生药的有效性评价

1、生药的有效性评价生药的有效性评价( (Efficacy valuation of crude drug) ) Which methods could be used for efficacy evaluation? Why and how?生药的有效性评价(Efficacy evaluation ) 生物检定法（生物检定法（Bioassay） 与疗效相关联的化学成分分析法与疗效相关联的化学成分分析法(Analysis of bioactive components)生药的生物效应评价法 定义：定义：它以药物的药理作用为基础、生物统计它以药物的药理作用为基础、生物统计为工具，运用特定的实验设计，

2、在严格控制的试验条为工具，运用特定的实验设计，在严格控制的试验条件下，通过比较标准品和供试品对生物体或离体器官件下，通过比较标准品和供试品对生物体或离体器官与组织的特定生物效应，计算供试品的效价与组织的特定生物效应，计算供试品的效价（Potency）或者毒性（）或者毒性（Toxicity ） ，从而控制和评，从而控制和评价供试品质量或活性。价供试品质量或活性。生药的有效性评价方法之一： 对一些采用理化方法不能测定含量或理化测对一些采用理化方法不能测定含量或理化测定不能反映临床生物活性的药物。如胰岛素、定不能反映临床生物活性的药物。如胰岛素、肝素、缩宫素及各种抗生素等。肝素、缩宫素及各种抗生素等

3、。 微量生理活性物质。如微量生理活性物质。如Ach、5-HT 某些有害杂质的限度检查如农药残留量、内某些有害杂质的限度检查如农药残留量、内毒素等致热物质、抗生素及生化制剂中降压毒素等致热物质、抗生素及生化制剂中降压物质的限度检查等。物质的限度检查等。应用范围：应用范围： 中药及复方中药及复方: :中药成分复杂，大部分中药的有中药成分复杂，大部分中药的有效成分尚未搞清，难以用理化方法加以控制，效成分尚未搞清，难以用理化方法加以控制，但可用一些以其疗效为基础的生物测定方法但可用一些以其疗效为基础的生物测定方法来控制其质量。来控制其质量。应用范围：应用范围：Example 1 洋地黄生物检定法洋地黄

4、生物检定法比较洋地黄标准品比较洋地黄标准品(S)(S)与供试品与供试品(T)(T)对鸽的最小公对鸽的最小公斤致死量，从而测定供试品的效价。斤致死量，从而测定供试品的效价。 死亡前有强烈颤抖、恶心呕吐、死亡前有强烈颤抖、恶心呕吐、排便等反应。最后至瞳孔放大、排便等反应。最后至瞳孔放大、呼吸停止为注射终点。呼吸停止为注射终点。抗凝血酶活性测定法：抗凝血酶活性测定法：水蛭提取物水蛭提取物牛纤维蛋白原牛纤维蛋白原+凝血酶凝血酶(滴定滴定)至有凝固物出现至有凝固物出现Example 2 水蛭抗凝血酶活性测定水蛭抗凝血酶活性测定淀粉酶活力测定法：淀粉酶活力测定法：麦芽提取物麦芽提取物淀淀 粉粉+反应，反应

5、，反应终止反应终止麦芽糖麦芽糖Example 3 麦芽中淀粉酶活力测定麦芽中淀粉酶活力测定a,b淀粉酶（底物）3 3，5-5-二硝基水杨酸二硝基水杨酸棕红色（540nm）生药化学成分分析法生药的有效性评价方法之二： 定义：定义： 应用范围：应用范围：NR1HHHHHHHHOR2两种评价方法的比较生物生物检定法检定法理化理化分析法分析法测定结果能直接反测定结果能直接反映药物的效价；是映药物的效价；是理化分析法的有力理化分析法的有力补充补充测定结果误差较大，重现测定结果误差较大，重现性较差；加上测定费时，性较差；加上测定费时，计算繁琐；难以构建合适计算繁琐；难以构建合适的药理模型以反映中药整的药理

6、模型以反映中药整体作用的特点体作用的特点测定结果重现性好，测定结果重现性好，易于控制与推广易于控制与推广测定结果与活性之间的相测定结果与活性之间的相关性差关性差MethodsAdvantagesDisadvantages一、紫外一、紫外- -可见分光光度法可见分光光度法 (Ultraviolet-visible spectrometry)(Ultraviolet-visible spectrometry)朗伯朗伯- -比尔定律比尔定律: : A = ECL 1 1、原理：、原理：单色光辐射穿过被测物质单色光辐射穿过被测物质溶液时，被该物质吸收的量与该物质溶液时，被该物质吸收的量与该物质的浓度和

7、液层的厚度成正比。的浓度和液层的厚度成正比。 l双光束扫描双光束扫描l扫描范围：扫描范围：190nm800nml常量池（常量池（3ml）和微量池）和微量池（50120ul）配置）配置lUV Probo软件操作系统软件操作系统在操作系统控制下，可在操作系统控制下，可完成紫外可见光谱扫描、完成紫外可见光谱扫描、动力学测定、单波长和多动力学测定、单波长和多波长的定量分析、数据图波长的定量分析、数据图形处理以及规范化报告生形处理以及规范化报告生成。成。 岛津岛津24502450型紫外可见分光光度计型紫外可见分光光度计2 2、仪器、仪器3 3、紫外、紫外- -可见分光光度法定量方法可见分光光度法定量方法

8、 对照品比较法对照品比较法 吸收系数法吸收系数法 标准曲线法标准曲线法 适用对象适用对象: : 生药中大类成分的含量测生药中大类成分的含量测 定，如总黄酮、总蒽醌、总生物碱等。定，如总黄酮、总蒽醌、总生物碱等。 4、应用、应用 槐花（米）中总黄酮的比色法测定：槐花（米）中总黄酮的比色法测定：药材提取物亚硝酸钠硝酸铝氢氧化钠药材提取物亚硝酸钠硝酸铝氢氧化钠500 nm处测定处测定平贝母中总生物碱的含量测定平贝母中总生物碱的含量测定酸性染料比色法酸性染料比色法药材药材总生物碱总生物碱pH5溴百里香酚蓝溴百里香酚蓝 比色法测定比色法测定412 nm二、色谱法二、色谱法(Chromatography)

9、(Chromatography) 薄层色谱法薄层色谱法 (thin layer chromatography, TLC) 气相色谱法气相色谱法 (gas chromatography, GC) 高效液相色谱法高效液相色谱法 （high performance liquid chromatography, HPLC）（一）薄层色谱法(thin layer chromatography, TLC) 薄层板薄层板 (plate)(plate) 点样点样 (loading)(loading) 展开展开 (developing)(developing) 显色与检视显色与检视(visualization

10、& detection)(visualization & detection) 记录记录 (recording)(recording)1、TLC一般操作程序一般操作程序在计算机控制下，在计算机控制下，可自动完成点样可自动完成点样展开显色扫描展开显色扫描照像彩色图片照像彩色图片输出等一整套工作输出等一整套工作程序程序。瑞士瑞士CAMAG薄层色谱扫描仪薄层色谱扫描仪2、TLC仪器仪器中国药典中国药典(2010(2010年版年版) )一部一部薄层色谱法用于定性鉴别的达薄层色谱法用于定性鉴别的达20002000多项。多项。 多用于鉴别、限量检查多用于鉴别、限量检查: : 3、TLC的应

11、用的应用斑点颜色、斑点颜色、R Rf f值值 依据依据 简便、快速、适应性广、简便、快速、适应性广、可操作性强可操作性强 优势优势 薄层扫描法定量（薄层扫描法定量（TLCS）3、TLC的应用（定量分析）的应用（定量分析）酸枣仁中酸枣仁皂苷酸枣仁中酸枣仁皂苷A A、B B的的TLCSTLCS法测定法测定3、TLC的应用（定量分析）的应用（定量分析）薄层色谱紫外可见分光光度法定量薄层色谱紫外可见分光光度法定量 （TLC-UV）点样点样展开展开定位定位刮板刮板洗脱洗脱UV测定测定（二）高效液相色谱法（二）高效液相色谱法 （high performance liquid chromatography,

12、 HPLC）1、HPLC仪仪Agilent 1100 Series HPLC Systems l 硅胶硅胶-正相色谱正相色谱 l 化学键合硅胶化学键合硅胶 -反相色谱反相色谱 l 离子交换填充剂离子交换填充剂 -离子交换色谱离子交换色谱 l 凝胶凝胶-分子排阻色谱分子排阻色谱 l 手性键合填充剂手性键合填充剂-对映异构体拆分对映异构体拆分 色谱柱色谱柱2、HPLC仪组成仪组成l 紫外检测器紫外检测器(ultraviolet detector, UVD)l 二极管阵列检测器二极管阵列检测器(diode array detector, DAD)l 荧光检测器荧光检测器(fluorescence d

13、etector, FLD)l 电化学检测器电化学检测器(electrochemical detector, ECD) 选择性检测器选择性检测器检测器检测器2、HPLC仪组成仪组成l示差折光检测器示差折光检测器(refractive index detector, RID)l蒸发光散射检测器蒸发光散射检测器(evaporative light-scattering detector, ELSD)l质谱检测器质谱检测器(mass spectrometrical detector, MSD) 通用型检测器通用型检测器 检测器检测器2、HPLC仪组成仪组成Alltech 2000 蒸发光散射检测器蒸发

14、光散射检测器Agilent 液质联用仪液质联用仪3、HPLC定性方法定性方法min01020304050mAU010203040506070三个定性参数三个定性参数:t:tR R值、值、UVUV、MSMSnm200225250275300325350375mAU0255075100125150UVm/z100200300400020406080100 211.1 189.1 399.2 227.1M+Na+M+K+2M+Na+M+H+MS 内标校正因子法：内标校正因子法： 外标法：外标法： 面积归一化法：纯度检测面积归一化法：纯度检测u中国药典中国药典(2010年版）一部应用年版）一部应用HP

15、LC法测定含量的中药品种达法测定含量的中药品种达1700余余项。项。u HPLC优势：优势：4、HPLC定量方法定量方法5 5、HPLCHPLC的应用的应用OCOOCH3OGlcHHHO7-epi-loganin (1)OOOOGlcHHsweroside (2)OCOOCH3OGlcHHHOloganin (3)OOOGlcOHHCH3O7-epi-vogeloside (4)OHOGlcCOOCH3HHOOCsecoxyloganin (5)02468101214L. japonicaL. dasystylaL. hypoglaucaL. confusa7-epi-loganinswero

16、sideloganin7-epi-vogelosidesecoxyloganin 1. 金丝桃苷；2. 异槲皮苷 1. 金丝桃苷；2. 异槲皮苷1. 金丝桃苷；2. 异槲皮苷Agilent Agilent 6890N6890N型气相色谱仪型气相色谱仪（三）气相色谱法（三）气相色谱法（Gas chromatography, GCGas chromatography, GC）1、GC仪仪 载气：载气：H2、N2、 He 进样系统：溶液直接进样或顶空进样进样系统：溶液直接进样或顶空进样 色谱柱：弹性石英毛细管柱色谱柱：弹性石英毛细管柱 柱温箱柱温箱 ：恒温和程序升温：恒温和程序升温 检测器检测器 ：

17、2、GC仪组成仪组成l弹性石英毛细管柱弹性石英毛细管柱l不锈钢填充柱不锈钢填充柱涂壁毛细管柱涂壁毛细管柱载体涂层毛细管柱载体涂层毛细管柱2、GC仪组成仪组成色谱柱色谱柱检测器检测器u火焰离子化检测器火焰离子化检测器(flame ionization detector , FID) u热导检测器热导检测器(thermal conductivity detector, TCD)u氮磷检测器氮磷检测器(nitrogen-phosphorus detector, NPD)u火焰光度检测器火焰光度检测器(flame photometric detector , FPD)u电子捕获检测器电子捕获检测器(e

18、lectron capture detector , ECD)u质谱检测器质谱检测器(mass spectrometric detector, MSD) 2、GC仪组成仪组成3 3、GCGC定性方法定性方法两个定性参数两个定性参数:t:tR R值、值、MSMS4、GC定量方法定量方法内标校正因子法内标校正因子法 外标法外标法 面积归一化法面积归一化法标准溶液加入法标准溶液加入法 中国药典中国药典(2010(2010年版年版) )气相色谱气相色谱法用于中药分析的品种有法用于中药分析的品种有5050余种。余种。 5、GC法的应用法的应用Pogostemon cablin中中patchouli al

19、cohol、pogostone的测定的测定l高效毛细管电泳高效毛细管电泳 (high performance capillary electrophoresis, HPCE) l毛细管电色谱毛细管电色谱 (capillary electrochromatography，CEC） l液相色谱与核磁共振联用液相色谱与核磁共振联用 (LC-NMR)l LC/NMR/MS （四）其他色谱法（四）其他色谱法（Miscellaneous chromatography）HPCEHPLC-MS三、定量分析方法的方法学验证三、定量分析方法的方法学验证( (Validation of the analytical

20、 method) ) l目的：目的：证明采用的分析方法适合于相应检证明采用的分析方法适合于相应检 测要求。测要求。 l方法验证用于：方法验证用于： 建立新的分析方法时建立新的分析方法时原分析方法进行修订时原分析方法进行修订时 ( (一一) )验证内容验证内容线性及范围（线性及范围（linearity and range ）准确度准确度(accuracy)专属性（专属性（specificity）精密度（精密度（precision） 重复性（重复性（repeatability） 重现性（重现性（reproducibility） 检测限及定量限（检测限及定量限（limit of detection

21、and quantification）耐用性耐用性 (robustness) 1、线性（、线性（linearity）和范围（）和范围（range ） 线性线性是指在设计的范围内，测试结是指在设计的范围内，测试结果与试样中被测物质浓度直接呈正果与试样中被测物质浓度直接呈正比关系的程度。比关系的程度。 范围范围系指能达到一定精密度、准确系指能达到一定精密度、准确度和线性，测试方法适用的高低限度和线性，测试方法适用的高低限浓度或量的区间。浓度或量的区间。 ( (二二) )实验设计实验设计线性（linearity）和范围（range ）Verticine 8.1 Y=0.0945X-0.0437 0.

22、998 1.0-27.4Analytes tR Calibration curve r2 test range mg/mlVerticinone 9.1 Y=0.1006X-0.1036 0.998 0.9-23.7线性（linearity）和范围（range ）0510152025300.00.51.01.52.02.53.03.54.0verticinoneConcentration (mg/ml)Difference of peak area ratio2 2、准确度、准确度(accuracy)(accuracy) 准确度准确度系指用该方法测定的结果与真系指用该方法测定的结果与真实值或参

23、考值接近的程度，一般用回实值或参考值接近的程度，一般用回收率收率()表示表示 ； 回收率回收率% =（实测值（实测值-供试品所含被测供试品所含被测成分量）成分量）/加入对照品量加入对照品量 对照品药材量（g）药材中对照品含量(mg)加入量(mg)测得总量(mg)回收率(%)平均回收率(%)RSD(%) 贝母素乙 1.00550.67870.66401.325397.4100.42.941.00040.67530.66401.34391.00020.67510.66401.35741.00050.67530.66401.33891.00060.67540.66401.320497.11.0002

24、0.67510.66401.3698104.6准确度(accuracy)-加样回收率100.7102.899.9对对照照品品药材量药材量（g）药材中对照药材中对照品含量品含量(mg)加入量加入量(mg)测得总测得总量量(mg)回收率回收率(%)平均平均回收回收率率(%)RSD(%) 丹丹酚酚酸酸B0.15018.7252高高9.9718.88101.8100.92.62.60.15008.719410.0118.98102.50.15028.731010.0518.92101.40.14998.7136中中17.53101.80.15018.725217.60102.60.15038.7368

25、17.63100.00.14988.7078低低6.9715.98104.30.15018.72526.5615.1497.80.14998.71366.6715.1095.7准确度(accuracy)-加样回收率8.668.658.893 3、专属性、专属性（specificity）l专属性专属性系指在其他成分可能存在时，采系指在其他成分可能存在时，采用的方法能正确测定出被测物的特性。用的方法能正确测定出被测物的特性。l专属性常用的试验方法专属性常用的试验方法: : 空白阴性对照试验空白阴性对照试验 比较同一分析系统对照品与供试品相应色谱比较同一分析系统对照品与供试品相应色谱 峰的吸收光谱峰

26、的吸收光谱 色谱色谱- -质谱联用验证待测成分质谱联用验证待测成分min05101520253035mAU020406080min5101520253035mAU0510152025忍冬苷忍冬苷 木犀草苷木犀草苷 芦丁芦丁金丝桃苷金丝桃苷木犀草苷木犀草苷忍冬苷忍冬苷金丝桃苷金丝桃苷芦丁芦丁20052005年版中国药典分离条件下木犀草苷与忍冬苷共流出年版中国药典分离条件下木犀草苷与忍冬苷共流出对照品对照品金银花中忍冬苷（金银花中忍冬苷（MW594)MW594)和木犀草苷和木犀草苷(MW448)(MW448)提取离子流图提取离子流图忍冬苷忍冬苷木犀草苷木犀草苷MW594MW448新方法新方法(20

27、10(2010年版中国药典年版中国药典) )对照品的分离图对照品的分离图min510152025303540mAU 050100150200250芦丁芦丁金丝桃苷金丝桃苷绿原酸绿原酸忍冬苷忍冬苷木犀草苷木犀草苷min0102030mAU0100200300400500 DAD1 B, Sig=286,8 Ref=400,100, TT (G:08102607.D)min0102030mAU0100200300400500 DAD1 B, Sig=286,8 Ref=400,100, TT (G:08102608.D)nm225250275300325350375nm22525027530032

28、5350375对照品样品UVMSUVMS采用采用HPLC-DAD-MS联用技术，联用技术，测定待测色谱峰的紫外吸收光谱及质谱来判测定待测色谱峰的紫外吸收光谱及质谱来判断色谱峰的纯度，确保分析方法的专属性。断色谱峰的纯度，确保分析方法的专属性。4、精密度（、精密度（precision） 精密度精密度是指在规定的测试条件下，同是指在规定的测试条件下，同一个均匀供试品，经多次取样测定所一个均匀供试品，经多次取样测定所得结果之间接近的程度。精密度通常得结果之间接近的程度。精密度通常包括以下三个方面的含义：包括以下三个方面的含义： 重复性重复性(repeatability) 中间精密度中间精密度(int

29、ermediate precision) 重现性重现性 (reproducibility) 中间精密度表示方法中间精密度表示方法p日内精密度日内精密度(intra-day variability)p日间精密度日间精密度(inter-day variability)浓度浓度日内精密度（日内精密度（n=6)日间精密度（日间精密度（n=3)峰面积（峰面积（X）XSDRSD(%)峰面积（峰面积（X）XSDRSD(%)137 m mg/mL6265.06373.3751.26351.86351.3681.16299.76385.36282.46400.96431.36419.76457.627.4m m

30、g/mL1315.81302.3131.01294.81322.6312.41317.21284.01316.51291.41299.41356.61305.813.7m mg/mL489.3493.53.80.76490.0498.6142.9490.5493.3490.6497.4498.7515.2492.0重复性重复性（repeatability） 重复性重复性是指在同一条件下对同一是指在同一条件下对同一批样品，从样品供试品制备开始，批样品，从样品供试品制备开始，制备至少六份以上供试品溶液制备至少六份以上供试品溶液(即即n6)，或设计，或设计3个不同浓度，每个个不同浓度，每个浓度各分别

31、制备浓度各分别制备3份供试溶液，份供试溶液，进行测定，计算其含量的平均值进行测定，计算其含量的平均值和相对标准偏差和相对标准偏差(RSD)。样品质量样品质量(g)丹酚酸丹酚酸B（）（）丹参酮丹参酮A（）（）高高0.50055.74850.03250.45400.00230.50045.65140.06430.45940.00210.49995.77630.00820.45290.0007中中0.30035.86470.01350.45750.00110.30035.71120.03530.45390.00290.30065.69470.02320.44300.0021低低0.19995.861

32、80.07040.47510.00230.20056.02390.01170.44890.00290.20015.98380.05090.45020.0096平均值平均值SD(%)5.81290.12980.45500.0090RSD(%)2.22.0重现性重现性（reproducibility） 重现性重现性是指在不同的实验室由不是指在不同的实验室由不同分析人员测定结果的精密度。同分析人员测定结果的精密度。当分析方法将被法定标准采用时当分析方法将被法定标准采用时应进行重现性实验。应进行重现性实验。 3批月季花样品中金丝桃苷、异槲皮苷的含量批月季花样品中金丝桃苷、异槲皮苷的含量样品样品来源来源中国药科大学结果中国药科大学结果江苏省药检所结果江苏省药检所结果相对偏差（相对偏差（%）金丝桃苷金