峰高）换算组分含量色谱定量分析方法 峰面积的测量方法 定量校正因子 几种常用的定量计算方法峰面积的测量方法 峰高乘半峰宽法A = 1.065 h Y1/2 峰高乘平均峰宽法A = h (Y0.15+Y0.85)/2(不对称色谱峰） 积分仪（色谱工作站）定量校正因子定量校正因子（1）绝对校正因子绝对校正因子受仪器及操作条件的影响大，不易准确测定iihiiiAihmfAmf定量校正因子定量校正因子（2）相对校正因子组份i 与基准物 s的绝对校正因子之比常用基准物：苯（热导池检测器） 正庚烷（氢焰检测器）siishshihissiisAsAiAis