第10章—液相色谱法

1、注：自带护肤品（高效液相色谱法）注：自带护肤品（高效液相色谱法）离子色谱法离子色谱法1月月6日日(星期日星期日)补补1月月3日（星期四）的课程日（星期四）的课程 第十章第十章 高效液相色谱法高效液相色谱法High Performance Liquid Chromatography, HPLC一、一、HPLC概述概述二、高效液相色谱仪二、高效液相色谱仪三、高效液相色谱法的类型三、高效液相色谱法的类型一、高效液相色谱法概述一、高效液相色谱法概述n气相色谱：气相色谱：流动相为气体流动相为气体n液相色谱：液相色谱：流动相为液体，流动相为液体，70年代以后，在高压下输送流动相，年代以后，在高压下输送流动

2、相，称之为高效液相色谱（高压液相色谱），简称为称之为高效液相色谱（高压液相色谱），简称为HPLC。主要差别：主要差别：n分析对象差别分析对象差别GC（20）：）：能气化、热稳定性好且沸点较低的样品，能气化、热稳定性好且沸点较低的样品，HPLC（80）：）：溶解后能制成溶液的样品，分子量大、难气化、热稳溶解后能制成溶液的样品，分子量大、难气化、热稳定性差及高分子和离子型样品均可检测定性差及高分子和离子型样品均可检测n流动相差别流动相差别 GC：流动相为惰性气体；组分与流动相无作用力，只与固定相作用流动相为惰性气体；组分与流动相无作用力，只与固定相作用 HPLC：流动相为液体（种类多，另可选用不同

3、比例的多种液体作为流流动相为液体（种类多，另可选用不同比例的多种液体作为流动相）；流动相与组分间有亲合作用力，柱选择性好、分离效果佳动相）；流动相与组分间有亲合作用力，柱选择性好、分离效果佳n操作条件差别操作条件差别 GC：加温操作加温操作 HPLC：室温；高压室温；高压二、高效液相色谱仪二、高效液相色谱仪高效液相色谱仪简单流程图高效液相色谱仪简单流程图2.1 高压输液系统高压输液系统n贮液器：贮液器：贮存流动相，由玻璃、不锈钢或氟塑料作成（贮存流动相，由玻璃、不锈钢或氟塑料作成（0.52L）n高压泵高压泵： 作用：将贮液器中的流动相以作用：将贮液器中的流动相以高压（高压（150350105

4、Pa）形式连形式连续不断地送入柱系统续不断地送入柱系统 性能：高压、恒流、压力变化小、流量范围可调、耐腐蚀、密性能：高压、恒流、压力变化小、流量范围可调、耐腐蚀、密封性好封性好 主要类型：往复式柱塞泵（恒流）主要类型：往复式柱塞泵（恒流）当柱塞推入缸体时，泵头出口（上部）当柱塞推入缸体时，泵头出口（上部）的单向阀打开，同时，流动相进入的的单向阀打开，同时，流动相进入的单向阀（下部）关闭，这时就输出少单向阀（下部）关闭，这时就输出少量的流体。反之，当柱塞向外拉时，量的流体。反之，当柱塞向外拉时，流动相入口的单向阀打开，出口的单流动相入口的单向阀打开，出口的单向阀同时关闭，一定量的流动相就由向阀同

5、时关闭，一定量的流动相就由其储液器吸入缸体中。其储液器吸入缸体中。（内梯度）（内梯度）（外梯度）（外梯度）n梯度洗脱置（程序升温装置）：梯度洗脱置（程序升温装置）： 概念：在分离过程中使用两种或两种以上的不概念：在分离过程中使用两种或两种以上的不同极性的溶液为流动相，通过不断改变它们之间的同极性的溶液为流动相，通过不断改变它们之间的比例，从而使流动相的强度、极性、比例，从而使流动相的强度、极性、pH或离子强度或离子强度相应的改变，从而使各组分以它们的最佳相应的改变，从而使各组分以它们的最佳k值通过值通过色谱柱，色谱柱， 达到高的分离效果。达到高的分离效果。 分类：内梯度和分类：内梯度和外梯度外

6、梯度 LC梯度洗脱与梯度洗脱与GC程序升温的比较程序升温的比较a、 弱溶剂时，弱溶剂时，k大的组分未流出；大的组分未流出；b、强溶剂时，强溶剂时，k小的组分分不开；小的组分分不开；c、中等强度溶剂时，中等强度溶剂时，k小的组分小的组分1，2分不开；分不开； d、梯度洗脱，各组分得到良好的分离梯度洗脱，各组分得到良好的分离2.2 进样系统进样系统n作用：作用：把分析试样有效地送入色谱柱把分析试样有效地送入色谱柱n进样方式：进样方式：微量注射器；进样阀（耐高压的六微量注射器；进样阀（耐高压的六通阀：自动化进样、重现性好）通阀：自动化进样、重现性好）2.3 分离系统（色谱柱）分离系统（色谱柱）n作用

7、：作用： 实现组分的分离实现组分的分离n性能：性能：直形（由不锈钢制成）；内径：直形（由不锈钢制成）；内径：26mm；长度：；长度：1050cm2.3 检测系统检测系统n作用：作用：检测并收集各组分检测并收集各组分n类型：类型：溶质型检测器和总体检测器两种溶质型检测器和总体检测器两种溶质型检测器：溶质型检测器：对被分离组分的物理或物理化学性质有响应，例：对被分离组分的物理或物理化学性质有响应，例：紫外、紫外、DAD、荧光、电化学检测器等荧光、电化学检测器等总体检测器：总体检测器：对试样和洗脱液总的物理或物理化学性质有响应，例：对试样和洗脱液总的物理或物理化学性质有响应，例：示差折光、介电常数检

8、测器等示差折光、介电常数检测器等n 紫外检测器：紫外检测器：应用最广，可用于梯度洗脱，对大部分有机化合物有响应应用最广，可用于梯度洗脱，对大部分有机化合物有响应 光源：光源：低压汞灯，低压汞灯，254或或280nm（固定波长）；氢灯、氘灯，（固定波长）；氢灯、氘灯，200-400nm（ 可调波长）可调波长） 检测池：检测池：很小，（很小，（1mm 10mm ，容积，容积 小于小于10L）；）； 接收元件：接收元件：光电倍增管光电倍增管n 二极管阵列检测器（二极管阵列检测器（DAD)：可可得到所有波长上的色谱信号得到所有波长上的色谱信号 紫外检测器的重要进展；紫外检测器的重要进展； 光电二极管阵

9、列检测器：光电二极管阵列检测器：计算机快速处理，三维立体谱图，如图所示。美国惠普公司美国惠普公司1100型液相色谱仪型液相色谱仪三、三、HPLC的主要类型及分离原理的主要类型及分离原理流动相要求：流动相要求： n 流动相纯度高流动相纯度高 n 不使用会引起柱效损失或保留特性变化的溶剂不使用会引起柱效损失或保留特性变化的溶剂 n 能溶解样品，但不与样品发生反应能溶解样品，但不与样品发生反应n 粘度小，以此提高柱效粘度小，以此提高柱效n 与所选用的检测器匹配与所选用的检测器匹配固定相分类：固定相分类： n 承受压力：刚性固体（可承受高压，以二氧化硅为基质，表面键合承受压力：刚性固体（可承受高压，以

10、二氧化硅为基质，表面键合各种官能团，成化学键合固定相）；硬胶（承受压力低，由聚苯乙烯各种官能团，成化学键合固定相）；硬胶（承受压力低，由聚苯乙烯和二乙基苯交连而成）和二乙基苯交连而成）n 孔隙深度：表面多孔型和全多孔型孔隙深度：表面多孔型和全多孔型液固色谱液固色谱（LSC, liquid-solid adsorption chromatography）固固 定定 相相：固体吸附剂为，如硅胶、氧化铝等，较：固体吸附剂为，如硅胶、氧化铝等，较常使用的是常使用的是510m的硅胶吸附剂。的硅胶吸附剂。流流 动动 相相：各种不同极性的一元或多元溶剂。：各种不同极性的一元或多元溶剂。基本原理基本原理：组分

11、在固定相吸附剂上的吸附与解吸；：组分在固定相吸附剂上的吸附与解吸； 应用：应用：用于分离相对用于分离相对分子量中等的油溶性分子量中等的油溶性物质，另用于分离不物质，另用于分离不同官能团的化合物和同官能团的化合物和异构体。异构体。缺点：缺点：非线性等温吸非线性等温吸附常引起峰的拖尾现附常引起峰的拖尾现象象 （2）应用和缺点应用和缺点脲的取代物与氨基甲酸酯的高速分离脲的取代物与氨基甲酸酯的高速分离硝基苯胺异构体在硝基苯胺异构体在10 m氧化铝上的氧化铝上的LSC分离分离液液分配色谱（液液分配色谱（LLPC) )固定相与流动相均为液体（互不相溶）；固定相与流动相均为液体（互不相溶）；基本原理基本原理

12、：组分在固定相和流动相上的分配；：组分在固定相和流动相上的分配；流流 动动 相相：对于亲水性固定液，采用疏水性流动相，即流动相的极：对于亲水性固定液，采用疏水性流动相，即流动相的极 性小于固定液的极性（性小于固定液的极性（正相正相 normal phase），反之，流），反之，流 动相的极性大于固定液的极性（动相的极性大于固定液的极性（反相反相 reverse phase）。）。 正相与反相的出峰顺序相反；正相与反相的出峰顺序相反；固固 定定 相相：早期涂渍固定液，固定液流失，较少采用；：早期涂渍固定液，固定液流失，较少采用；化学键合固定相化学键合固定相：（将各种不同基团通过化学反应键合到硅胶

13、：（将各种不同基团通过化学反应键合到硅胶 （担体）表面的游离羟基上。（担体）表面的游离羟基上。C-18柱（反相柱）。柱（反相柱）。固定相：固定相：将固定液化学键合于载体（硅胶）表面形成固定相将固定液化学键合于载体（硅胶）表面形成固定相固定相类型：固定相类型：u 极性固定相：正相色谱极性固定相：正相色谱 以极性有机基团如胺基（以极性有机基团如胺基（-NH2）、腈基（）、腈基（-CN）、醚基（）、醚基（-O-）等）等键合在硅胶表面制成的键合在硅胶表面制成的 u 非极性固定相：反相色谱非极性固定相：反相色谱 反相色谱法最常用的固定相是反相色谱法最常用的固定相是C18 （十八烷基硅烷）、（十八烷基硅烷

14、）、 C8 （辛烷（辛烷基）和苯基键合相的填料。基）和苯基键合相的填料。化学键合相色谱化学键合相色谱（CBPC)固定相使用条件：固定相使用条件： 为控制样品在分析过程的解离，常用缓冲液控制流动相的为控制样品在分析过程的解离，常用缓冲液控制流动相的pH值，但值，但需要注意的是，需要注意的是，C18使用的使用的pH值通常为值通常为2.57.5。 太高的太高的pH值会使硅胶溶解，太低的值会使硅胶溶解，太低的pH值会使键合的烷基脱落。值会使键合的烷基脱落。 正相色谱法正相色谱法 反相色谱法反相色谱法 1.极性固定相极性固定相 聚乙二醇、氨基与腈基键合相聚乙二醇、氨基与腈基键合相 2.相对非极性流动相相

15、对非极性流动相 正已烷、环已烷正已烷、环已烷 3.极性调节剂极性调节剂 乙醇、四氢呋喃、三氯甲烷乙醇、四氢呋喃、三氯甲烷 4.分离中等极性和极性较强化合物分离中等极性和极性较强化合物. 酚类、胺类、羰基类及氨基酸类酚类、胺类、羰基类及氨基酸类 5.组分流出顺序组分流出顺序 极性小先洗出极性小先洗出 1.非极性固定相非极性固定相 C18（简称（简称ODS）、）、C8 2.极性流动相极性流动相 水或缓冲液水或缓冲液 3.极性调节剂极性调节剂 甲醇、乙腈、四氢呋喃甲醇、乙腈、四氢呋喃4.分离非极性和极性较弱化合物分离非极性和极性较弱化合物 占整个占整个HPLC应用的应用的80%左右左右 5.组分流出

16、顺序组分流出顺序 极性大先洗出极性大先洗出 IC是是HPLC的一种，是分析水溶液中阴离子的最佳方法。的一种，是分析水溶液中阴离子的最佳方法。 固定相是固定相是离子交换树脂离子交换树脂，流动相是，流动相是淋洗液淋洗液(强电解质强电解质)；电导电导检测器。检测器。 常用的淋洗剂是常用的淋洗剂是Na2CO3-NaHCO3混合液。只要改变两种物混合液。只要改变两种物质的浓度比，就可以得到不同淋洗能力和质的浓度比，就可以得到不同淋洗能力和pH值的流动相。值的流动相。 为消除淋洗液中强电解质背景离子对电导检测器的干扰，设为消除淋洗液中强电解质背景离子对电导检测器的干扰，设置了置了抑制柱或抑制器抑制柱或抑制

17、器。离子色谱法（离子色谱法（IC） 临时过程临时过程 （1）原理：）原理：离离子交换子交换（离子价态和离子半径离子价态和离子半径）淋洗液瓶淋洗液瓶Pump保护柱保护柱分析柱分析柱抑制器装置抑制器装置电导池电导池色谱工作站色谱工作站淋洗液输淋洗液输送送离子交换离子交换分离分离抑制电导抑制电导检测检测数据采集和仪数据采集和仪器控制器控制样品注射样品注射（2 2）离子色谱结构）离子色谱结构检测具有电导性化合物的通用型检测器检测具有电导性化合物的通用型检测器，最常用。，最常用。溶液溶液至至检测检测池池电电极极 检测检测池池w 安装在电导池之前安装在电导池之前w 提高待测离子的电导率提高待测离子的电导率

18、：提高灵敏度提高灵敏度Na+,Cl-H+,Cl-w 降低背景电导降低背景电导 (淋洗液淋洗液)： 减少噪音减少噪音Na+,HCO3-H2CO3Na+,OH-H2O极限摩尔电导值极限摩尔电导值 阳离子阳离子 阴离子阴离子 198 55 46 78 71 80 80（单位单位：S/m 当量当量）350395074735360背景背景： Na2CO3 / NaHCO3(700S)NaF,NaCl,NaNO3Na2HPO4,Na2SO4保留时间保留时间电导电导NaFNaCl NaNO3Na2HPO4Na2SO4背景背景： Na2CO3 / NaHCO3(700S)保留时间保留时间电导电导HFHClHN

19、O3H3PO4H2SO4保留时间保留时间背景背景： H2CO3 (15S)电导电导n 免试剂离子色谱（免试剂离子色谱（Reagent-Free ）：传统离子色谱）：传统离子色谱的问题的问题手工配制淋洗液和再生液手工配制淋洗液和再生液（3）离子色谱的最新发展）离子色谱的最新发展n 离子色谱样品前处理离子色谱样品前处理 常规样品离子分析常规样品离子分析 痕量离子分析痕量离子分析 大体积进样大体积进样在线浓缩在线浓缩 复杂基体中离子的处理复杂基体中离子的处理 预处理小柱预处理小柱n过滤：样品中有颗粒状物质过滤：样品中有颗粒状物质n基体消除：基体消除： * 去除样品中所包含的，有可能损坏仪器或者影响去

20、除样品中所包含的，有可能损坏仪器或者影响 色谱柱色谱柱/抑制器性能的成分抑制器性能的成分 重金属离子、有机大分子重金属离子、有机大分子 * 去除样品中所包含的，有可能干扰目标离子测定去除样品中所包含的，有可能干扰目标离子测定 的成分的成分 高离子强度基体高离子强度基体0.22，0.45um滤膜滤膜去除颗粒状杂质去除颗粒状杂质C18预处理小柱、预处理小柱、 On-Guard RPP柱柱去除有机分子去除有机分子On-Guard H柱柱去除溶液中的金属离子去除溶液中的金属离子On-Guard Ag柱柱去除溶液中的去除溶液中的Cl-离子离子 主要测定高氯物质中的主要测定高氯物质中的NO2-，NO3-等

21、离子等离子On-Guard Ba柱柱去除溶液中的硫酸根去除溶液中的硫酸根水中阴阳离子测定的样品前处理水中阴阳离子测定的样品前处理1.1.纯净水中阴离子测定纯净水中阴离子测定-直接进样直接进样2.2.自来水自来水 地下水中阴离子的测定地下水中阴离子的测定-0.45um-0.45um滤膜过滤膜过滤后直接进样分析滤后直接进样分析3.3.地表水地表水 生活污水中阴离子测定生活污水中阴离子测定-离心过滤后离心过滤后, ,用用C18C18与与0.45um0.45um滤膜过滤后进样分析滤膜过滤后进样分析4.4.工业废水工业废水-离心过滤后离心过滤后, ,用用On-Guard HOn-Guard H柱与柱与0

22、.450.45滤膜过滤进样滤膜过滤进样色谱柱：色谱柱：IonPac AG9-HC, AS9-HC淋洗液：淋洗液：9 mmol/L Na2CO3流速：流速：1 mL/min进样量：进样量：25 L色谱峰：色谱峰： 1. 氟离子氟离子 3mg/L 2. 亚氯酸根亚氯酸根 10 3. 溴酸根溴酸根20 4. 氯离子氯离子6 5. 亚硝酸根亚硝酸根15 6. 溴离子溴离子 25 7. 氯酸根氯酸根 25 8. 硝酸根硝酸根25 9. 磷酸根磷酸根40 10. 硫酸根硫酸根30空间排阻色谱空间排阻色谱（1）分离原理分离原理固定相：固定相：凝胶，含有许多不同尺寸的孔穴凝胶，含有许多不同尺寸的孔穴分离原理：分离原理：基于分子尺寸的大小进行分离，样品组分与固定液间不存在基于分子尺寸的大小进行分离，样品组分与固定液间不存在相互作用现象相互作用现象分离次序：分离次序：分子量大的先排出，分子量小的后排出分子量大的先排出，分子量小的后排出 固定相的排阻极限：因分子量过大而不能部分地进入某一给定固定固定相的排阻极限：因分子量过大而不能部分地进入某一给定固定相孔内的最小的样品粒子的分子量相孔内的最小的样品粒子的分子量 固定相的渗透极限：因分子量过小而能完全进入某一给定固定相最固定相的渗透极限：因分子量过小而能完