环境工程微生物学微生物污染及其检测技术

1、 水体中的病原微生物 表10-1 通过粪便进入水体的病原体细菌细菌病毒病毒其他其他*沙门氏菌属沙门氏菌属脊随灰质炎病毒脊随灰质炎病毒溶组织内阿米巴溶组织内阿米巴志贺氏菌属志贺氏菌属考克赛基病毒考克赛基病毒结肠小袋虫结肠小袋虫致病性大肠杆菌致病性大肠杆菌肠细菌病变人孤儿病毒肠细菌病变人孤儿病毒人等孢子球虫人等孢子球虫变形杆菌属变形杆菌属呼肠孤病毒呼肠孤病毒兰伯氏贾弟虫兰伯氏贾弟虫克雷伯氏杆菌属克雷伯氏杆菌属腺病毒腺病毒日本血吸虫日本血吸虫土拉热弗朗西丝氏菌土拉热弗朗西丝氏菌轮状病毒轮状病毒钩虫钩虫假单胞杆菌属假单胞杆菌属肝炎病毒肝炎病毒蛔虫蛔虫沙雷氏杆菌属沙雷氏杆菌属胃肠炎病毒胃肠炎病毒小肠结肠

2、炎耶尔森氏菌小肠结肠炎耶尔森氏菌以虫卵、包裹、幼虫等形式进入以虫卵、包裹、幼虫等形式进入水体水体空肠弯曲杆菌空肠弯曲杆菌霍乱弧菌霍乱弧菌 沙门氏菌属沙门氏菌属(Salmonella） 志贺氏菌属志贺氏菌属(Shigella） 霍乱弧菌霍乱弧菌(Vibrio cholerae) 肠道病毒属肠道病毒属(Enterovirus) 甲型肝炎病毒甲型肝炎病毒(hepatitis A virus） Salmonella typhimurium (red) invading cultured human cellsLT2A-SL1344 genomeShigella sonne的部分特的部分特性性Shige

3、lla typhimurium氨氨 硝酸与亚硝酸硝酸与亚硝酸 氮氧化物氮氧化物 硫化氢硫化氢 酸性矿水酸性矿水 甲基汞甲基汞 农药代谢的毒性产物农药代谢的毒性产物 细菌毒素细菌毒素 肉毒毒素肉毒毒素(botulin) 葡萄球菌肠毒素葡萄球菌肠毒素 放线菌毒素放线菌毒素 放线菌素放线菌素 链脲菌素链脲菌素 洋橄榄霉素洋橄榄霉素 真菌毒素真菌毒素以黄曲霉毒素为例以黄曲霉毒素为例 剧毒剧毒, 黄曲霉黄曲霉(Aspergillus flavus)和寄生和寄生曲霉曲霉(Asp. parasiticus)产生产生 紫外线照射下可发出荧光紫外线照射下可发出荧光 B族和族和G族，蓝色荧光和绿色荧光族，蓝色荧光

4、和绿色荧光 已确定结构的黄曲霉毒素有已确定结构的黄曲霉毒素有17种，种，其中以黄曲霉毒素其中以黄曲霉毒素1毒性最大，毒性最大，致癌力最强。致癌力最强。 藻类毒素藻类毒素 甲藻甲藻 蓝细菌毒素蓝细菌毒素 :微囊藻快速致死因子微囊藻快速致死因子(Microcystis FDF) 当环境受到污染后，环境的物理性质、当环境受到污染后，环境的物理性质、 化学性质和生物学特性化学性质和生物学特性发生变化发生变化, 如：如：重金属离子、重金属离子、NO3- 浓度增加；浓度增加；水体污染变质，水生生物种类减少，甚水体污染变质，水生生物种类减少，甚至灭绝。至灭绝。v化学方法：快速、定性定量反映污染物浓度，但化学

5、方法：快速、定性定量反映污染物浓度，但为瞬时值；为瞬时值； v生物学方法：利用生物学方法：利用生物种类生物种类、数量的变化数量的变化，生物生物学特性的改变学特性的改变来监测污染物对环境的影响。来监测污染物对环境的影响。v生物学方法的特点：可监测到污染物对环境的综合影生物学方法的特点：可监测到污染物对环境的综合影响，但不易精确反映污染物的性质、浓度和数量。响，但不易精确反映污染物的性质、浓度和数量。一、空气微生物来源一、空气微生物来源 空气并非微生物的繁殖场所，空气中缺乏水分空气并非微生物的繁殖场所，空气中缺乏水分和营养，紫外线的照射对微生物也有致死作用。和营养，紫外线的照射对微生物也有致死作用

6、。 土壤中飞扬起来的灰尘；土壤中飞扬起来的灰尘； 水面吹起的水雾、人和动物体表干燥脱落的物水面吹起的水雾、人和动物体表干燥脱落的物质，微生物附着于这些物质的微粒上随气流传质，微生物附着于这些物质的微粒上随气流传播。播。 微生物产生的孢子本身也可以飘浮到空微生物产生的孢子本身也可以飘浮到空气中，形成气中，形成 “气溶胶气溶胶”，借风力传播。，借风力传播。 空气中的微生物中，真菌的孢子数量最空气中的微生物中，真菌的孢子数量最多，细菌较少。而且藻类、酵母菌、病多，细菌较少。而且藻类、酵母菌、病毒都会存在于空气中毒都会存在于空气中 。Infection Transfer-Airborne Drople

7、t Nuclei二、空气微生物的卫生标准二、空气微生物的卫生标准 目前，还无统一的关于空气的卫生学指标，目前，还无统一的关于空气的卫生学指标，一般以室内一般以室内1m3 空气中细菌总数为空气中细菌总数为501,000个以上作为空气污染的指标。个以上作为空气污染的指标。 病原菌在空气中易死亡，但病原菌在空气中易死亡，但结核菌、白结核菌、白喉杆菌、葡萄球菌、链球菌、肺炎双球喉杆菌、葡萄球菌、链球菌、肺炎双球菌、炭疽杆菌、流感病毒和脊髓灰质炎菌、炭疽杆菌、流感病毒和脊髓灰质炎病毒等病毒等，也可以在空气中存活一段时间。，也可以在空气中存活一段时间。 尘埃多的地方，如畜舍、公共场所、医尘埃多的地方，如畜

8、舍、公共场所、医院、城市街道的空气中，微生物数量较院、城市街道的空气中，微生物数量较多。高山、海洋、森林、积雪的山脉和多。高山、海洋、森林、积雪的山脉和高纬度地带的空气中，微生物较少。高纬度地带的空气中，微生物较少。场所场所畜舍畜舍宿舍宿舍城市城市街道街道市区市区公园公园海洋海洋上空上空北纬北纬80微生物微生物(12) 106 2104 5 5103200120表表2-1 不同场所上空微生物的数量（个不同场所上空微生物的数量（个/m3 ）表表2-2 以细菌总数评价空气的卫生标准（个以细菌总数评价空气的卫生标准（个/m3 ）清洁程度清洁程度细菌总数细菌总数最清洁的空气（有空调）最清洁的空气（有空

9、调）12清洁空气清洁空气30普通空气普通空气31125临界环境临界环境150轻度污染轻度污染301 采用营养琼脂平板计数法。 培养皿直径为d90mm和d100mm。 评价空气的清洁程度，需要测定空气中的微生物数量和空气污染微生物。细菌指标：细菌总数和绿色链球菌 必要时测定病原微生物。 1 1固体法固体法 平皿落菌法平皿落菌法(沉降沉降平板法平板法)、 撞击法撞击法(缝隙采样器、筛板采样器、针孔采样器缝隙采样器、筛板采样器、针孔采样器) 过滤法。过滤法。(1)(1)平皿落菌法平皿落菌法 培养基融化倒入培养基融化倒入d90mm无菌平皿制成平板无菌平皿制成平板, 置于待测点置于待测点(通常通常5个个

10、)， 打开皿盖暴露于空气打开皿盖暴露于空气510min， 盖好皿盖，盖好皿盖，30培养培养48h； 计菌落数。计菌落数。 通过奥梅梁斯基公式换算出浮游细菌数。通过奥梅梁斯基公式换算出浮游细菌数。 奥氏假设：奥氏假设：5 min内落在面积内落在面积100 mm2营养营养琼脂平板上的细菌数和琼脂平板上的细菌数和10L空气中所含的空气中所含的细菌数相同。细菌数相同。 奥氏公式：奥氏公式： 式中：式中：C空气细菌数；空气细菌数； A捕集面积，捕集面积，cm2 ； t 暴露时间，暴露时间，min； N菌落数，个。菌落数，个。5t100A100010 NC = 简化后：简化后：奥式公式计算的浮游细菌数比实

11、测数少。奥式公式计算的浮游细菌数比实测数少。没有考虑尘埃粒子大小、数量、气流，人员密没有考虑尘埃粒子大小、数量、气流，人员密度和活动情况。度和活动情况。 C = 100050NAt(2)撞击法：撞击法：v以缝隙采样器为例，以缝隙采样器为例，用真空泵将含菌空气以一定流速穿过狭缝用真空泵将含菌空气以一定流速穿过狭缝（宽度有（宽度有0.15 mm、0.33 mm和和1 mm三种三种)抽抽吸到营养琼脂培养基平板上。吸到营养琼脂培养基平板上。狭缝长度为平皿半径，平板与缝间距狭缝长度为平皿半径，平板与缝间距2mm，平板转速平板转速:1 r/min、5-60r/min、60r/min。根据空气中微生物密度调

12、节平板转动的速度根据空气中微生物密度调节平板转动的速度含菌高，转动快；含菌低，转动慢。含菌高，转动快；含菌低，转动慢。由取样时间和空气流量计算单位空气含菌量。由取样时间和空气流量计算单位空气含菌量。采样器的规格各国不一，操作有差异。采样器的规格各国不一，操作有差异。培养前培养后撞击法检测空气中微生物数量撞击法检测空气中微生物数量 测定空气中悬浮微生物，主要细菌测定空气中悬浮微生物，主要细菌 将将一定体积一定体积的含菌空气通入无菌蒸馏水，使的含菌空气通入无菌蒸馏水，使微生物均匀分布在水中，微生物均匀分布在水中， 取取一定量菌液一定量菌液于无菌培养皿中，倒入于无菌培养皿中，倒入15-18ml融化的

13、培养基，混匀、冷凝成平板，融化的培养基，混匀、冷凝成平板， 37培养培养48h，计菌落数计菌落数。以菌液体积和通入空气量计算出单位体积空以菌液体积和通入空气量计算出单位体积空气中的细菌数量。气中的细菌数量。例如：例如：l10m3含菌空气通入含菌空气通入100mL的无菌水，微的无菌水，微生物全部截留在水中。生物全部截留在水中。l取取0.1 mL菌液涂布于平板上，菌液涂布于平板上，长出长出100个菌落，则个菌落，则10mL水中含菌水中含菌10,000个，个，10m3空气含有空气含有10,000个。个。1m3空气含有空气含有1,000个个 。 空气微生物的测点数越多越准确，为照顾空气微生物的测点数越

14、多越准确，为照顾到工作方便，又相对准确，以到工作方便，又相对准确，以2030个测点个测点数为宜，最少测点数为数为宜，最少测点数为56，见表。，见表。 时时间间 标准标准 名称名称最少最少测点测点数数建议建议测点测点数数 点距点距（m）每点每点测定测定次数次数 1987 JIS B 9920洁净室中浮洁净室中浮游粒子游粒子 测定方法和测定方法和洁净室的评洁净室的评价方法价方法 6 20，30原则原则上上3 空间太空间太大大 可放可放宽宽 3 1987 空气清空气清净协净协 会标准会标准洁净室性能洁净室性能评价指南评价指南 5 20, 30原则原则上上3 表表 1 日本有关标准测点数的规定日本有关

15、标准测点数的规定 摘自许钟麟空气洁净技术原理P522同济大学出版社，1998 洁洁 净净 度度进风面积进风面积(单向流单向流)或室面积或室面积(乱流乱流)m2100级及级及高于高于100级级 1000级级10000级级 100000级级 10 10 20 40 80 100 200 400 23 4 8 16 32 40 80 160 2 3 6 13 25 32 63 126 2 2 2 4 8 10 20 40 2 2 2 2 2 3 6 13表 3 浮游菌最小采样量 浮游菌上限浓度浮游菌上限浓度个个 m-2 min-1 计算最小采样量计算最小采样量m3 10 5 1 0.5 0.1 0.

16、05 0.3 0.6 3 6 30 60 含尘浓度最大值含尘浓度最大值 需要需要d90mm培养皿数培养皿数 0.35 3.5 35 350 3 50035 000 40 13 4 2 1一、一、细菌总数细菌总数 将将定量水样定量水样（原水样或稀释水样（原水样或稀释水样1mL）接种）接种于于牛肉膏蛋白胨牛肉膏蛋白胨琼脂培养基平板琼脂培养基平板 37C培养培养24hr后观察结果，计后观察结果，计菌落数菌落数， 计算原水样每毫升的细菌总数。计算原水样每毫升的细菌总数。u具有相对的具有相对的卫生学意义卫生学意义：菌数越高，水体受有机物污染或粪便污染越菌数越高，水体受有机物污染或粪便污染越重，病原菌污染

17、的可能性亦大重，病原菌污染的可能性亦大（为什么？）（为什么？）。 人畜粪便中常常带有大量的微生物，水质的卫生人畜粪便中常常带有大量的微生物，水质的卫生学检验，对于保护人群健康，具有重要意义学检验，对于保护人群健康，具有重要意义 有些属于正常的、对人体无害的肠道微生物，有些属于正常的、对人体无害的肠道微生物， 有些则是病原微生物，进入水体后，可造成水体的污有些则是病原微生物，进入水体后，可造成水体的污染，从而引发各种肠道疾病。染，从而引发各种肠道疾病。 致病菌数量少，直接检测复杂，选用间接指标即致病菌数量少，直接检测复杂，选用间接指标即粪便污染指示菌为代表。粪便污染指示菌为代表。 以肠道正常细菌

18、在水中的存在及数量作为粪便污染的以肠道正常细菌在水中的存在及数量作为粪便污染的指示。指示。微生物名称微生物名称每克粪便中平均生长菌落数每克粪便中平均生长菌落数主要微生物 拟杆菌属1010乳酸杆菌属109大肠埃希氏菌属108粪链球菌108次要的微生物 柠檬酸杆菌属105-106梭菌属105-106葡萄球菌属105-106克雷伯氏菌属104-105肠杆菌属104-105芽孢杆菌属酵母属104-105霉菌104-105较少的微生物 变形菌属102-103铜绿假单胞菌属102-103大量存在于人的粪便，数量比病原菌多；大量存在于人的粪便，数量比病原菌多；受粪便污染的水中易检测出，未受污染的受粪便污染的

19、水中易检测出，未受污染的水中无检测；水中无检测；在水体中不会自行繁殖；在水体中不会自行繁殖；存活时间略长于致病菌，对消毒剂的抵抗存活时间略长于致病菌，对消毒剂的抵抗略强于致病菌；略强于致病菌；检出及鉴定方法比较简易迅速；检出及鉴定方法比较简易迅速；适用于各种水体。适用于各种水体。 总大肠菌群，总大肠菌群， 粪大肠菌群、粪大肠菌群、 大肠杆菌埃希氏菌（大肠杆菌）大肠杆菌埃希氏菌（大肠杆菌） 克雷伯氏菌属。克雷伯氏菌属。（一）特征（一）特征大肠杆菌定义：大肠杆菌定义：v一群一群需氧或兼性厌氧性需氧或兼性厌氧性的的G-无芽孢杆菌无芽孢杆菌，37C培培养养24hr，能发酵乳糖产酸产气。包括了粪便内全，

20、能发酵乳糖产酸产气。包括了粪便内全部兼性需氧性部兼性需氧性G-杆菌，以大肠杆菌埃希氏菌属为杆菌，以大肠杆菌埃希氏菌属为主，以及柠檬酸杆菌属、肠杆菌属、克雷伯氏菌主，以及柠檬酸杆菌属、肠杆菌属、克雷伯氏菌属等。属等。 成人粪便排出菌数可达成人粪便排出菌数可达(5100)106 cfu/d。（二）大肠菌群的测定（二）大肠菌群的测定常用多管发酵法或滤膜法。常用多管发酵法或滤膜法。发酵法：发酵法：又称又称多管发酵法或三步发酵法多管发酵法或三步发酵法初发酵（推测试验）初发酵（推测试验）将不同稀释度的水样，分别接种于含乳将不同稀释度的水样，分别接种于含乳糖等糖类的培养液糖等糖类的培养液(3倍或倍或1倍乳糖

21、液倍乳糖液),37C培养培养24hr，观察产酸产气情况，观察产酸产气情况，1. 初步判断是否有大肠菌群存在。初步判断是否有大肠菌群存在。 水中其它细菌有可能引起糖类发酵，因此需要水中其它细菌有可能引起糖类发酵，因此需要进一步证实。进一步证实。 初发酵管中已发酵的菌液接种于伊红美兰培养初发酵管中已发酵的菌液接种于伊红美兰培养基或远藤氏培养基上，基或远藤氏培养基上，37C培养培养24hr， 根据菌落特征，挑取大肠菌群疑似菌落制片，根据菌落特征，挑取大肠菌群疑似菌落制片， 革兰氏染色证实是否为大肠菌群。革兰氏染色证实是否为大肠菌群。 将大肠菌群疑似菌落再次接入将大肠菌群疑似菌落再次接入1倍乳糖液，倍乳糖液，37C培养培养24hr，产酸产气者即确证为大，产酸产气者即确证为大肠菌群。肠菌群。 结果计算结果计算 产酸、产气记为阳性反应，产酸、产气记为阳性反应， 不产酸、不产气记为阴性反应。不产酸、不产气记为阴性反应。 根据阳性管数量，查表计算水体大肠菌群数量。根据阳性管数量，查表计算水体大肠菌群数量。 发酵法检测需要时间较长，为缩短时间，发酵法检测需要时间较长，为缩短时间，可以采用滤膜法，其步骤为：可以采用滤膜法，其步骤为：1）水样过滤：）水样过滤：选用微孔滤膜，灭菌后抽滤选用微孔滤膜，灭菌后抽滤一定量的待测水样，将水中的细菌截留一定量的待测水样，将水中的细