精化13级-精化产品综合分析及质量控制(含化妆品微生物)-实训指导书

1、中山火炬职业技术学院实训教学指导书系 别： 生物医药系 指导教师： 杨懋勋 职 称： 副教授 学 期： 20152016学年 一 学期精化产品综合分析及质量控制（含化妆品微生物） 实训指导书实训一 玻璃器皿的清洗、包扎和干热灭菌一、实训目的1、能说出微生物实训所需的各种常用器皿名称和规格。2、会清洗各种常用的玻璃器皿。3、能对玻璃器皿进行干热灭菌操作 。二、实训器材1、常用各种玻璃器皿。2、清洗工具和去污粉、肥皂、洗涤液。3、电热干燥箱。三、实训原理为了保证实训顺利进行，要求把实训用器皿清洗干净。保持灭菌后无菌状态，需要对培养皿、吸管等进行妥善包扎。试管和三角瓶要做棉塞。这些工作看来很普通，如

2、操作不当或不按规定要求去做，会导致实训的失败！因此应看作是微生物实训的基本操作。四、实训步骤（一）器皿洗涤的注意事项和方法1、任何洗涤方法，都不应对玻璃器皿有所损伤，所以不能用有腐蚀作用的化学药剂，也不能使用比玻璃硬度大的物品来擦拭玻璃器皿。2、一般新的玻璃器皿用12%的盐酸溶液浸泡数小时（2-6h），用水充洗干净。3、用过的器皿应立即洗涤，有时放置太久会增加洗涤困难。4、难洗涤的器皿不要与易洗涤的器皿放在一起。有油的器皿不要与无油的器皿放在一起，否则使本来无油的器皿也沾上了油垢，浪费药剂和时间。5、强酸、强碱、琼脂等腐蚀、阻塞管道的物质不能直接倒在洗涤槽内，必须倒在废缸内或指定的地方。6、含

3、有琼脂培养基的器皿，可先用小刀或铁丝将器皿中的琼脂培养基刮去，或把它们用水蒸煮，待琼脂融化后趁热倒出，然后用水洗涤。7、一般的器皿都可用去污粉、肥皂或配成5%热肥皂水来清洗，油质很重的器皿，应先将油层擦去。8、如果器皿沾有煤膏、焦油及树脂类的一些物质，可用浓硫酸或40%的氢氧化钠液洗，或用洗涤液浸泡。9、当器皿上沾有蜡或油漆等物质，用加热方法使之融化揩去，或用有机溶剂（苯、二甲苯、丙酮、松节油等）拭揩。10、洗涤后的器皿达到玻璃能被水均匀湿润而无条纹和水珠。11、载玻片或盖玻片可先在2%盐酸溶液中浸1小时，然后在水中冲洗23次，最后用蒸馏水洗23次，洗后烘干冷却或浸于95%酒精中保存备用。用过

4、的载玻片或盖玻片，先擦去油垢，再放在5%肥皂水中煮10分钟后，立即用清水冲洗，以后放在洗涤液（稀释）中浸泡2小时，再用清水洗至无色为止，最后用蒸馏水洗数次，干后浸于95%酒精中保存备用。12、凡遇有传染性材料的器皿，洗涤前应经高压灭菌后清洗。【一般玻璃器皿洗涤操作要点】：（1） 用试管刷蘸取少量去污粉反复刷洗器皿2-3次。（2） 用自来水冲洗2-3次。（3） 用少量蒸馏水或去离子水荡洗1-2次，控干水分。（二）器皿干燥洗干净的玻璃器皿，一般是在室温下自然干燥。若急需使用或需要高温干燥，可使用电热干燥箱干燥，温度一般在105120烘0.51h。（使用干燥箱时应注意，要在温度下降到60以下再打开箱

5、门，取出器皿使用）。知识拓展：玻璃称量瓶等在烘干后要放在干燥器中冷却和保存；带实心玻璃盖的及厚壁仪器烘干时要注意慢慢升温并且温度不可过高，以免破裂。量器不可放在烘箱中烘，硬质试管可用酒精灯加热烘干，要从底部烤起，把管口向下，以免水珠倒流把试管炸裂，烘到无水珠后把试管口向上赶净水气。（三）器皿包扎为了灭菌后仍保持无菌状态，各种玻璃器皿均需包扎。1、培养皿：洗净烘干后每7套迭在一起，用牢固的纸卷成一筒，外面用绳子捆扎，以免散开，然后进行灭菌。到使用时在无菌环境中才打开取出培养皿。2、吸管：洗净烘干后的吸管，在口吸的一端用尖头摄子或针塞入少许脱脂棉花，以防在使用时造成污染。塞入棉花的量要适宜，棉花不

6、宜露在吸管口的外面，多余的棉花可用酒精灯的火焰把它烧掉。每支吸管用一条宽约4-5厘米，以30-50左右的角度螺旋形卷起来，吸管的尖端在头部，吸管的另一端用剩余纸条迭打结，不使散开，标上容量。若干支吸管扎成一束，灭菌后，同样要在使用时才从吸管中间拧断纸条抽去吸管（见下图）。3、试管和锥形瓶：试管和三角瓶都要作合适的棉花塞。棉花塞的作用是起过滤作用，避免空气中的微生物进入试管或三角瓶。棉塞制作方法如下图所示。棉塞的形状、大小和松紧度要合适，四周紧贴管壁，不留缝隙，才能起到防止杂菌侵入和有利通气的作用。棉塞过紧易挤破管口和不易塞入，过松易掉落和污染。要使棉塞总长约2/3至3/5塞入试管口或瓶口内，以

7、防棉塞脱落。有些微生物需要更好的通气，则可用8层纱布制成通气塞。有时也可用试管帽或塑料塞代替棉塞。合格的棉塞不合格的棉塞 具体可参考视频“学习微生物培养的基本技术”（09：1809：55）。若干支试管用绳子扎在一起，在棉花塞部分用报纸或包扎纸包扎，再在纸外用绳扎紧。具体请参考视频：“器皿包扎”、“微生物检验准备工作”。（四）干热灭菌使玻璃器皿达到无菌状态叫灭菌，玻璃器皿主要用电热干燥箱进行灭菌。1、干燥箱灭菌的物品放在箱内，堆置时要留空隙勿使接触四壁，关闭箱门。2、接通电源，控温仪上有数字显示。3、按SET键进入温度设定，将温度设定为160（160-170）。再按SET键进入时间设定，将时间设

8、定为80min（1-2h）4、切断电源，冷却到60以下时，才能把箱门打开，取出灭菌物品。干净的玻璃器皿及其它耐热器皿等一般都可用此法灭菌。但培养基和其它不耐热的橡皮塞等不可用此法灭菌。五、实训作业 认真完成实训记录报告。附：铬酸洗液配方及配法。浓配方：重铬酸钾（工业用） 40.0克蒸馏水 160.0毫升浓硫酸（粗） 800.0毫升稀配方：重铬酸钾（工业用） 50.0克蒸馏水 850.0毫升浓硫酸（粗） 100.0毫升配法：将重铬酸钾溶解在蒸馏水中（可加热），待冷却后，再慢慢地加入浓硫酸，边加边搅拌，配好后存放备用。此液可使用很多次，每次用后倒回瓶中贮存，直至洗涤液变成青褐色时才失去效用。器皿上

9、有大量有机质时，不可直接用洗涤液来洗涤，应尽量先行清除后再用，否则洗涤液很快会失效。洗涤液不能用手洗涤金属器皿，洗涤液有强腐蚀性，如溅于桌椅上，应立即用水冲洗，然后用碳酸钠溶液或氨水洗。实训二 固体培养基的制备及灭菌一、实训目的1、能说出培养基的配制原理和方法，掌握其配制过程。2、能说出加压蒸汽灭菌锅的原理并能熟练操作该设备。二、实训器材1、仪器设备：锥形瓶、量筒、移液管、烧杯、棉花、玻璃棒、pH试纸、电炉或电热套、天平、药勺、包扎纸、棉绳、标签纸、电烘箱、高压灭菌锅。2、试剂：牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、琼脂、蒸馏水、NaOH溶液（1mol/L），HCl溶液（1mol/L）。三、实训原理1.培养

10、基：用人工方法将多种营养物质按微生物生长代谢的需要配制成的一种营养基质。2.培养基营养物质来源：水，碳源，氮源，矿质营养，生长因素或生长因子。3.培养基的分类：按照配制培养基的营养物质来源可分为：（1）天然培养基 ：利用天然的有机物配制而成的培养基。如：牛肉膏蛋白胨培养基。 （2）半合成培养基：既有天然物质又含化学试剂的培养基称半合成培养基。如马铃薯蔗糖培养基。（3）合成培养基：采用多种化学试剂配制的，各种成分及其用量都确切知道的培养基。如高氏一号培养基。根据培养基制成后的物理状态可分为：（1）液体培养基：呈液体状态的培养基。（2）固体培养基：外观呈固体状态的培养基。（3）半固体培养基：将各种

11、营养成份按比例配制成营养液后，加入适量固化剂 ，处于半固体状态的培养基。根据培养基的功能和用途可分为：（1）基础培养基： 含有多数有机营养型细菌所需养分。（2）加富培养基：加入有利于某类微生物生长繁殖所需的营养物质，使其增值速度快于其他微生物。（3）选择培养基：加入某些物质或除去某些营养物质以阻抑其他微生物生长，从而有利于某一类群或某一目标微生物生长。（4）鉴别培养基：用来检查微生物的某些代谢特性。4.培养基的制备原则（1）有供微生物生长发育的各种营养物质及足够的水分；（2）有合适的酸碱度；（3）绝对无菌；（4）均质透明(以便观察微生物生长现象)；（5）材料和容器应没有抑制细菌生长的物质（如不

12、能用铁锅和铜锅）。5、高压蒸汽灭菌高压蒸汽灭菌法是在密闭的加压容器内进行，加热使器内的水产生蒸汽，由于密闭，增加了器内的压力，使水的沸点升高，从而获得高于100度的蒸汽温度，导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。高压蒸汽灭菌法为湿热灭菌法，其优点有三：一是湿热灭菌时菌体蛋白容易变性，二是湿热穿透力强，三是蒸气变成水时可放出大量热增强杀菌效果，因此，它是效果最好的灭菌方法。适用于一般培养基、玻璃器皿、无菌水、金属用具。一般培养基在121.3灭菌20min即可。四、实训步骤（一）培养基的制备称量溶解调节pH值过滤分装、包扎灭菌1.称量按照培养基配方，准确称量各成份放于锥形瓶中。配方：牛肉膏0.6

13、g,蛋白胨2.0g，氯化钠1.0g,琼脂4.0g。先加入其它成分，加水溶解后再加琼脂。2.溶解向上述烧杯中先加入少于所需要的水量，用玻璃棒搅拌，药品完全溶解后，将称好的琼脂放入已溶的药品中，然后在电热套上加热使其溶解，或磁力搅拌使其溶解，补充水到所需总体积200ml。（在琼脂的熔化过程中，需不断搅拌，并控制火力不要使培养基溢出或烧焦。待完全熔化后，补足所损失水分。） 3.调节pH值用玻璃棒沾少许液体，测pH值。用氢氧化钠或盐酸调节pH至7.27.4。注：培养基经高压灭菌后pH值一般要降低0.1-0.2，所以在灭菌前调pH值时要相应提高。4.包扎瓶口塞上棉塞，用报纸（或牛皮纸）包好。6.灭菌：高

14、压蒸汽灭菌，121灭菌20分钟。具体请参考视频：“培养基的配制和灭菌消毒”（04：4016：35）、“学习微生物培养的基本技术”（开始15：55）。另：配制生理盐水，一共配制2000 ml，全班共用。 配方：氯化钠 18 g 蒸馏水2000ml溶解后，121，20 min高压灭菌备用。（二）培养基的灭菌加压蒸汽灭菌法 重点掌握：高压灭菌锅的使用高压蒸汽灭菌法是在密闭的加压容器内进行，加热使器内的水产生蒸汽，由于密闭，增加了器内的压力，使水的沸点升高，从而获得高于100度的蒸汽温度，导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。高压蒸汽灭菌法为湿热灭菌法，其优点有三：一是湿热灭菌时菌体蛋白容易变性，二

15、是湿热穿透力强，三是蒸气变成水时可放出大量热增强杀菌效果，因此，它是效果最好的灭菌方法。适用于一般培养基、玻璃器皿、无菌水、金属用具。一般培养基在121.3灭菌20min即可。（手提式）高压蒸汽灭菌器使用方法：1、加水（约3L）至外筒内，被灭菌物品放入内筒。注：水浸没电热丝约一个指头（也不要太多）；锅内积水要清理掉。2、将顶盖上的排气管插入消毒桶内壁的方管中（无软管或软管锈蚀破裂的灭菌器不得使用），盖上灭菌器盖，拧紧螺旋使之密闭。注：拧螺丝要对称拧，不要一次拧紧，约3次拧紧。3、打开排气阀，通电加热，使水沸腾以排净其中冷空气。待冷空气全部排出后，关闭（盖回）排气阀。注：若不将锅内的冷空气排净，

16、压力与温度不能同步上升，出现低温高压现象，影响灭菌效果。4、继续加热，待压力表渐渐升至所需压力时(一般是0.11Mpa，即15磅/英寸2，温度为121)，开始计时，至126（0.14Mpa）关闭电源，降压，至121再打开电源，如此循环约15-20min。5、灭菌时间到达后，停止加热（断电）。注：不要立即打开气阀！6、待压力表降至零时，慢慢打开排气阀，排除余气，开盖取物。注：切不可在压力尚未降低为零时突然打开排气阀门，以免灭菌器中液体喷出。灭菌后注意事项：1、灭菌后物品，按正常情况已属无菌，从灭菌器中取出应仔细检查，以免再度污染。2、物品取出，随即检查包装的完整性，若有破坏或棉塞脱掉，不可作为无

17、菌物品使用。3、取出的物品，如为包装有明显的水浸者，不可作为无菌物品使用。4、培养基或试剂等，应检查是否符合达到灭菌后的色泽或状态，未达到者应废弃。5、取出的物品掉落在地或误放不洁之处，或沾有水液，均视为受到污染，不可作为无菌物品使用。6、取出的合格灭菌物品，应存放于贮藏室或防尘柜内，严禁与未灭菌物品混放。7、凡属合格物品，应标有灭菌日期及有效期限（灭菌包在未污染和干燥的情况下，5月1日9月30日有效期为1周，10月1日次年4月30日有效期为2周，过期要重新灭菌。）。8、每批灭菌处理完成后，记录灭菌品名、数量、温度、时间、操作者。9、如要求严格的实训，灭好菌的培养基一般要观察1-4天，确定彻底

18、灭菌后才使用。具体请参考视频：“培养基的配制和灭菌消毒”、“学习微生物培养的基本技术”相关内容。五、思考题1、 固体培养基加琼脂后加热溶化时要注意哪些问题？2、 培养基中加琼脂的作用是什么？3、 如何检查培养基灭菌是否彻底？六、实训作业 认真完成实训记录报告。实训三 化妆品日化品菌落总数的测定一、实验原理菌落总数（aerobic bacterial count）是指化妆品检样经过处理，在一定条件下培养后（如培养基成分、培养温度、培养时间、pH值、需氧性质等），1g（1mL）检样中所含菌落的总数。所得结果只包括一群本方法规定的条件下生长的嗜中温的需氧性菌落总数。常用的方法是稀释平板计数法。稀释平

19、板计数是根据微生物在固体培养基上所形成的单个菌落，是由一个单细胞繁殖而成这一培养特征设计的计数方法，即一个菌落代表一个单细胞。计数时，首先将待测样品制成均匀的系列稀释液，尽量使样品中的微生物细胞分散开，使成单个细胞存在 （否则一个菌落就不只是代表一个细胞），再取一定稀释度、一定量的稀释液接种到平板中，使其均匀分布于平板中的培养基内。经培养后，由单个细胞生长繁殖形成菌落，统计菌落数目，即可计算出样品中的含菌数。此法所计算的菌数是培养基上长出来的菌落数，故又称活菌计数。一般用于某些成品检定（如化妆品、日化品等）、生物制品检验、土壤含菌量测定及食品、水源的污染程度的检验等。 测定菌落总数便于判明样品

20、被细菌污染的程度，是对样品进行卫生学总评价的综合依据。二、主要仪器和设备锥形瓶、量筒、pH计或pH试纸、高压灭菌器、试管、平皿（直径9cm）、吸管（10mL）、酒精灯、恒温培养箱、放大镜。三、操作步骤（一）培养基和试剂的制备与灭菌（实训二已完成） （二）供检样品的制备（各小组可自备供检样品）1、液体样品（香水、花露水、洗手液等）本实验主要用水溶性的液体样品，吸取10mL加到90mL灭菌生理盐水中，混匀后，制成1:10检液。2、膏、霜、乳剂半固体状样品（牙膏、沐浴露等）本实验主要用亲水性的样品，称取10g，加到装有玻璃珠及90mL灭菌生理盐水的三角瓶中，充分振荡混匀，静置15min。取其上清液作

21、为1:10的检液。3、固体样品（口红、粉剂等化妆品样品）称取10g，加到90mL灭菌生理盐水中，充分振荡混匀，使其分散混悬，静置后，取上清液作为1:10的检液。注意：吸管使用（打开方式、取液、调节液面、放液）；试管、锥形瓶操作（开塞、管口灭菌、持法、盖塞）。（三）样品的稀释参考视频：“平板菌落计数”、“菌落总数检验方法”、“稀释平板测数法”，及“稀释平板计数法课件”。1、用灭菌吸管吸取1:10稀释的检液2mL，分别注入到两个灭菌平皿内，每皿1mL。另取1mL注入到9mL灭菌生理盐水试管中（注意勿使吸管接触液面），并振摇试管使其充分混匀【扣分点】，制成1:100检液。振摇时，幅度为30cm，7s

22、内振摇25次。从容器中吸取样品匀液和以后的稀释操作中，吸管尖不要碰着瓶口。吸入的液体应先高于所要求的刻度，然后提起吸管使其尖端离开液面并贴在容器内壁将液体调至所要求的刻度。2、更换一支吸管，吸取2mL 1:100检液，分别注入到两个灭菌平皿内，每皿1mL。另取1mL注入到9mL灭菌生理盐水试管中，制成1:1000检液，并吸取2mL 1:1000检液，分别注入到两个灭菌平皿内，每皿1mL。【扣分点：（各步骤）酒精灯无菌区操作，接种（换管、培养皿个数）】3、将融化并冷至4550的培养基（使用前可放置于461水浴保温）倾注到平皿内，每皿约15mL20mL，随即转动平皿，使样品与培养基充分混合均匀。【

23、扣分点：加培养基（培养皿持法、加入量、污染皿壁、混匀、）】另取一个不加样品（加入1mL稀释液）的灭菌空平皿，加入约15mL20mL培养基，待琼脂凝固后，翻转平皿，为空白对照【扣分点：是否进行】。混合时要防止把混合物溅到平皿壁和盖上。将样品液加入平皿后应立即倾注琼脂培养基，每个样品从开始稀释到倾注最后一个平皿所用的时间不得超过20min。（四）样品的培养待琼脂凝固【扣分点：是否凝固】后，翻转培养皿【扣分点：是否进行】，置361恒温箱内培养24-48h。注：微生物培养时一般培养基中的水分含量较高，且培养温度一般较高，如果不将培养皿翻转，培养基中的水分会挥发出来，造成培养基中的水分损失，另外，挥发出

24、来的水分会在培养皿盖子上凝结成水珠，水珠较大时会滴落下来，对菌落生长和菌落形态都会造成影响。因此，为了避免这两方面的影响应将培养皿翻转过来。（五）菌落计数与记录培养后，立即计数每个平板上的菌落数。如不能立即计数，应将平板存放于0-4，但不得超过24h。 先用肉眼观察，点数菌落数，然后再用放大510倍的放大镜检查，以防遗漏。记下各平皿的菌落数后，求出同一稀释度各平皿生长的平均菌落数。若平皿中有连成片状的菌落或花点样菌落蔓延生长时，该平皿不宜计数。若片状菌落不到平皿中的一半，而其余一半中菌落数分布又很均匀，则可将此半个平皿菌落计数后乘以2，以代表全皿菌落数。操作者对同一平板复核自己的计数结果，其差

25、异应在5之内，而其他人对这一平板重复计数，其差异应在10这内。否则，应找出原因，加以校正。记录时，只有在换算到每克（毫升）样品中平板菌落数时，才能定下两位有效数字，第三位数字采用四舍五入的方法记录。也可将样品的平板菌落数记录为10的指数形式。（六）菌落计算及报告方法1、首先选取平均菌落数在30300个之间的平皿，作为菌落总数测定的范围。当只有一个稀释度的平均菌落数符合此范围时，即以该平皿菌落数乘其稀释倍数（见表1中例1）。2、若有两个稀释度，其平均菌落数均在30300个之间，则应求出两菌落总数之比值来决定，若其比值小于或等于2，应报告其平均数，若大于2则报告其中稀释度较低的平皿的菌落数（见表1

26、中例2及例3）。3、若所有稀释度的平均菌落数均大于300个，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告之（见表1中例4）。4、若所有稀释度的平均菌落数均小于30个，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告之（见表1例5）。5、若所有稀释度的平均菌落数均不在30300个之间，其中一个稀释度大于300个，而相邻的另一稀释度小于30个时，则以接近30或300的平均菌落数乘以稀释倍数报告之（见表1中例6）。6、若所有的稀释度均无菌生长，报告数为每g或每mL小于10CFU。7、菌落计数的报告，菌落数在10以内时，按实有数值报告之，大于100时，采用二位有效数字，在二位有效数字后面的数值，应以四舍五

27、入法计算。为了缩短数字后面零的个数，可用10的指数来表示（见表1报告方式栏）。在报告菌落数为“不可计”时，应注明样品的稀释度。表1 菌落计数结果及报告方式例 次不同稀释度平均菌落数10-1 10-2 10-3两稀释度菌数之比菌落总数 CFU/mL或 CFU/g 报告方式 CFU/mL或 CFU/g11365 164 20 1640016000 或 1.610422760 295 46 1.6 3800038000或3.810432890 271 60 2.2 2710027000 或 2.71044不可计 4650 513 513000510000 或 5.11055 27 11 5 2702

28、70或 2.71026不可计 305 12 3050031000 或 3.11047 0 0 0 1010 CFU：菌落形成单位。注：数据计算及结果报告可参考国标及课件。四、实训作业认真完成实训记录报告。实训四 光学显微镜的使用一、实训目的1、能说出普通光学显微镜的构造、工作原理和保养方法；2、能熟练使用普通光学显微镜进行微生物检验。二、实训原理普通光学显微镜的构造可分为两大部分：一为机械装置，一为光学系统，这两部分很好的配合，才能发挥显微镜的作用。1、显微镜的机械装置显微镜的机械装置包括镜座、镜筒、物镜转换器、载物台、推动器、粗动螺旋、微动螺旋等部件。（1）镜座 镜座是显微镜的基本支架，它由

29、底座和镜臂两部分组成。在它上面连接有载物台和镜筒，它是用来安装光学放大系统部件的基础。（2）镜筒 镜筒上接接目镜，下接转换器，形成接目镜与接物镜（装在转换器下）间的暗室。从物镜的后缘到镜筒尾端的距离称为机械筒长。因为物镜的放大率是对一定的镜筒长度而言的。镜筒长度的变化，不仅放大倍率随之变化，而且成像质量也受到影响。因此，使用显微镜时，不能任意改变镜筒长度。国际上将显微镜的标准筒长定为160mm，此数字标在物镜的外壳上。（3）物镜转换器 物镜转换器上可安装34个接物镜，一般是三个接物镜（低倍、高倍、油镜）。Nikon显微镜装有四个物镜。转动转换器，可以按需要将其中的任何一个接物镜和镜筒接通，与镜

30、筒上面的接目镜构成一个放大系统。（4）载物台 载物台中央有一孔，为光线通路。在台上装有弹簧标本夹和推动器，其作用为固定或移动标本的位置，使得镜检对象恰好位于视野中心。（5）推动器 是移动标本的机械装置，它是由一横一纵两个推进齿轴的金属架构成的，好的显微镜在纵横架杆上刻有刻度标尺，构成很精密的平面座标系。如果我们须重复观察已检查标本的某一部分，在第一次检查时，可记下纵横标尺的数值，以后按数值移动推动器，就可以找到原来标本的位置。（6）粗动螺旋 粗动螺旋是移动镜筒调节接物镜和标本间距离的机件，老式显微镜粗螺旋向前扭，镜头下降接近标本。新近出产的显微镜（如Nikon显微镜）镜检时，右手向前扭载物台上

31、升，让标本接近物镜，反之则下降，标本脱离物镜。（7）微动螺旋 用粗动螺旋只可以粗放的调节焦距，要得到最清晰的物象，需要用微动螺旋做进一步调节。微动螺旋每转一圈镜筒移动0.1毫米（100微米）。新近出产的较高档次的显微镜的粗动螺旋和微动螺旋是共轴的。2、显微镜的光学系统显微镜的光学系统由反光镜，聚光器，接物镜，接目镜等组成，光学系统使物体放大，形成物体放大像 。（1）反光镜 较早的普通光学显微镜是用自然光检视物体，在镜座上装有反光镜。反光镜是由一平面和另一凹面的镜子组成，可以将投射在它上面的光线反射到聚光器透镜的中央，照明标本。不用聚光器时用凹面镜，凹面镜能起会聚光线的作用。用聚光器时，一般都用

32、平面镜。新近出产的较高档次的显微镜镜座上装有光源，并有电流调节螺旋，可通过调节电流大小调节光照强度。（2）聚光器 聚光器在载物台下面，它是由聚光透镜、虹彩光圈和升降螺旋组成的。其作用是将光源经反光镜反射来的光线聚焦于样品上，以得到最强的照明，使物象获得明亮清晰的效果。聚光器前透镜组前面还装有虹彩光圈，它可以开大和缩小，影响着成像的分辨力和反差，若将虹彩光圈开放过大，超过物镜的数值孔径时，便产生光斑；若收缩虹彩光圈过小，分辨力下降，反差增大。因此，在观察时，通过虹彩光圈的调节再把视场光阑（带有视场光阑的显微镜）开启到视场周缘的外切处，使不在视场内的物体得不到任何光线的照明，以避免散射光的干扰。（

33、3）物镜 安装在镜筒前端转换器上的接物透镜利用光线使被检物体第一次造像，物镜成像的质量，对分辨力有着决定性的影响。物镜的性能取决于物镜的数值孔径（numerical apeature简写为NA），每个物镜的数值孔径都标在物镜的外壳上，数值孔径越大，物镜的性能越好。物镜的种类很多，可从不同角度来分类：根据物镜前透镜与被检物体之间的介质不同，可分为：干燥系物镜 以空气为介质，如常用的40以下的物镜，数值孔径均小于1。油浸系物镜 常以香柏油为介质，此物镜又叫油镜头，其放大率为90100，数值孔值大于1。根据物镜放大率的高低，可分为：低倍物镜 指16，NA值为0.040.15；中倍物镜 指625，NA

34、值为0.15 0.40；高倍物镜 指2563，NA值为0.350.95；油浸物镜 指90100，NA值为1.251.40。（4）目镜 目镜的作用是把物镜放大了的实像再放大一次，并把物像映入观察者的眼中。目镜的结构较物镜简单，普通光学显微镜的目镜通常由两块透镜组成，上端的一块透镜称“接目镜”，下端的透镜称“场镜”。上下透镜之间或在两个透镜的下方，装有由金属制的环状光阑或叫“视场光阑”，物镜放大后的中间像就落在视场光阑平面处，所以其上可安置目镜测微尺。显微镜的几个常用系数：a.放大倍数=接物镜放大倍数接目镜放大倍数 b.分辨率 ： 是表示显微镜辨析物体（两端）两点之间距离的能力。c.数值孔径 ：也

35、叫做镜口率（或开口率），它与显微镜的分辨力成正比，与焦深成反比，与镜象亮度的平方根成正比。三、实训器材1、显微镜、香柏油、二甲苯、擦镜纸、吸水纸等。2、微生物玻片标本或待测样品标本。四、实训步骤显微镜结构精密，使用时必须细心，要按下述操作步骤进行。（一）观察前的准备1、显微镜从显微镜柜或镜箱内拿出时，要用右手紧握镜臂，左手托住镜座，平稳地将显微镜搬运到实验桌上。2、将显微镜放在自己身体的左前方，离桌子边缘约10cm左右，右侧可放记录本或绘图纸。3、调节光照 不带光源的显微镜，可利用灯光或自然光通过反光镜来调节光照，但不能用直射阳光，直射阳光会影响物像的清晰并刺激眼睛。将10物镜转入光孔，将聚光

36、器上的虹彩光圈打开到最大位置，用左眼观察目镜中视野的亮度，转动反光镜，使视野的光照达到最明亮最均匀为止。光线较强时，用平面反光镜，光线较弱时，用凹面反光镜。自带光源的显微镜，可通过调节电流旋钮来调节光照强弱。4、调节光轴中心 显微镜在观察时，其光学系统中的光源、聚光器、物镜和目镜的光轴及光阑的中心必须跟显微镜的光轴同在一直线上。带视场光阑的显微镜，先将光阑缩小，用10物镜观察，在视场内可见到视场光阑圆球多边形的轮廓像，如此像不在视场中央，可利用聚光器外侧的两个调整旋钮将其调到中央，然后缓慢地将视场光阑打开，能看到光束向视场周缘均匀展开直至视场光阑的轮廓像完全与视场边缘内接，说明光线已经合轴。（

37、二）低倍镜观察 镜检任何标本都要养成必须先用低倍镜观察的习惯。因为低倍镜视野较大，易于发现目标和确定检查的位置。将标本片放置在载物台上，用标本夹夹住，移动推动器，使被观察的标本处在物镜正下方，转动粗调节旋钮，使物镜调至接近标本处，用目镜观察并同时用粗调节旋钮慢慢升起镜筒（或下降载物台），直至物像出现，再用细调节旋钮使物像清晰为止。用推动器移动标本片，找到合适的目的像并将它移到视野中央进行观察。（三）高倍镜观察 在低倍物镜观察的基础上转换高倍物镜。较好的显微镜，低倍、高倍镜头是同焦的，在正常情况下，高倍物镜的转换不应碰到载玻片或其上的盖玻片。若使用不同型号的物镜，在转换物镜时要从侧面观察，避免镜

38、头与玻片相撞。然后从目镜观察，调节光照，使亮度适中，缓慢调节粗调节旋钮，使载物台上升（或镜筒下降），直至物像出现，再用细调节旋钮调至物像清晰为止，找到需观察的部位，并移至视野中央进行观察。（四）油镜观察 油浸物镜的工作距离（指物镜前透镜的表面到被检物体之间的距离）很短，一般在0.2mm以内，再加上一般光学显微镜的油浸物镜没有“弹簧装置”，因此使用油浸物镜时要特别细心，避免由于“调焦”不慎而压碎标本片并使物镜受损。使用油镜按下列步骤操作：1、先用粗调节旋钮将镜筒提升（或将载物台下降）约2cm，并将高倍镜转出。2、在玻片标本的镜检部位滴上一滴香柏油。3、从侧面注视，用粗调节旋钮将载物台缓缓地上升，

39、（或镜筒下降），使油浸物镜浸入香柏油中，使镜头几乎与标本接触。4、从接目镜内观察，放大视场光阑及聚光镜上的虹彩光圈（带视场光阑油镜开大视场光阑），上调聚光器，使光线充分照明。用粗调节旋钮将载物台徐徐下降（或镜筒上升），当出现物像一闪后改用细调节旋钮调至最清晰为止。如油镜已离开油面而仍未见到物象，必须再从侧面观察，重复上述操作。5、观察完毕，下降载物台，将油镜头转出，先用擦镜纸擦去镜头上的油，再用擦镜纸蘸少许乙醚酒精混合液（乙醚2份，纯酒精3份）或二甲苯，擦去镜头上残留油迹，最后再用擦镜纸擦拭23下即可，（注意向一个方向擦拭）。6、将各部分还原，转动物镜转换器，使物镜头不与载物台通光孔相对，而是

40、成八字形位置，再将镜筒下降至最低，降下聚光器，反光镜与聚光器垂直，用一个干净手帕将接目镜罩好，以免目镜头沾污灰尘。最后用柔软纱布清洁载物台等机械部分，然后将显微镜放回柜内或镜箱中。五、注意事项1、学生使用显微镜固定镜号、位置，后面的实训一直使用本台显微镜。2、不准擅自拆卸显微镜的任何部件，以免损坏。3、镜面只能用擦镜纸擦，不能用手指或粗布，以保证光洁度。 4、观察标本时，必须依次用低、高倍镜，最后用油镜。当目视接目镜时，特别在使用油镜时，切不可使用粗调节器，以免压碎玻片或损伤镜面。 5、观察时，两眼睁开，养成两眼能够轮换观察的习惯，以免眼睛疲劳，并且能够在左眼观察时，右眼注视绘图。 6、拿显微

41、镜时，一定要右手拿镜臂，左手托镜座，不可单手拿，更不可倾斜拿。 六、实训作业认真完成实训记录报告。实训五 微生物的染色一、实训目的 能熟练进行微生物涂片、简单染色操作。二、实训原理用单一染料进行细菌染色，操作简便，适于菌体一般形状和细菌排列的观察。 常用碱性染料进行简单染色，这是因为：在中性、碱性或弱碱性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，而碱性染料在电离时，其分子的染色部分带正电荷（酸性染料电离时，其分子的染色部分带正电荷），因此碱性染料的染色部分很容易与细菌结合使细菌着色，经染色后的细菌细胞与背景形成鲜明的对比，在显微镜下易于识别。常用作简单染色的染料有：美蓝、结晶紫、碱性复红等。三、实训器材1

42、、仪器和材料：显微镜、载玻片、接种环、擦镜纸、烧杯、滴管、洗瓶、香柏油、二甲苯、生理盐水、吸水纸。2、染色液：吕氏碱性美篮染液、石炭酸复红或草酸铵结晶紫。3、菌种：大肠杆菌、枯草芽孢杆菌。四、实训步骤1、涂片 取两块载玻片，各滴一小滴蒸馏水于玻片中央，用接种环以无菌操作分别从培养1416h的枯草芽孢杆菌和培养24h的大肠杆菌的斜面上挑取少量菌苔于水滴中，混匀并涂成薄膜。载玻片要洁净无油迹；滴蒸馏水和取菌不宜过多；涂片要均匀，不宜过厚。2、干燥 室温自然干燥。3、固定 固定时通过火焰23次即可。此过程称热固定，其目的是使细胞质凝固，以固定细胞形态，并使之牢固附着在载玻片上。热固定温度不宜过高，以

43、载玻片背面不烫手为宜，否则会改变甚至破坏细胞形态。4、染色 染色 滴加染液于涂片上(染液刚好覆盖涂片薄膜为宜)。吕氏碱性美蓝染色12min；石炭酸复红或草酸铵结晶紫染色约1min。 水洗 倾去染液，用自来水冲洗，直至涂片上流下的水无色为止。水洗时，不要直接冲洗液面，而应使水从载玻片的一段流下，水流不易过急过大，以免涂片薄膜脱落。 干燥 自然干燥或用电吹风吹干，也可用吸水纸吸干。 镜检 涂片干燥后镜检。 清理 实训完毕后，对所用的显微镜进行整理，及时用二甲苯擦拭油镜头，再用擦镜纸抹去残留的二甲苯；有菌的涂片放入消毒液中浸泡，然后用洗衣粉水煮沸，再用自来水冲洗并沥干。试验台清理干净，用消毒液洗手。

44、五、实训作业认真完成实训记录报告。六、拓展 微生物的革兰氏染色。实训六 微生物大小的测定及直接计数（1）一、实训目的1、能说出血球计数板的构造、原理和使用方法。2、 能熟练运用血球计数板测定微生物的数量。二、实训原理显微直接计数法，即利用血球计数板在显微镜下直接计数，是一种常用的微生物计数方法，各种单细胞菌体的纯培养悬浮液、菌体较大的酵母菌、霉菌孢子、放线菌和真菌的原生质体等均可采用血球计数板计数。将孢子悬液（或菌悬液）放在血球计数板载玻片与盖玻片之间的计数室内，由于载玻片上的计数室盖上盖玻片后的容积（0.1mm3）是一定的，所以可以根据在显微镜下观察到的微生物数目换算为单位体积内的微生物数目。样品中菌（或孢子）数（个/ml）每小格的平均数 稀释倍数在这一公式中，1000代表1ml的容积（即1000mm3），0.00025为每一小格的容积（即0.00025mm3），上面公式可进一步改写为：样品中菌（或孢子）数（个/ml）每小格的平均数稀释倍数