菌种的管理和保藏

1、 菌种的保藏和管理菌种的保藏和管理 杜平华 菌种保藏的重要性菌种保藏的重要性 菌种保藏是微生物检验工作中的一项常规技术菌种保藏是微生物检验工作中的一项常规技术 科学保藏和管理关系到检验结果的正确性科学保藏和管理关系到检验结果的正确性. . 菌种的菌种的20152015版指导原则版指导原则 原则：原则： 应来自认可的国内或国外菌种保藏机构的标准菌株，或使用与标准菌应来自认可的国内或国外菌种保藏机构的标准菌株，或使用与标准菌株所有相关特性等效的商业派生菌株。株所有相关特性等效的商业派生菌株。 使用菌种来源使用菌种来源 菌种编号菌种编号 20152015版版 CMCC CMCC 中国医学菌种保藏中心

2、中国医学菌种保藏中心 CMCC CMCC（F F）真菌真菌 CMCCCMCC（B B）细菌细菌 协调案协调案 ATCC ATCC 美国标准菌种收藏中心美国标准菌种收藏中心 NCIMB NCIMB 英国食品工业与海洋菌种保藏中心英国食品工业与海洋菌种保藏中心 NBRC NBRC 日本技术评价研究所生物资源中心日本技术评价研究所生物资源中心 CIP CIP 法国巴斯德研究所菌种保藏中心法国巴斯德研究所菌种保藏中心 菌种保藏的中心任务菌种保藏的中心任务- - 广泛收集。广泛收集。 - - 选择最适宜的保藏方法，保持菌种的生物学特性。选择最适宜的保藏方法，保持菌种的生物学特性。 常用菌种的保藏常用菌种

3、的保藏菌种保藏的原则菌种保藏的原则 根据微生物菌种的生理、生化特性，尽量降低微生物细胞的代谢根据微生物菌种的生理、生化特性，尽量降低微生物细胞的代谢强度，处于休眠状态，以减低菌种的变异率。强度，处于休眠状态，以减低菌种的变异率。 常用菌种的保藏常用菌种的保藏20152015指导原则指导原则试验用菌株的传代次数不得超过试验用菌株的传代次数不得超过5 5代（从菌种保藏中心获得的冷冻干燥菌代（从菌种保藏中心获得的冷冻干燥菌种为第种为第0 0代）。代）。采用适宜的菌种保藏技术进行保存，以保证试验菌株的生物学特性采用适宜的菌种保藏技术进行保存，以保证试验菌株的生物学特性。冷冻保藏：冷冻保藏：在低温下保藏

4、，一般在低于在低温下保藏，一般在低于-30-30或或-70-70，是有效的长期储藏方法。，是有效的长期储藏方法。冻干法保藏冻干法保藏：是一种长期保藏菌种的方法法。：是一种长期保藏菌种的方法法。冷藏：冷藏：在在2 288保藏，是短期储藏方法。保藏，是短期储藏方法。 菌种的保藏菌种的保藏低温、干燥、缺氧、缺乏营养等环境条件都可以抑制微生物的代谢和生长繁低温、干燥、缺氧、缺乏营养等环境条件都可以抑制微生物的代谢和生长繁殖，因此低温、干燥和真空是菌种保藏的重要手段。殖，因此低温、干燥和真空是菌种保藏的重要手段。 菌种的保藏 工作菌株不可代替标准菌株，标准菌株的商业衍生物仅可用作 工作菌株。 菌种的保藏

5、 不同的微生物，应根据其生物特征来选择最适宜的保藏方法： 挑选特征典型的纯菌菌落 确定保藏的合适菌体形态 选择最适宜的方法保藏 定期检查 菌种的保藏 液氮超低温保藏法 超低温广泛数十年复杂、需要专门设备，有效冷冻真空干燥保藏法 干燥、缺氧、低温 广泛510年以上复杂、需要专门设备和方法，有效干燥（沙土、牛奶）保藏法 干燥、无营养 产孢微生物110年较简便，需制备沙土管，有效液体石蜡保藏法低温、缺氧广泛1年以上简便琼脂斜面低温保藏法 低温 4 广泛短时间简便液体冷液体冷冻保藏冻保藏法法 液体培养基 低温 广泛半年以上简便一定比例甘油 低温、缺氧 广泛数十年以上简便瓷珠冷冻保藏法 低温 广泛1年以

6、上简便 琼脂斜面低温保藏法 液体冷冻保藏法液体冷冻保藏法 1%蛋白胨 、甘油 ,灭菌,接种、培养18-24小时. 保存条件 -80可保存数年. 菌种的传代和使用 工作菌种传代次数不得超过5代。 1代 是指将活的培养物接种到新鲜培养基中，任何亚培养的形式均被认为是转种或传代一次。 基本操作技术 细菌的接种、分离和培养 接种：将微生物的培养物接种到培养基上的一种操作技术。 接种： 斜面培养基 半固体培养基 液体培养基 平板培养基分离技术分离技术 将细菌分离成单个细胞，使其独立分裂繁殖形成单个菌落的操作技术。 方法 平板划线 - 分段划线、连续划线 涂布分离法 倾注分离法等 培养培养接种后的培养基，

7、根据不同微生物生长条件的要求，培养基放在适宜 微生物生长的环境中温度、湿度、氧气等），使其生长繁殖的过程。 需气菌培养法: 嗜温性微生物：1545。 嗜热性微生物：45以上。 嗜冷性微生物：15以下。 培养后微生物的生长判断固体培养基 有菌落生长或沿穿刺线扩散生长。液体培养基 浑浊、菌膜、沉淀等。 菌种的传代和使用冻干菌种（0代） 增菌培养 苏醒（1代） 增菌培养 复壮（2代） 分装冷冻保存 斜面培养基 划线传代（3代） 使用 分装冷冻保存 斜面培养基 划线传代（4代） 使用 分装冷冻保存 斜面培养基 划线传代（5代） 使用 分装冷冻保存。斜面培养物1 3环 适宜液体培养基510ml，培养18

8、24h 取适 当量，用灭菌生理盐水稀释后比浊（或预实验） 按比浊结果或预实验将菌液稀释到相应倍数 平板计数(取上述稀释液1ml加入平皿中加入 规定培养基、培养、点计菌落数 实验、阳性对照 平板计数也可和试验同时进行 菌液的制备和使用 修订前 修订后营养肉汤培养基中或营养琼脂培养基；改良马丁培养基或改良马丁琼脂培养基。 胰酪大豆胨琼脂或胰酪大豆胨肉汤培养基；沙氏葡萄糖琼脂或沙氏葡萄糖肉汤培养基；马铃薯葡萄糖琼脂 。 菌液制备用培养基2015修订内容 菌株 培养基 培养温度()培养时间( h )枯草芽孢杆菌铜绿假单胞菌金黄色葡萄球菌胰酪大豆胨琼脂或胰酪大豆胨肉汤。沙氏葡萄糖琼脂或沙氏沙氏葡萄糖琼脂

9、或马铃薯葡萄糖琼脂葡萄糖肉汤303520252025182423天57天，或直到获得丰富的孢子 菌液制备用培养基2015修订内容 修订前 修订后 0.9氯化钠溶液 pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液。 0.9%无菌氯化钠溶液。 菌液制备用稀释液2015修定内容 菌液菌液贮存贮存20152015修定内容修定内容 修订前 修订后 菌液制备后若在室温下放置，应在2小时内使用；若保存在2-8，可在24小时内使用。 稳定的黑曲孢子悬液可保存在2-8，在验证过的贮存期内使用。 菌种的鉴定与复壮 菌种的衰退 由自发突变的作用而引起某些优良特性变弱或消失的现象。 控制菌种的衰退方法 - 控制传代次数 降低突变

10、几率，采用良好的传代保藏方法。- 创造适宜的培养条件： - 用不同类型的细胞进行传代 - 采用有效的保藏方法 定期检查 菌种的复壮采用分离纯化的方法。-形 态 特 征 、 生 理 生 化 特 征 、 代 谢 产 物 、 血 清 学 等 一系列试验鉴定，证明复壮后的菌种与原种完全一致。 菌种的鉴定与复壮 微生物鉴定系统是基于不同的分析方法，其局限性与方法和数据库的局限性有关。 微生物鉴定需通过已建立的标准微生物如模式菌株的特征(基因型和/或表型)相匹配来完成。否则将得不到鉴定的结果. 明确鉴定系统局限性和需要的鉴定水平(属、种、型)。 菌种的鉴定鉴定方法传统方法 增菌分离(纯菌)确认试验(氧化酶

11、试验 革兰氏阴性菌、非发酵的棒状细菌+ 肠道菌-过氧化氢酶试验 葡萄球菌+ 链球菌-凝固酶试验+ 葡萄球菌可能为致病菌以上信息对大部分类型的生产环境中的微生物的调查及日常分析，已可提供足够的信息。 2015版-指导原则 菌种的鉴定 纯菌的分离 微生物的表型表型微生物鉴定通过长时间培养对微生物细胞的恢复、增殖是有限的，如有些环境中的微生物在普通微生物增殖培养基不能恢复。此外，分离出的受损的培养物可能不能完整表达其表型属性。基因型微生物鉴定 菌种的鉴定微生物分类中使用的表型特征分类 特征培养物 菌落形态学、 菌落颜色、形状、大小和产色素形态学 细胞形态学、细胞大小、细胞形状、鞭毛类型、内容 物、革

12、兰氏染色、芽孢和抗酸染色、孢子形成模式生理学 氧气耐受性、pH范围、最适温度和范围、耐盐性生化反应 碳源的利用、碳水化合物的氧化或发酵、酶的模式抑制性 胆盐耐受性、抗生素敏感性、染料耐受性血清学 凝集反应、荧光抗体化学分类 脂肪酸构成、微生物毒素、全细胞组分 生态学微 生物来源 菌种的鉴定保藏环境 冷藏或冷冻保存。专用的冰箱，上锁。专人保管 按操作规程和有关要求进行保管鉴定,或定期更换冻 干菌种。 发现污染和变异现象，立即报告、处理。 菌种的管理 菌种的管理使用菌种的单位，应具备从事微生物工作的条件和设备。 菌种应由专人负责管理。 管理人员应具有微生物专业知识和技术水平，并应具有较 强的责任心。 菌种的管理实验室必须建立菌种保存和使用文件化的程序管理制度；实验室必须建立菌种保存和使用文件化的程序管理制度； 朔源性朔源性 贮藏贮