植物细胞组织培养的基本技术(总结版)

1、本章主要内容l 商业性组织培养实验室和小工厂的设计与主要设备l 培养基及其配制l 外植体的选择与培养l 试管苗的驯化与移载第一节 商业性组织培养实验室和小工厂的设计与主要设备l 培养皿的清洗；l 培养基的配制、分装和高压灭菌；l 无菌操作材料的表面灭菌和接种；l 将培养物放到培养室培养；l 试管苗的驯化、移栽和初期管理。(一)、洗涤室(cleaning room)l 洗涤室用于完成玻璃器皿等仪器的清洗、干燥和贮存。l 室内配备：l 大型水槽，最好是白瓷水槽。为防止碰坏玻璃器皿，可铺垫橡胶。上下水道要畅通。l 备有塑料筐，用于运输培养器皿。l 备有干燥架，用于放置干燥涮净的培养器皿。(二)、准备

2、室(repairing room)l 完成培养基制备以及试管苗出瓶、清洗与整理工作。准备室要求明亮、通风。l 如果房间较多，可将准备室分为洗涤室和配置室两部分。洗涤室专门负责试管苗出瓶与培养器皿的清洗工作；配置室则负责培养基的配制、分装、包扎和高压灭菌等工作。 (三)、缓冲室l 进入无菌室前要在缓冲室里换上经过灭菌的卫生服、拖鞋，戴上口罩。l 应当在此室内安装灭菌用的紫外灯。控制无菌室及培养室的配电板等。(四)、无菌操作室(transfering room)l 接种室是进行植物材料的分离接种及培养物转移的一个重要操作室。其无菌条件的好坏对组织培养成功与否起重要作用。l 配置：l 在工作方便的前

3、提下，接种室宜小不宜大，一般7-8m2，要求地面、天花板及四壁尽可能密闭光滑，易于清洁和消毒。配置拉动门，以减少开关门时的空气扰动。l 接种室要求干爽安静，清洁明亮。在适当位置吊装1-2盏紫外线灭菌灯，用以照射灭菌。最好安装一小型空调，使室温可控，这样可使门窗紧闭，减少与外界空气对流。(五)、培养室(culturing room)l 培养室是将接种的材料进行培养生长的场所。培养室的大小可根据需要培养架的大小、数目、及其他附属设备而定。l 设计原则：l 充分利用空间和节省l 能源l 高度比培养架略高为l 宜l 周围墙壁要求有绝热 防火的性能。(五)、培养室(culturing room)l 培养

4、架大多由金属制成。l 规格：l 一般设5层，最低一层离地高约10 cm，其他每层间隔30cm左右，培养架即高1.7m左右。培养架长度都是根据日光灯的长度而设计，如采用40W日光灯，则长1.3 m，30 W的长1m，宽度一般为60cm。l 培养室最重要的因子是温度，一般保持在20-27左右，具备产热装置，并安装窗式或立式空调机。由于热带植物和寒带植物等不同种类要求不同温度，最好不同种类有不同的培养室。室内湿度也要求恒定，相对湿度以保持在70-80为好，可安装加湿器。l 控制日光照时间可安装定时开 关钟，一般需要每天光照10-16h。也有的需要连续照明。现代组培实验室大多设计为采用天然太阳光照作为

5、主要能源，这样不但可以节省能源，而且组培苗接受太阳光生长良好，驯化易成活。(六)、驯化室l 驯化室要求清洁无菌，配有空调机、加湿器、恒温恒湿控制仪、喷雾器、光照调节装置、通风口以及必要的杀菌剂。(七)、温室l 应配有空调机、通风口、加湿器、恒温恒湿控制装置、喷雾装置、光照调节装置以及必要的杀菌杀虫装置及相应药剂。二、仪器设备和器皿用具l 常见仪器设备l 1、超净台l 2、无菌箱l 3、空调机l 4、除湿机l 5、恒温箱l 6、烘箱l 7、高压灭菌锅l 8、冰箱l 9、电子分析天平和托盘天平l 10、显微镜及解剖镜l 11、水浴锅l 12、摇床与转床l 13、磁力搅拌器l 14、电蒸馏水器l 1

6、5、酸度计l 16、离心机1、超净台和无菌箱l 1、超净台，优点是操作方便自如，比较舒适，工作效率高，准备时间短。开机10分钟即可操作，可进行长时间使用。在工厂化生产中，接种工作量很大，需要经常长久地工作时，超净台是很理想的设备。l 2、无菌箱，在投资少的情况下，可以用接种箱来代替超净台。接种箱依靠密闭、药剂熏蒸和紫外灯照射来保证内部空间无菌。但操作活动受限制，准备时间长，工作效率低。工作原理l 超净台功率在145-260W左右，它装有小型鼓风机，使空气穿过一个前置过滤器，在这里把大部分空气尘埃先过滤掉，然后再使空气穿过一个细致的高效过滤器，它除去了大于03um的尘埃、细菌和真菌孢子等，最后以

7、较洁净的气流吹到工作台面。超净空气的流速为每分钟24-30m，这已足够防止附近空气袭扰而引起的污染，这样的流速也不会妨碍采用酒精灯对器械等的灼烧消毒。在这样的无菌条件下操作，就可以保证无菌材料在转移接种过程中不受污染。l 根据风幕形成的方式，超净台可分为水平式和垂直式二种型号。（二）各类玻璃器皿1、培养器皿 2、分注器 3、离心管4、刻度移液管5、细菌过滤器6、实验器皿1、培养器皿l 1、培养器皿：在组织培养中配制培养基和进行培养需大量的玻璃器皿。要求由碱性溶解度小的硬质玻璃制成，以保证长期贮存药品及培养的效果；培养用的还要求透光度好，能耐高压高温，能方便放入培养基和培养材料的器皿，根据培养的

8、目的和要求，可以采用不同种类、规格的玻璃器皿。其中以试管、三角瓶、培养皿等使用较多。l 最常使用的是l 三角瓶l 培养皿（9、12cm直径）用于：游离细胞、原生质体、花粉等的静置培养、看护培养、无菌种子的发芽、植物材料的分离等都需采用。l 试管（18mmXl80mm或20mmX200mm）用于：培养较高的试管苗。l 工厂化生产可采用广口的200ml罐头瓶，加盖半透明的塑料盖，由于瓶口大，所以大量繁殖时操作方便、工作效率高，也减少了培养材料的损伤。但缺点是易引起污染。瓶口封塞l 瓶口封塞可用多种方法，要具有一定的通气性和密闭性，以防止培养基干燥和杂菌污染。l 以前封口常用棉塞。但这种封口办法夏季

9、极易污染，且不易保持培养基的湿度。现在多采用聚丙烯塑料薄膜作为封口，以线绳结扎或橡皮圈箍扎。为了增加通气性，可在里面衬一层硫酸纸或牛皮纸。这样经济方便，且通气好。也可采用专用的封口膜。5、细菌过滤器l 用于除去不能采用湿热灭菌法的液体中的细菌。一般采用0.22um微孔滤膜进行抽滤灭菌。包括滤头，注射器或采用抽滤装置：真空泵、吸滤瓶、滤气玻璃管等。6、实验器皿l 在组织培养中配制培养基，贮藏母液，材料的消毒等需要各种化学实验用的玻璃器皿，包括:l 100ml、250ml、500ml、1000ml烧杯；l l0ml、l00ml、1000ml量筒；l l00ml、1000ml试剂瓶(棕色)等等。（三

10、）、器械用具（P13）l 1镊子类：尖头和枪形l 2剪刀类l 3解剖刀l 4解剖针l 5、接种工具：接种针、接种钩及接种铲（由白金丝或镍丝制成）l 6、钻孔器l 7、其它：酒精灯，电炉，试管架，搪瓷盘等第二节 培养基及其配置l 目的要求：l (1)一般掌握培养基的种类、特点；l (2)掌握基本培养基的配方；l (3)一般掌握培养基的组成成分和适宜的剂量；l (4)掌握培养基母液和常用培养基的配制方法和步骤；l (5)熟练掌握培养基的灭菌方法；l (6)一般掌握培养基的筛选办法。培养基及其配制l 培养基的种类l 培养基的成分l 培养基配制1.培养基的种类l 按成分分类:l MS,B5,White

11、,NT,KM-8P,N6等。l 按状态： 液体，固体。（1）MS培养基（Murashige and Skoog Medium）MS培养基（Murashige and Skoog Medium）l Toshio Murashige, Folke Skoog. A Revised Medium for Rapid Growth and Bio Assays with Tobacco Tissue Cultures. Physiol. Plant. 1962,15:473-497. l 植物组织培养中常用的一种培养基。l 离子浓度较高，硝酸盐含量较其他培养基高。l 器官，花药，细胞，原生质体培养。（

12、2）B5培养基（B5 Medium）l Gamborg, O. L.; Miller, R. A.; Ojima, K. Nutrient requirements of suspension cultures of soybean root cells. Exp. Cell Res. 50:151158; 1968.B5培养基（B5 Medium）l 铵含量较低l 木本植物，十字花科植物（3）White培养基（White Medium）l White, P. R. Handbook of plant tissue culture. New York: The Ronald Press Co.

13、; 1943. White, P. R.; Grove, A. R. Proceedings, International Conference on Plantl Tissue Culture (1963: University Park, PA). Berkeley, CA: McCutchan Pub. Corp.; 1965:553 pp.l 无机盐含量低l 生根培养（4）NT培养基（NT Medium）l 1970l 烟草叶肉原生质体培养（5）KM-8培养基（KM-8 Medium）l 1974l 有机成分复杂，包括所有单糖和维生素，呼吸代谢主要有机酸l 原生质体和融合体培养（6）N

14、6培养基（N6 Medium）l 1974，朱至清等。l 成分简单，KNO3和（NH4）2SO4含量高l 小麦，水稻及其他植物花药培养和组织培养2.培养基的成分l 水l 无机营养成分l 有机营养成分l 植物生长调节剂l 附加成分（1）水l 培养基的主要组分l 水是植物原生质体的组成成分，也是一切代谢过程的介质和溶媒，是生命活动过程中不可缺少的物质。l 配制培养基母液时要用蒸馏水，以保持母液及培养基成分的精确性，防止储藏过程发霉变质。大规模生产时可用自来水。（2）无机营养组分l 作用l 满足植物对各矿质元素的需求。l 大量元素，6种l 微量元素，7种l 非必须元素，6种铁采用螯合铁，FeSO4加

15、EDTA（3）有机营养成分l 碳源l 蔗糖l 维生素类l 硫胺素（B1），烟酸（B3），吡哆醇（B6），泛酸钙（B5），肌醇。l 氨基酸l 蛋白质组成成分，促进细胞生长。l 其他有机附加物l 椰子汁，酵母提取物，马铃薯，水解酪蛋白等。可以促进组织生长。l 椰子汁l 椰子的液体胚乳。它是使用最多、效果最大的一种天然复合物。一般使用浓度在10%-20%。它在愈伤组织和细胞培养中有促进作用。 l 马铃薯 去掉皮和芽后，加水煮30分钟，再经过过滤，取其滤液使用。对PH值缓冲作用大。添加后可得到健壮的植株。 其他l 酵母提取物，香蕉，水解酪蛋白等。（4）植物生长调节物质l 生长素l 细胞分裂素l 赤霉素

16、l 乙烯生长素赤霉素细胞分裂素脱落酸乙烯 -植物激素“五兄弟”l 生长素（auxin）的发现 向光性：在单侧光的照射下，植物朝向光源方向生长的现象。1、19世纪末达尔文(C.R.Darwin)实验实验材料：胚芽鞘总结上述三个实验,达尔文提出:胚芽鞘尖端受单侧光刺激后, 就向下面的伸长区传递影响，造成伸长区背光面比向光面生长快,因而使胚芽鞘出现向光弯曲。2.1910年詹森（B.Jensen）的实验琼脂片云母片结论：胚芽鞘的尖端产生的某种刺激可以透过琼脂片传递给下面一段。3.1914年拜尔（Paal）的实验结论：胚芽鞘的弯曲生长，是因为尖端产生的影响在其下部分布不均匀造成的。4、1928年（F.W

17、.Went）温特的实验结论：胚芽鞘的弯曲生长确实是一种化学物质引起的，并命名为生长素。l 1934年从人尿分离出具有生长素效应的物质吲哚乙酸。l 1942年从高等植物中分离出生长素，并确认是IAA。l 在植物体内，具有促进植物生长的功能，除了吲哚乙酸（IAA）外，还有苯乙酸（PAA）和吲哚丁酸（IBA）。生长素生理作用的应用l 顶端优势l 植物的向光性l 根的向重力性（向地性）l 茎的背重力性（背地性）顶端优势：植物的顶芽优先生长，而侧芽生长受抑制的现象。形成原因：顶芽产生的生长素向下运输，大量地积累在侧芽部位，侧芽对生长素浓度又比较敏感，使侧芽的生长受到抑制。茎的背地性和根的向地性生长植物向

18、光性在单侧光线照射下， 背光侧向光侧，背光侧细胞生长快结果使茎朝向光源一侧弯曲生长素类似物的应用(1) 促进扦插的枝条生根(2) 促进果实发育（培育无籽果实）(3) 防止落花落果，疏花疏果（4）用作除草剂1、促进扦插枝条生根 用一定浓度的生长素类似物溶液浸泡插枝的下端后栽插。 2、生长素促进果实发育（无籽果实） 传粉受精后，胚珠发育成种子的过程中产生大量生长素，促进子房发育成果实。如何培育无籽果实？ 在没有接受花粉的雌蕊柱头上涂上一定浓度的生长素类似物，使子房正常发育为果实，因为没有受精，果实内没有种子。3、防止落花落果 农业生产上常用一定浓度的生长素类似物溶液喷洒棉株，可以达到保蕾保铃的效果

19、。4、杂草的除草剂 如(2，4-D)，适用于麦田、稻田，双子叶植物比单子叶植物对生长素更敏感，用高浓度的除草剂能抑制双子叶植物（杂草）的生长。生长素（auxin）l 吲哚乙酸（IAA，天然），奈乙酸（NAA），二氯苯氧乙酸（2,4-D），吲哚丁酸（IBA），2,4,5-三氯苯氧乙酸（2,4,5-T）。l 促进细胞分裂与根分化l 2,4-D有强烈的愈伤组织诱导能力，但抑制器官分化细胞分裂素（cytokinin）l 激动素 （KT），6-苄基腺嘌呤（6-BA），玉米素 （ZT），异戊烯氨基嘌呤（ 2IP）l 刺激细胞分裂，诱导芽的分化、叶片扩大和茎长高，抑制根的生长。 l 细胞分裂素常与生长素相互配合，用以调节细胞分裂，细胞伸长，细胞分化和