分子生物学复习

1、 分子生物学 复习中心法则DNARNA蛋白质复制转录翻译逆转录RNA复制Part A. 复制复制通论n1.半保留复制n2.半不连续复制n3.复制起点固定, 双向, 等速复制. n4.复制中的信号: (1)复制 起点: 原核ori, 真核ARS (2) 复制终点 原核和真核复制的主要差异n复制起点( 原核1, 真核多);n复制次数(原核多次, 真核1次)n真核S期复制, 端粒的复制 复制的几种特殊形式复制的几种特殊形式n环状DNA复制 (1) 型 -双向, 大肠杆菌(正常); (2) 滚环型-单向,切割, X174; (3) D-环型-单向, 线粒体.n病毒中存在全保留复制方式, 逆转录复制方式

2、.复制中信号保真复制中信号保真 (原核为例原核为例)n1. 复制中, 复制酶35外切酶的矫正功能;n2. 复制后的二次矫正( 母链甲基化).DNA的转座的转座n转座: 染色体上可自主复制和移动一段核酸序列.n分类(1) 复制性转座( TnA)-拷贝(2) 非复制性转座( IS )-整个移动 1.很小,1kb 左右,编码转座酶; 2.末端有倒置重复序列,其外侧还有一小段正置重复序列(转座时, 复制靶序列形成) 3.,特定IS,靶序列一样; 不同IS,靶序列不一样Part B. 转录转录转 录 通 论一一. RNA转录的一般过程转录的一般过程 1.模板识别 2.转录起始 3.通过启动子 4.转录的

3、延伸 5.终止二二.转录的原料转录的原料: 1.RNA聚合酶; 2.双链DNA模板; 3. NTPs ; 4.辅助因子三三. 转录的方向转录的方向: 5 3 (模板链 / 编码链)四四. 转录中模板上的信号转录中模板上的信号: (保守序列保守序列) 启动子( promotor), 终止子( terminator) 调控序列( 操纵子 operator, 增强子 enhancer )五.不对称转录一.原核生物转录的特点 RNA聚合酶聚合酶( 2 ): 全酶全酶 = 核心酶核心酶 + 提高酶与启动子序列的亲和力(103),降低与非特异序列的亲和力(104),启动子（启动子（promoter）nPr

4、ibnow box即即 -10 boxn-10 box与与-35 box的最佳距离为的最佳距离为17 1 bpn+1 一般为一般为A (mRNA转录起始点转录起始点)n越接近保守序列越接近保守序列, 起动子越强起动子越强.转录终止 (终止子)(1)不依赖于不依赖于 因子的终止因子的终止强终止子强终止子 =“ 一段反向互补序列一段反向互补序列 “ + “一段富含一段富含T的区域的区域”(2)依赖于依赖于 因子的终止因子的终止.; 弱终止子弱终止子 =“ 一段反向互补序列一段反向互补序列 “ 不依赖于不依赖于 因子的终止因子的终止依赖于依赖于 因子的终止因子的终止二.真核生物mRNA转录nRNA聚

5、合酶IInII类启动子:增强子(沉默子)n无方向, 位置, 距离的限制n具有组织特异性n有时两者可相互转换.n不属于启动子, n能调节基因的转录.n起动子,增强子与沉默子都属于顺式作用元件.真核生物的转录因子n起始,延伸, 终止都需要因子的帮助.(与原核转录的区别)n分为: (1) 通用转录因子-都需要 (2) 基因特异转录因子-调控转录起始转录起始转录终止n没有明确的终止子,但有终止信号n转录会在AATAAA下游0.5-2kb处终止(AATAAA下游15-30bp加PolyA)前体前体mRNA的加工的加工(时序性时序性)n(1) 5加帽 (转录早期进行30 nt)n(2) 3加尾 (前体mR

6、NA加polyA)n (3) 切除内含子n (4) 编辑和修饰 5 cap的特殊结构和功能的特殊结构和功能n3 m7GpppNmNm-3 (G的方向与的方向与N的方向相反的方向相反,通过通过5-5相连相连)功能功能: (1) 保护mRNA (2) 提高翻译能力（效率） (3) 有利于mRNA在细胞内的运输（运出细胞核） (4) 使mRNA前体的能正确剪接 (第一个内含子)npoly(A)的功能(1) 保护保护mRNA：延长其寿命（半衰期）(2) 提高提高mRNA的翻译能力的翻译能力：能与poly(A)结合蛋白 结合，促进翻译，促进mRNA与核糖体结合(3) poly(A)能促进最后一个内含子的

7、剪接能促进最后一个内含子的剪接(3) RNA剪接（剪接（RNA splicing）n剪接信号(属于内含子的边界) 主要: GU-AG (剪切体) 次要: AU-AC 自我剪切的I, II内含子n剪接体: snRNAs (核小分子RNA)参与特殊剪接方式n选择性剪接选择性剪接: 一个基因转录出来的RNA前体，通过不同的剪接方式（选择不同的外显子）而形成不同的成熟mRNA，产生不同的蛋白质n反式剪接反式剪接: 参与剪接的外显子并不在同一个基因中（即在不同的RNA分子中）RNA编辑n在特定位点: 改变,插入,删除核苷酸.n在转录后进行，沿3 5方向进行;n由gRNA（guide RNA，向导RNA）

8、指导进行;n因是RNARNA, 存在 G-U 配对.Part C. 翻译翻译蛋白翻译通论n一.合成过程n1. 翻译的起始-2. 肽链的延伸-3. 肽链的终止及释放n二. 蛋白质生物合成体系n 1、mRNA; 2、核糖体; 3、tRNA; 4、起始因子、延长因子和终止因子; 5、氨基酰-tRNA 合成酶n三.氨基酸的活化与搬运n AA-tRNAn四. 蛋白质前体的加工, 折叠n五. 蛋白的定向转运n六. 蛋白的降解密码子的特点密码子的特点n遗传密码：遗传密码：三联体密码三联体密码n遗传密码的特点：遗传密码的特点：n连续性连续性n有起始密码有起始密码(AUG, (AUG, (原核中也用原核中也用G

9、UG)GUG)和终止密码和终止密码(UAA,UAG,UGA)(UAA,UAG,UGA)n简并性简并性n摆动性摆动性n通用性通用性n偏好性偏好性 tRNA反密码子碱基反密码子碱基IUG mRNA密码子碱基密码子碱基A,C,UA,GC ,U密码子与反密码子配对的摆动现象密码子与反密码子配对的摆动现象核糖体A A位位P P位位大大亚亚基基小小亚亚基基m mR RN NA AtRNA：接合器n一种一种tRNA只能与一种氨基酸结合，一种氨基酸可与几种只能与一种氨基酸结合，一种氨基酸可与几种tRNA结合。结合。(tRNA数目数目20)n结合位点为：结合位点为：3端端CCA-OH。nAla-tRNAala;

10、n起始起始tRNA fmet-tRNAfmet： (原核生物）原核生物） Met-tRNAimet 起始起始tRNA (真核生物）真核生物）n met-tRNAemet;携带延长中的肽链上的蛋氨酸携带延长中的肽链上的蛋氨酸(真核生物）真核生物）tRNA的二级结构的二级结构 和三级结构和三级结构三叶草型三叶草型倒倒 L 型型氨基酰-tRNA合成酶n既能识别特定的氨基酸，又能识别转运该氨基酸的tRNA。n氨酰tRNA合成酶的专一性很高，共有20种，每一种只用于单一种氨基酸与相应tRNA的结合 (氨基酸专一, tRNA有多个).n氨基酸+ATP+tRNA 氨基酰-tRNA +AMP +PPin氨基酰

11、-tRNA合成酶可发挥较对功能，使误载的氨基酰-tRNA从tRNA上释下，保证遗传信息翻译的准确性。n1. tRNA装载装载 在氨酰tRNA合成酶（aminoacyl-tRNA synthetase）的作用下，使氨基酸连接到tRNA 3端的腺苷酸上，形成氨酰tRNA (fmet-tRNA)n2. 核糖体解离核糖体解离n翻译起始复合物首先是在核糖体小亚基上组装起来n每一次翻译后，核糖体的大小亚基必须解离，以让新的翻译起始复合物形成n核糖体解离需要起始因子（initiation factors，IF）的协助原核生物的蛋白翻译原核生物的蛋白翻译n3. mRNA与小亚基结合。 AUG上游上游813个碱

12、基处存在个碱基处存在SD序列能与小亚基中序列能与小亚基中16S rRNA 3端端序列互补序列互补。n4、fmet-tRNA的结合： fMet-tRNA进入小亚基的P位, 反密码子与mRNA起始密码子配对; n5、大亚基结合n6. 延伸延伸Step 1：进位 (注册) (1) 一个新的氨酰tRNA结合到核糖体的A位 (2) 校对（proofreading）:如错误的氨酰 tRNA进入了A位 （反密码子与密码子不能很好配对），可进行校正. Step 2：转肽 大亚基的23S rRNA, 肽基转移酶, 形成肽键Step 3：移位nmRNA与肽基tRNA（peptidyl-tRNA）移动1个密码子的距

13、离，使肽基tRNA进入P位，而原在P位的tRNA离开核糖体n7. 终止终止(1) 翻译到达终止密码子终止密码子后，释放因子及GTP结合到核糖体的相应位点，促使肽链与tRNA的连结断开(2) 接着释放因子和tRNA从核糖体解离(3) 最后，核糖体与mRNA解离，核糖体大小亚基解离真核生物蛋白质合成的特点n起始阶段（1）在核内合成mRNA前体，加工并与多种蛋白质结合成核蛋白颗粒，转入胞浆。起始时其二级结构需要松解，并放出多余的蛋白质。（2）Met-tRNAiMet（3） 起始复合物：40S-mRNA-Met-tRNAiMet（4）没有SD序列。5cap 和3 ployA参与形成翻译起始复合物.起始

14、密码子的寻找-扫描模型模型n扫描（scanning）n找到起始密码子后，再加上核糖体大亚基，就可开始翻译n第一个AUG不一定是起始密码n与在其周围，往往有共同序列Kozak 序列CCRCCAUGG (R,嘌呤)n还与高级结构有关（1）N末端的甲酰甲硫氨酸（原核）或甲硫氨酸（真核）的切除; （2）二硫键的形成二硫键的形成（3）修饰：磷酸化、糖基化、甲基化、乙基化、羟基化等）修饰：磷酸化、糖基化、甲基化、乙基化、羟基化等（4）多聚蛋白前体的切割）多聚蛋白前体的切割, 切除新生肽链中非功能片段切除新生肽链中非功能片段, 信号肽的处理信号肽的处理.（5）蛋白质剪接：除去蛋白质内含子（）蛋白质剪接：除去

15、蛋白质内含子（intein） (6) 新生肽链的折叠 (7) 亚单位聚合肽链的翻译后加工蛋白的定向转运机制n1.信号肽假说n(1)分泌蛋白 翻译-转运同步机制n(2)细胞器(叶绿体, 线粒体等) 翻译后转运机制n(3)膜蛋白(ER等) 两者兼有n(4)核定位 翻译后转运机制n2. 信号肽, 导肽, 核定位信号的特点蛋白质的降解n细菌: Lon蛋白酶n真核: 泛素(ubiquitin) 降解n(1) 泛素, 76氨基酸;n(2) 成熟蛋白N端第一个氨基酸严重影响蛋白的寿命.(精氨酸,赖氨酸最不稳定, 2-3min)n(3)需要E1, E2, E3三个降解因子参与和ATP.n(4)泛素标记后, 运

16、送到蛋白降解体系降解.Part D. 基因表达调控基因表达调控基因表达调控通论n基因表达的时间性及空间性基因表达的时间性及空间性n基因表达方式基因表达方式 （1）管家基因与奢侈基因）管家基因与奢侈基因 （2）诱导和阻遏表达）诱导和阻遏表达n基因表达的调控方式：基因表达的调控方式：多级调控，多级调控， 转录调控最重要转录调控最重要n影响基因表达的因素：影响基因表达的因素： （1）原核）原核: 营养状况营养状况, 环境因素环境因素; （2）真核）真核: 激素水平激素水平, 发育阶段发育阶段.一. 原核生物基因表达的调控n转录与翻译相耦联。n分为：（1） 转录水平的调控：转录水平的调控：操纵子操纵子

17、 （2）翻译水平的调控）翻译水平的调控n启动子对转录的影响启动子对转录的影响 （1）启动子决定转录方向及模板链）启动子决定转录方向及模板链 (2) 启动子决定转录效率启动子决定转录效率 n原核基因 转录水平转录水平 的调控操纵子 =启动子 + 操纵基因 + 结构基因转录的调控机制n1.负转录调控 (1) 负控诱导: (2) 负控阻遏:n2.正转录调控 (1)正控诱导: (2)正控阻遏:A. 负控诱导:细菌中的转录调控系统细菌中的转录调控系统转录的调控机制 (范例)n乳糖操纵子调控的机制 (分解代谢)n色氨酸操纵子的调控机制(合成代谢)mRNA-半乳糖苷乙酰转移酶-半乳糖苷通透酶-半乳糖苷酶翻译

18、转录无活性的阻遏蛋白诱导物阻遏蛋白阻遏物蛋白亚基有诱导物时lac ALac YLac ZOPi基因CAPcAMPCAP-cAMPRNA聚合酶阻遏蛋白 阻遏物蛋白亚基无诱导物时lac ALac YLac ZOPi基因-35-100CAPcAMPORNA聚合酶结合无葡萄糖:有葡萄糖:cAMPcAMP(促进转录)(不促进转录)色氨酸操纵子(The trp Operon)ntrp操纵子阻遏型操纵子The more stable structureThe less stable structure前导肽的翻译 (转录翻译偶联)A A位位P P位位大大亚亚基基小小亚亚基基m mR RN NA A衰减子形成

19、的动态特征翻译水平的调控n（一）、（一）、 SD 序列对翻译的影响序列对翻译的影响 n（二）、核糖体合成反馈抑制（二）、核糖体合成反馈抑制 n（三）、（三）、 mRNA 的稳定性的稳定性 n（四）、反义（四）、反义 RNA(antisense) 的调控的调控 n (五) 稀有密码子n (六) 重叠基因二.真核生物基因表达的调控nDNA水平的调控水平的调控*n转录水平的调控转录水平的调控n转录后水平的调控转录后水平的调控*n翻译水平的调控翻译水平的调控n翻译后水平的调控翻译后水平的调控*DNA水平的调控n染色质的丢失染色质的丢失n基因扩增基因扩增n基因重排基因重排nDNA甲基化甲基化 (表达降低

20、表达降低, X染色体失活中心染色体失活中心)n染色体结构染色体结构 (常染色质常染色质 和和 异染色质异染色质)转录水平的调控-最重要n转录起始转录起始n顺式作用元件顺式作用元件 和和 反式作用因子反式作用因子;n以正调控为主以正调控为主反式作用因子特点n三个功能结构域：三个功能结构域： (1) DNA识别结合域；识别结合域； (2) 转录活性域转录活性域 (3) 结合其他蛋白的结合域结合其他蛋白的结合域n能识别并结合顺式作用元件能识别并结合顺式作用元件n正调控与负调控正调控与负调控反式作用因子结构域的模式nDNA结合域结合域n转录活化结构域转录活化结构域(1) 酸性酸性-螺旋结构域螺旋结构域

21、(2) 富含谷氨酰胺结构富含谷氨酰胺结构域域(3) 富含脯氨酸结构域富含脯氨酸结构域(1) 锌指结构锌指结构(2) 螺旋螺旋-转角转角-螺旋螺旋(HTH)(3) 亮氨酸拉链亮氨酸拉链(4) 螺旋螺旋-环环-螺旋螺旋(HLH)(5) 碱性碱性螺旋螺旋转录起始的调控n反式作用因子的活性调节反式作用因子的活性调节n反式作用因子与顺式作用元件反式作用因子与顺式作用元件, 通过成环等方式通过成环等方式调控调控n反式作用因子间存在组合式调控反式作用因子间存在组合式调控.(1) 合成后即有活性：需要时合成，可迅速降解(2) 共价修饰：磷酸化-去磷酸化，糖基化(3) 配体结合：如激素与受体的结合(4) 蛋白质

22、与蛋白质相互作用：二聚体转录后水平的调控nmRNA的选择性剪接 mRNA 运输的控制n转录后的基因沉默*（RNA干涉, RNAi）翻译水平的调控n翻译起始的调控翻译起始的调控: (1) 激活隐蔽mRNA (2)阻遏蛋白的调控 (3)翻译起始因子的调控 (4) 5AUG对翻译的调控作用 (5) mRNA5 端非编码区长度对翻译的影响nmRNA稳定性调节稳定性调节n小分子小分子RNA对翻译水平的影响对翻译水平的影响翻译后水平的调控n新生肽链的水解新生肽链的水解: 肽链肽链N端的第一个氨基酸决定蛋白的半衰期端的第一个氨基酸决定蛋白的半衰期n肽链中氨基酸的共价修饰肽链中氨基酸的共价修饰: 磷酸化磷酸化

23、*、甲基化、酰基化、甲基化、酰基化n通过信号肽分拣、运输、定位通过信号肽分拣、运输、定位Part E. 分子免疫学分子免疫学n1.非特异性免疫细胞 (与抗原无关) 天然杀伤细胞 ( NK细胞 )n2.特异性免疫细胞 (1) B细胞-产生抗体, 体液免疫 (2) T细胞 -细胞免疫.抗原的性质: 免疫原性 + 反应原性 = 完全抗原(仅有) 反应原性 = 半抗原 (用于检测)(仅有) 免疫原性 = X抗原表位n1. B细胞抗原表位-抗体识别位点（）位于分子表面(亲水）（）包括线形表位和非线形表位（空间构型）（）8氨基酸T细胞抗原表位-细胞免疫识别位点（）可位于分子内部（）都是线形表位（连续氨基酸

24、序列）（）CD8+ : 91 氨基酸 (与MHC I结合呈递)CD4+: 氨基酸 (与MHC II结合呈递)B细胞抗原表位二抗体n四肽链结构,两条重链（H）和两条轻链（L）n重链稳定区的分子结构: 分为五类：IgG、IgA、IgM、IgD、IgE;n轻链可分为两型：、型n三个高变区与抗原表位结合n木瓜蛋白酶水解IgG 得到两个相同的Fab段和一个Fc段。免疫球蛋白的特性与功能n结合特性: n (1) 抗原结合特性-高变区n (2) 补体 结合特性- 重链保守区n (3) 与NK细胞表面受体作用n *其它: 与二抗作用(重链保守区)n Protein A, protein G (重链保守区)2.

25、 生物功能: (本身仅有结合活性,发挥功能需要其它分子,细胞参与) (1) 清除异源细胞- 补体参与, 破坏细胞; ADCC:抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用 调理作用 (2) 清除异源分子-调理作用 (3) 中和作用, 封闭受体结合位点. (病毒) (4)通过胎盘, 被动免疫 (IgG)抗体的个性IgG (1) 血液中最主要的免疫球蛋白(75%) (2) IgG是唯一能通过胎盘的抗体IgM (1) 为五聚体，是分子量最大的Ig (2) IgM是个体发育过程最早能产生的抗体 (3) IgM是抗原刺激后出现最早的抗体，故检测IgM水平可用于传染病的早期诊断lgA 主要存在于初乳、唾液、泪液，以及呼吸道消化道和泌尿生殖道黏膜表面的分泌液中抗体多样性的遗传学基础n1.基因重排 (随机不精确): (1)轻链V 区重排: VL-JL (2)重链V区重排: VH-DH-JHn 2. VDJ基因片段的多样性, 基因重排的多样性 轻链重链相互随机配对 重链V区的N区随机插入VH-N-DH-N-JH 体细胞突变(B细胞V基因区突变)一种B细胞只表达一种特异抗体n等位排斥: 两条同源染色体上的免疫球蛋白等位基因,只有一条表达.n同型排斥: 轻链表达,只生成一种链(、), 不能同时表达链和链.n多克隆抗体 多个抗原决定基机体多种抗体的混合物n单克隆抗体（monoclonal antibody）