系学术沙龙 梁荣奇2014-6-30

1、RNAiRNAi介导的抗麦长管蚜介导的抗麦长管蚜转基因小麦的培育转基因小麦的培育梁荣奇，副教授梁荣奇，副教授植物遗传育种系第三期学术沙龙植物遗传育种系第三期学术沙龙2014年年6月月26日日1 立论依据立论依据2 材料和方法材料和方法3 结果与分析结果与分析 3.1羧酸酯酶基因羧酸酯酶基因 3.2 脂蛋白酯酶基因脂蛋白酯酶基因 3.3 嗅觉相关蛋白嗅觉相关蛋白Gqa基因基因4 结论结论汇汇 报报 提提 纲纲1.1 1.1 小麦蚜虫是小麦生产中影响产量和品质的主要害虫小麦蚜虫是小麦生产中影响产量和品质的主要害虫1 1 立论依据立论依据 对抽穗以及灌浆期的小麦影响最大，平均每年造成小麦减产10%左

2、右，严重的年份造成产量损失约30%，现已成为小麦主要害虫。 麦蚜危害后可降低小麦面粉的出粉率、面粉营养成分（总氨基酸含量、总蛋白质含量及微量元素含量）、面团特性（稳定时间、延伸性、筋力、弹性指数）等品质指标显著下降。1 1 立论依据立论依据 麦长管蚜麦长管蚜 麦二叉蚜麦二叉蚜 禾谷缢管蚜禾谷缢管蚜 Sitobion avenae Schizaphis graminum Rhopalosiphum padi English Grain Aphid Greenbug 麦长管蚜多在植物上部叶片正面为害，抽穗灌浆后，迅速增殖，集中穗部为害。麦二叉蚜喜在作物苗期为害，被害部形成枯斑，其他蚜虫无此症状。王

3、春芝，3种小麦蚜虫的形态识别与防治技术，农技服务，2008，25（3）：50,58 1.2 1.2 防治麦蚜虫或者其他害虫主要还是依靠化学杀虫剂防治麦蚜虫或者其他害虫主要还是依靠化学杀虫剂 ，导致蚜虫天敌杀伤严重，环境污染加剧导致蚜虫天敌杀伤严重，环境污染加剧 。 拔节期：拔节期：百株蚜量500头（或30-60头/平米） 1）高效25% 阿维烯啶虫胺； 2）抗蚜威可湿性粉剂 ；3）吡虫啉可湿性粉剂 孕穗期、灌浆期：孕穗期、灌浆期：有蚜株率15%（或10头/株） 1）菊马乳油；2）百蚜净；3）保得丰；4）蚜必杀；5）劈蚜60毫升； 6）吡蚜酮可湿性粉剂；7）啶虫脒乳油；8）熏蒸类：敌敌畏、烯炔菊

4、酯）熏蒸类：敌敌畏、烯炔菊酯 有机磷类；有机磷类； 氨基甲酸酯类；菊酯类氨基甲酸酯类；菊酯类 化学防治具有成本高、易残留、污染环境、误伤天敌及益虫、化学防治具有成本高、易残留、污染环境、误伤天敌及益虫、长期大量使用农药使害虫产生抗药性等诸多弊端。长期大量使用农药使害虫产生抗药性等诸多弊端。1 1 立论依据立论依据 1.31.3 转基因抗蚜虫是解决虫害的转基因抗蚜虫是解决虫害的“绿色、安全、环境友好绿色、安全、环境友好”途径之一。途径之一。 植物凝集素对刺吸式口器害虫以及线虫有强烈的毒性。植物凝集素对刺吸式口器害虫以及线虫有强烈的毒性。 1 1 立论依据立论依据马尔比基氏管凝集素与昆虫的肠上皮细

5、胞结合并转运到血液中肠是唯一含有暴露细胞的表面的肠道，而且是在循环系统（血淋巴）和肠道中物质交换的主要场所。1.4 1.4 利用利用RNAiRNAi技术改良小麦的抗蚜性技术改良小麦的抗蚜性1 1 立论依据立论依据 用外源性外源性dsRNA沉默或破坏害虫体内生长发育或生殖相关的重要基因，从而导致害虫发育停滞、异常或者直接产生致死作用，进而达到控制靶标害虫种群的目的。 利用植物介导的植物介导的RNA干扰技术干扰技术特异抑制昆虫防御基因、生长发育关键基因的表达，已经成为开发安全高效转基因抗虫植物的新方向，该法对环境及其他生物的负面影响小，害虫不易产生抗药性等。8双链双链RNA (RNA (dsRNA

6、dsRNA) )的导入方法的导入方法方法方法特点特点靶标害虫靶标害虫参考文献参考文献1浸泡法将体外合成dsRNA加入害虫生活环境水生昆虫及其卵和蛹Eaton et al. , 2002；March and Bentley, 20072注射法将体外合成dsRNA注射到昆虫体腔内，再渗透或转运到细胞内，从而引起靶基因mRNA的降解线虫、昆虫如蟋蟀、赤拟谷盗、德国小蠊、家蚕、甜菜夜蛾Bucher et al. 2002；Cruz et al2007；Mutti et al2006； Tomoyasu et al. 2008；Cheng et al. 2008；Ohnishi et al. 20083

7、病毒介导法利用重组病毒侵染害虫，在害虫体内产生dsRNA4饲喂法通过摄食，体外合成dsRNA自然进入昆虫体内膜翅目昆虫蜜蜂、鳞翅目昆虫小菜蛾和棉铃虫等害虫蚜虫Baum et al. 2007；Kumar et al. 2009；Mao et al. 2009；Zhao et al, 2009王晖等,2012An et al, 2012Deng et al, 20145转基因植物法在植物体中表达含有目标病虫基因的hpRNA介导的RNAi水稻褐飞虱桃蚜麦蚜Zhao et al,2011Mao et al, 2013XU et al, 2014目前已知的蚜虫基因及其功能目前已知的蚜虫基因及其功能1

8、1 立论依据立论依据1 1 立论依据立论依据研究目标研究目标 以显著抑制麦长管蚜生长发育或有明显致死效应的候选靶标基因，创制转基因抗蚜小麦种质，为小麦蚜害的防治提供重要参考信息。研究内容研究内容技术路线技术路线1 立论依据立论依据2 材料和方法材料和方法3 结果与分析结果与分析 3.1羧酸酯酶基因羧酸酯酶基因 3.2 脂蛋白酯酶基因脂蛋白酯酶基因 3.3 嗅觉相关蛋白嗅觉相关蛋白Gqa基因基因4 结论结论汇汇 报报 提提 纲纲 蚜量比值 = 某材料的蚜量 全部观测材料的平均蚜量2.1 田间抗蚜鉴定田间抗蚜鉴定X=x代表某个株系的单分蘖蚜虫发生量，a1、a2a10分别代表不同单株整株某个时期蚜虫

9、发生量，b1、b2b10分别代表相应单株的分蘖数单分蘖蚜虫发生量（X）：培养皿离体叶片接种蚜虫培养皿离体叶片接种蚜虫2.2 室内抗蚜鉴定室内抗蚜鉴定人工气候室幼苗接种蚜虫人工气候室幼苗接种蚜虫蚜口密度抑制率%（对照植株虫数转化植株虫数）/ 对照植株虫数100%平均蚜口密度抑制率%各个克隆的蚜口密度抑制率之和 / 克隆个数100%繁殖率：单位时间内繁殖成功得到成活个体的数目。1 立论依据立论依据2 材料和方法材料和方法3 结果与分析结果与分析 3.1羧酸酯酶基因羧酸酯酶基因 3.2 脂蛋白酯酶基因脂蛋白酯酶基因 3.3 嗅觉相关蛋白嗅觉相关蛋白Gqa基因基因4 结论结论汇汇 报报 提提 纲纲羧酸

10、酯酶水解示意图3.1 利用RNAi干扰麦长管蚜羧酸酯酶基因 羧酸酯酶（Carboxylesterases，CarE) 是一个多功能酶系，其活性中心含有Ser残基，能够有效的水解酯类（羧酸酯类和硫酯类）、酰胺类化合物。 属于丝氨酸酯酶家族。不同种属间的昆虫羧酸酯酶氨基酸序列同源性则相对较低。 171.1.昆虫的抗性机制昆虫的抗性机制 与多种药物、环境毒物及致癌物的解毒和代谢有关与多种药物、环境毒物及致癌物的解毒和代谢有关2.2.参与昆虫信息素和激素的降解参与昆虫信息素和激素的降解3.3.参与参与神经形成与发育的调节神经形成与发育的调节4.4.参与脂类的运输和代谢参与脂类的运输和代谢昆虫羧酸酯酶的

11、生物学功能昆虫羧酸酯酶的生物学功能3.1 利用RNAi干扰麦长管蚜羧酸酯酶基因3.1.1 不同龄期蚜虫不同龄期蚜虫CbE E4 表达量分析表达量分析 3.1 利用RNAi干扰麦长管蚜羧酸酯酶基因2龄 33%3龄 53%4龄 156%成虫 303% Relative CbE E4 mRNA expression level at different aphid growth stages. Expression levels of CbE E4 increased from instar 1 through to the adult stage.3.1.2 辛硫磷对麦长管蚜辛硫磷对麦长管蚜CbE

12、 E4 表达量的影响表达量的影响 3.1 利用RNAi干扰麦长管蚜羧酸酯酶基因100mol/L 34.4%200mol/L 78.2%qRT-PCR analysis of CbE E4 transcripts in the adult larvae sprayed with different concentrations of Phoxim solution for 1 h. The CbE E4 was more highly expressed in samples treated with the 200 lM Phoxim solution than in samples trea

13、ted with the 100 lM solution. 1 2 M 2 麦长管蚜总麦长管蚜总RNA 1-2：麦长管蚜总：麦长管蚜总RNA RT-PCR获得获得CbE E4片段片段M：2000bp Ladder，1：PCR扩增结果扩增结果0.350kb1) 麦长管蚜麦长管蚜CbE E4 基因片段的获得基因片段的获得 3.1 利用RNAi干扰麦长管蚜羧酸酯酶基因 3.1.3 CbE E4 基因片段的获得及载体构建基因片段的获得及载体构建 SaCbE-s1SaCbE-a1 桃蚜羧酸酯酶基因（GenBank：X74554 ） 2) 麦长管蚜与桃蚜麦长管蚜与桃蚜CbE E4 序列比对序列比对有有61

14、个碱基与桃蚜（个碱基与桃蚜（GenBank：X74554） mRNA不同，不同，同源性达到同源性达到83.1%。3.1 利用RNAi干扰麦长管蚜羧酸酯酶基因3) 目的片断反向插入目的片断反向插入FAD2 Intron1的下游的下游 460bpM 1 AtFAD2I9F AtFAD2I9R 拟南芥FAD2基因的内含子（GenBank NO.AJ27184.1） SaCbE-s1/AtFAD2I9F PCR扩增 3.1 利用RNAi干扰麦长管蚜羧酸酯酶基因4) 目的片断正插入目的片断正插入FAD2 Intron1的上游的上游M 1505bpSaCbE-s1/AtFAD2I9R PCR扩增 3.1

15、利用RNAi干扰麦长管蚜羧酸酯酶基因5) 插入启动子和终止子插入启动子和终止子 4.0kb1.8kb1.8 kb4kb 3 M 1 2 Kpn I、Bam HI酶切验证酶切验证 M：1kb Ladder； 1： Kpn I、Bam HI酶切pBSK-CbE E4R； 2： Kpn I、Bam HI酶切pBAC-rbcs-pta ； 3： KpnI、BamH I酶切pBAC-rbcs-CbE E4.pBAC-rbcs-pta4653bprbcsptaNOS3ampXhoI (4)PvuII (12)HindIII (16)BamHI (1165)NcoI (1169)KpnI (1985)Sac

16、I (1991)PvuI (2005)EcoRI (2258)EcoRV (2272)HpaI (2327)以番茄核酮糖-1,5- 二磷羧化酶小亚基(small subunit of ribulose-1,5-bisphospate carboxylase，rbcSrbcS ) 的启动子驱动驱动RNAi 构件在叶肉细胞特异表达构件在叶肉细胞特异表达3.1 利用RNAi干扰麦长管蚜羧酸酯酶基因愈伤组织筛选分化生根壮苗利用RNAi干扰麦长管蚜羧酸酯酶基因3.1.4 转基因小麦的获得转基因小麦的获得共转化共转化3.1.5 转基因植株的分子鉴定转基因植株的分子鉴定 9 8 7 6 5 4 3 2 1

17、- + M转基因植株AtFAD-s1/ AtFAD-a1 PCR检测结果M：2000bp Ladder；+：pBAC-rbcs-CbE E4；：未转基因小麦；泳道1-9：转基因植株株系9 8 7 6 5 4 3 2 1 - + M转基因植株SaCbE-s1/ SaCbE-a1 PCR检测结果M：2000bp Ladder；+：pBAC-rbcs-CbE E4；：未转基因小麦；泳道1-9：转基因植株株系3.1 利用RNAi干扰麦长管蚜羧酸酯酶基因3.1.6 转基因株系对蚜虫转基因株系对蚜虫CbE E4 表达量的影响表达量的影响 1d 3d 5ddsCbE1-5 18.9% 19.1% 45.8%

18、 dsCbE2-2 37.3% 101.9% 102.8%3.1 利用RNAi干扰麦长管蚜羧酸酯酶基因3.1.7 转基因株系对麦长管蚜转基因株系对麦长管蚜CbE E4活性的影响活性的影响 利用RNAi干扰麦长管蚜羧酸酯酶基因Enzyme activity of S. avenae CbE E4 induced by wheat-mediated RNAi Aphids fed on transgenic dsCbE1-5 and dsCbE2-2 leaves for 5 and 7 days were harvested and measured for CbE E4 activity by

19、 use of spectrophotometry.b Degradation of Phoxim solution by CbE E4 enzyme solution Enzyme extracts of dsCbE1-5, dsCbE2-2, and control leaves hydrolyzed 30, 20, and 60% of the Phoxim solution, respectively.3.1 利用RNAi干扰麦长管蚜羧酸酯酶基因3.1.8 转基因株系对麦长管蚜繁殖率的影响转基因株系对麦长管蚜繁殖率的影响 dsCbE1-5 31.9%dsCbE2-2 45.2%The

20、numbers of nymphs produced by the aphids analyzed for down-regulation of CbE were counted and compared with the number of nymphs produced from aphids fed on the control.3.1 利用RNAi干扰麦长管蚜羧酸酯酶基因小结小结3.1 利用RNAi干扰麦长管蚜羧酸酯酶基因 将蚜虫羧酸酯酶（将蚜虫羧酸酯酶（Carboxylesterase，CarE）的）的RNAi载体转化小麦，利用植物介导载体转化小麦，利用植物介导RNAi策略培育转基因

21、策略培育转基因小麦；小麦； 将转基因叶片饲喂麦长管蚜，可以特异干扰蚜虫将转基因叶片饲喂麦长管蚜，可以特异干扰蚜虫CarE基因的表达，降低蚜虫对无机磷农药耐受力，从而基因的表达，降低蚜虫对无机磷农药耐受力，从而显著抑制麦长管蚜的繁殖率。显著抑制麦长管蚜的繁殖率。Lanjie Xu, Xiaoliang Duan, Yanhua Lv, Xiaohua Zhang, Zhansheng Nie, Chaojie Xie, Zhongfu Ni, Rongqi Liang*. Silencing of an aphid carboxylesterase gene by use of plant-me

22、diated RNAi impairs Sitobion avenae tolerance of Phoxim insecticides. Transgenic Research, 2014,23(2):389-396.梁荣奇等。表达抑制麦长管蚜羧酸酯酶的发卡RNA的DNA分子及其应用。申请号：201310552870.5，申请日期：2013-11-081 立论依据立论依据2 材料和方法材料和方法3 结果与分析结果与分析 3.1羧酸酯酶基因羧酸酯酶基因 3.2 脂蛋白酯酶基因脂蛋白酯酶基因 3.3 嗅觉相关蛋白嗅觉相关蛋白Gqa基因基因4 结论结论汇汇 报报 提提 纲纲 脂蛋白脂酶（lipop

23、rotein lipase，LPL， EC 3.1.1.34 ）是脂质代谢的关键酶，主要催化乳糜微粒和极低密度脂蛋白中的甘油三酯水解，产生供组织利用的脂肪酸和单酰甘油。LPL基因突变影响LPL活性，导致脂质代谢紊乱。 3.2 利用RNAi干扰麦长管蚜LPL和Gqa基因 G蛋白（Gqa）位于信号转导网络的枢纽地位，参与细胞的代谢、分泌、生长、增殖等几乎所有的基本生命过程。脂蛋白脂酶脂蛋白脂酶G蛋白蛋白1 2 3 MRT-PCR获得LPL片段 M：2000bp Ladder，1-3：PCR扩增结果0.543 kb3.2.1 LPL和Gqa基因的克隆M 1 RT-PCR获得Gqa片段（约0.533k

24、b）M：2000bp，Ladder；1：引物3.2 利用RNAi干扰麦长管蚜LPL和Gqa基因3.2.2 LPL和Gqa基因序列分析 GenBank：XM-0019507372 86.79%GenBank：XM-001944358.2 75.37%GenBank：FF314537 78.86%LPL基因序列分析基因序列分析3.2 利用RNAi干扰麦长管蚜LPL和Gqa基因麦长管蚜（GenBank：EF638906）序列同源性达到98.1% 。Gqa基因序列分析结果基因序列分析结果3.2 利用RNAi干扰麦长管蚜LPL和Gqa基因3.2.3 麦长管蚜麦长管蚜LPL和和Gqa基因基因表达量分析表达

25、量分析 2龄 7.4%， 3龄 0.6%， 4龄 14.6%，成虫 5.7%LPL基因2龄 12.5%， 3龄 0.01%，4龄 21.5%，成虫 10.1%Gqa基因3.2 利用RNAi干扰麦长管蚜LPL和Gqa基因3.2.4 转基因株系对转基因株系对LPL和和Gqa表达量的影响表达量的影响 dsLPL-1 5天 达27.6% dsLPL-4 5天 11.4% 1天 6.8%3天 11.4%7天 12.8%。3.2 利用RNAi干扰麦长管蚜LPL和Gqa基因3.2.5 转基因株系对麦长管蚜繁殖率的影响转基因株系对麦长管蚜繁殖率的影响 天/蚜虫（头） 3天 6天 10天 13天 17天CK 10 15 35 62.5 175dsLPL-4 10 59.4 57.5 76.7 156dsLPL-1 10 4.2 4.2 54 66.7转LPL对麦长管蚜繁殖率的影响 3.2 利用RNAi干扰麦长管蚜LPL和Gqa基因第11天 21%第15天 26%转Gqa对麦长管蚜繁殖率的影响 3.2 利用RNAi干扰麦长管蚜LPL和Gqa基