分析化学第五版下册-第8章分子发光分析法

1、第第8章章 分子发光分析法分子发光分析法8.1 概论概论8.1.1 分子发光分析法及其分类某些物质的分子吸收一定能量后，电子从基态跃迁到激发态，以光辐射的形式从激发态回到基态，这种现象称为分子发光，在此基础上建立起来的分析方法为分子发光分析法较高激发态较高激发态基基 态态吸收能吸收能量受激量受激光辐射光辐射退激退激分子在退激过程中以光辐射形式释放能量分子在退激过程中以光辐射形式释放能量8.1.2 分子分析法的特点分子分析法的特点1. 灵敏度高荧光强度随激发光强度增强而增强灵敏度荧光分析法比分光光度法高23个数量级2. 选择性好选择不同的激发光波长选择不同的检测荧光波长3. 实验方法简单4. 待

2、测样品用量少；仪器价格适中；测定范围较广 8.2 分析荧光与磷光光谱分析法分析荧光与磷光光谱分析法8.2.1基本原理基本原理8.2.1.1 荧光、磷光产生的机理荧光、磷光产生的机理 基态分子吸收能量基态分子吸收能量( (电能、热能、化学能或光能等电能、热能、化学能或光能等) ) ，电，电子由基态跃迁到激发态，当电子由激发态返回基态时子由基态跃迁到激发态，当电子由激发态返回基态时发射电发射电磁辐射磁辐射(即光即光)的形式释放能量，就称为的形式释放能量，就称为“发光发光”。 M + + 能量能量 M* M + + 热量热量 M + + h 分子吸收了光能而被激发，跃迁至振动能级的三重态或分子吸收了

3、光能而被激发，跃迁至振动能级的三重态或单重态，回到基态所发射的电磁辐射，称为荧光和磷光。单重态，回到基态所发射的电磁辐射，称为荧光和磷光。 M + h M* M + h 荧光和磷光属于光致发光。荧光和磷光属于光致发光。1、荧光、荧光、磷光的产生磷光的产生 依据分子结构理论讨论荧光及磷光的产生机理依据分子结构理论讨论荧光及磷光的产生机理。1. 1. 分子能级与跃迁分子能级与跃迁 分子发光属于分子发射光谱的范畴，光发射过程涉及分子分子发光属于分子发射光谱的范畴，光发射过程涉及分子内部电子能级的跃迁内部电子能级的跃迁。 基态基态(S0)激发态激发态(S1、S2 .) )：吸收特定频率的辐射；量：吸收

4、特定频率的辐射；量子化；跃迁一次到位；子化；跃迁一次到位； 激发态激发态基态：多种途径和方式基态：多种途径和方式, , 速度最快、激发态寿命速度最快、激发态寿命最短的途径占优势最短的途径占优势。 第一、第二、第一、第二、电子激发单重态电子激发单重态 S1 、S2 ； 第一、第二、第一、第二、电子激发三重态电子激发三重态 T1 、 T2 。2.2.电子激发态的多重度电子激发态的多重度 电子激发态的多重度：电子激发态的多重度：M=2S+1 S为电子自旋量子数的代数和为电子自旋量子数的代数和( (0或或1) )。 平行自旋比成对自旋稳定（洪特规则），因此，在同一激平行自旋比成对自旋稳定（洪特规则），

5、因此，在同一激发态中，三重态能级比相应单重态能级低发态中，三重态能级比相应单重态能级低。 大多数有机分子的基态处于单重态大多数有机分子的基态处于单重态。 S0T1 禁阻跃迁；禁阻跃迁；通过其他途径通过其他途径(系间跨系间跨越越)；进入的几率小；进入的几率小。 S2S1S0T1吸吸收收发发射射荧荧光光发发射射磷磷光光系间跨越内转换振动弛豫能量l l 2l l 1l l 3 外转换l l 2T2内转换振动弛豫外转换使荧光或磷光减弱或外转换使荧光或磷光减弱或“猝灭猝灭”。3.3.激发态激发态基态的能量传递途径基态的能量传递途径 电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时，通过辐射电子处于激发态是不稳定状

6、态，返回基态时，通过辐射跃迁跃迁( (发光发光) )和无辐射跃迁和无辐射跃迁( (热热) )等方式失去能量等方式失去能量。传递途径传递途径辐射跃迁辐射跃迁荧光荧光磷光磷光内转移内转移外转移外转移系间跨越系间跨越振动弛豫振动弛豫无辐射跃迁无辐射跃迁 激发态停留时间短、返回速度快的途径，发生的几率大，激发态停留时间短、返回速度快的途径，发生的几率大，发光强度相对大；发光强度相对大；荧光：荧光：10-710 -9 s, 第一激发单重态的最低振动能级第一激发单重态的最低振动能级基态；基态；磷光：磷光：10-410s, 第一激发三重态的最低振动能级第一激发三重态的最低振动能级基态基态。延迟荧光延迟荧光辐

7、射能量传递过程辐射能量传递过程荧光发射：电子由荧光发射：电子由第一激发单重态的最低振动能级第一激发单重态的最低振动能级基态各基态各振动能级振动能级( (为为 S1 S0跃迁跃迁) )，发射波长为，发射波长为 l l 2的荧光；发射时的荧光；发射时间约为间约为10-710 -9 s 。 发射荧光的能量比分子吸收的能量小发射荧光的能量比分子吸收的能量小, ,波长长波长长。 磷光发射磷光发射：电子由电子由第一激发三重态的最低振动能级第一激发三重态的最低振动能级基态基态各各振动能级振动能级(T1 S0跃迁跃迁) 。 发光速度很慢：发光速度很慢： 10-4100 s 。 光照停止后，可持续一段时间。光照

8、停止后，可持续一段时间。 电子由电子由S0进入进入T1的可能过程：（的可能过程：（ S0 T1禁阻跃迁）禁阻跃迁） S0 激发态激发态振动弛豫振动弛豫内转换内转换系间跨越系间跨越振动弛豫振动弛豫 T1 2.荧光、磷光的寿命和量子产率荧光寿命（ ）指的是荧光分子处于 激发态的平均寿命，可用下式表示：f1S)/(1Kkff式中 表示荧光分子发射过程的速度常数， 代表各种分子内的非辐射衰变过程的速度常数的总和。fkK（一）荧光效率 荧光强度常用荧光量子效率f 来描述 荧光量子效率 f =发荧光的分子数发荧光的分子数激发态分子总数激发态分子总数)/(KkkfffKf 为荧光发射过程的速率常数为荧光发射

9、过程的速率常数取决于物质的化学结构。取决于物质的化学结构。K为非辐射跃迁的速率常数之和为非辐射跃迁的速率常数之和主要取决于化学环境，主要取决于化学环境，也与化学结构有关。也与化学结构有关。分析上有应用价值的荧光化合物的荧光效率在分析上有应用价值的荧光化合物的荧光效率在0.11之间。之间。磷光的量子产率磷光的量子产率p与荧光量子产率与荧光量子产率p相似。相似。 jppSTPKKK8.2.1.2 荧光磷光与有机化合物结构的关系物质只有吸收了紫外可见光，发生 *,n *跃迁，产生荧光 *与n *跃迁相比，摩尔吸收系数大102103，寿命短 *跃迁常产生较强的荧光， n *跃迁产生的荧光弱，但可产生系

10、间窜跃，产生更强的磷光1. 共轭 键系统 具有共轭体系的芳环或杂环化合物， 电子共轭程度越大，越易产生荧光; 环越多，共轭程度越大，产生荧光波长越长，发射的荧光强度越强 0.11 205 278 0.29 286 3100.46 365 400苯苯萘萘蒽蒽 350菲菲线状环结构比非线状线状环结构比非线状结构的荧光波长长结构的荧光波长长2. 刚性平面结构较稳定的平面结构具有强荧光的分子多数有刚性平面结构ocoo-oo-coo-oo-荧光素：氧桥把两荧光素：氧桥把两个环固定在一个平个环固定在一个平面上，具有平面结面上，具有平面结构，强荧光物质构，强荧光物质酚酞：无氧桥把两酚酞：无氧桥把两个环固定，

11、不能很个环固定，不能很好的共平面，为非好的共平面，为非荧光物质荧光物质（4 4）取代基效应（）取代基效应（实验总结和推测）实验总结和推测）： 取代基的性质取代基的性质(尤其是生色基团尤其是生色基团)对荧光体的荧光特性和强对荧光体的荧光特性和强度均有强烈的影响。度均有强烈的影响。 给电子取代基使荧光加强给电子取代基使荧光加强供电子基团的有供电子基团的有-NH2，-NHR，-NR2，-OH，-OR，-CN等。等。取代基的影响主要有以下几个方面：取代基的影响主要有以下几个方面： 吸电子基团使荧光减弱而磷光增强吸电子基团使荧光减弱而磷光增强属于这类基团的为吸电子基团：如羰基属于这类基团的为吸电子基团：

12、如羰基(-COOH，-CHO)，硝基硝基(NO2)及重氮基等。及重氮基等。 取代基位置的影响取代基位置的影响 取代基位置对芳烃荧光的影响通常为：邻位，对位取代取代基位置对芳烃荧光的影响通常为：邻位，对位取代者增强荧光，间位取代者通常抑制荧光。取代基的空间阻碍者增强荧光，间位取代者通常抑制荧光。取代基的空间阻碍对荧光也有明显的影响。对荧光也有明显的影响。 5. 最低电子激发单重态的性质最低电子激发单重态的性质含N、O、S杂原子的不饱和有机物，如喹啉和芳酮类物质都含有未键合的孤对n电子，电子跃迁多为n * ，系间窜跃强烈，荧光很弱或不发荧光。不含N、O、S杂原子的有机荧光体多发生 * 类型的跃迁，

13、摩尔吸收系数大，约为104，荧光强。8.2.1.3 影响分子发光的影响分子发光的环境环境因素因素 1. 溶剂的影响 同一荧光物质在不同的溶剂中可能表现出不同的荧光性质 一般来说，溶剂的极性增强，荧光波长长移，荧光强度增大2. 介质的温度和黏度的影响介质的温度和黏度的影响低温下测定，提高灵低温下测定，提高灵敏度敏度大多数荧光物质都随溶液温度升高荧光效率下降，荧大多数荧光物质都随溶液温度升高荧光效率下降，荧光强度减弱。光强度减弱。 温度对磷光影响更大温度对磷光影响更大介质黏度的提高，有利于提高荧光或磷光的强度。介质黏度的提高，有利于提高荧光或磷光的强度。 3. pH的影响的影响大多数含有酸性或碱性

14、基团的芳香族化合物的荧光性质受溶液pH的影响很大共轭酸碱对是具有不同荧光性质的两种型体，具有各自的荧光效率和荧光波长。6OHO-OHO-另外，表面活性剂也会影响荧光强度和特性另外，表面活性剂也会影响荧光强度和特性8.2.1.4 8.2.1.4 荧光、磷光猝灭荧光、磷光猝灭 荧光分子与溶剂分子或者其他分子之间存在相互作用，使荧光分子与溶剂分子或者其他分子之间存在相互作用，使得荧光强度降低或消失的现象。得荧光强度降低或消失的现象。（1 1）碰撞猝灭碰撞猝灭碰撞猝灭是荧光猝灭的主要类型之一。碰撞猝灭是荧光猝灭的主要类型之一。*1MQMQ热量激发单重态激发单重态的荧光分子的荧光分子 猝灭剂分子猝灭剂分

15、子 生成化合物的猝灭也称为静态猝灭，是指基态的荧光物生成化合物的猝灭也称为静态猝灭，是指基态的荧光物质与猝灭剂反应生成非荧光的化合物，导致荧光的猝灭。质与猝灭剂反应生成非荧光的化合物，导致荧光的猝灭。（2 2）生成化合物的猝灭）生成化合物的猝灭MQMQ基态的荧光物质基态的荧光物质 猝灭剂猝灭剂 （3 3）氧的猝灭）氧的猝灭 O2可以说是荧光和磷光的最普遍存在的猝灭剂。氧对可以说是荧光和磷光的最普遍存在的猝灭剂。氧对溶液荧光产生猝灭作用的原因比较复杂，还没有一个完整的溶液荧光产生猝灭作用的原因比较复杂，还没有一个完整的确定说法，可能包含着多种机理。确定说法，可能包含着多种机理。 （4 4）. .

16、 荧光物质的自吸猝灭荧光物质的自吸猝灭 当荧光物质的浓度较大时，会使荧光强度降低，荧光强当荧光物质的浓度较大时，会使荧光强度降低，荧光强度与浓度不成线性关系，称为荧光物质的自猝灭。度与浓度不成线性关系，称为荧光物质的自猝灭。自猝灭可能有如下几个原因：自猝灭可能有如下几个原因：(1)(1) 荧光物质分子之间的碰撞能量损失荧光物质分子之间的碰撞能量损失; ;(2)(2) 荧光物质的自吸收荧光物质的自吸收; ;(3)(3) 荧光物质分子的缔合。荧光物质分子的缔合。 8.2.1.5 荧光激发光谱与发射光谱 荧光：光致发光，照射光波长如何选择？荧光：光致发光，照射光波长如何选择？1.1.荧光的激发光谱曲

17、线荧光的激发光谱曲线以不同波长的入射光激发荧光物质，并在荧光最强处以不同波长的入射光激发荧光物质，并在荧光最强处测量荧光强度，以激发波长为横坐标，荧光强度为纵测量荧光强度，以激发波长为横坐标，荧光强度为纵坐标绘制的关系曲线。与吸收光谱曲线形状相同。坐标绘制的关系曲线。与吸收光谱曲线形状相同。 2.荧光发射光谱荧光发射光谱固定激发光波长固定激发光波长( (选最大激发波长选最大激发波长) )和强度，化合物发射和强度，化合物发射的荧光与发射光波长关系曲线。的荧光与发射光波长关系曲线。荧光激发光谱与发射光谱是测定时选择激发波长和荧光荧光激发光谱与发射光谱是测定时选择激发波长和荧光测量波长的依据，也可用

18、于鉴别物质。测量波长的依据，也可用于鉴别物质。200260320380440500560620荧光激发光谱荧光激发光谱荧光发射光谱荧光发射光谱磷光光谱磷光光谱室温下菲的乙醇溶液荧（磷）光光谱室温下菲的乙醇溶液荧（磷）光光谱3.激发光谱与发射光谱的关系 a.Stokes位移位移 激发光谱与发射光谱之间的波长差值。发射光谱的波激发光谱与发射光谱之间的波长差值。发射光谱的波长比激发光谱的长，振动弛豫消耗了能量。长比激发光谱的长，振动弛豫消耗了能量。 b.发射光谱的形状与激发波长无关发射光谱的形状与激发波长无关 电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量，电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量

19、，产生不同吸收带，但均回到第一激发单重态的最低振产生不同吸收带，但均回到第一激发单重态的最低振动能级再跃迁回到基态，产生波长一定的荧光。动能级再跃迁回到基态，产生波长一定的荧光。 c. 镜像规则镜像规则 通常荧光发射光谱与它的激发光谱成镜像对称关系。通常荧光发射光谱与它的激发光谱成镜像对称关系。 8.2.1.6 荧光荧光（磷光）（磷光）强度与强度与溶液溶液浓度的关浓度的关系系用强度为I0的入射光，照射到液池内的荧光物质时，产生荧光，荧光强度If 用仪器测得，在荧光浓度很稀时，荧光物质发射的荧光强度If 与浓度有下面的关系。荧光池荧光池荧光荧光强度强度检测器检测器IIA0lg将上式展开! 3)3

20、 . 2(! 2)3 . 2(3 . 2320AAAIIff! 3)3 . 2(! 2)3 . 2(3 . 2320AAAIIff当A0.05时，方括号中其它各项与第一项相比可忽略不计，上式简化 If = 2.3 f I0A =2.3 f I0 cL当当A0.05时，时，荧光强度与物质浓度呈线性关系，If=Kc只有在浓度低时使用，荧光物质测定的是微量或痕量组分，灵敏度高。浓度高时， If与c不呈线性关系，有时c增大， If反而降低。因为公式 中后面影响，有时发生荧光猝灭效应。浓度效应包括：1. 内滤效应2.发光分子形成基态或激发态的聚合物 3.发光的再吸收光源光源样品池样品池激发激发单色器单色

21、器检测器检测器数据处理数据处理仪器控制仪器控制发射发射单色器单色器8.2.2 荧光、磷光分析仪器荧光、磷光分析仪器 8.2.2.1 8.2.2.1荧光分析仪器荧光分析仪器 测量荧光的仪器主要由四个部分组成：激发光源、样品池、测量荧光的仪器主要由四个部分组成：激发光源、样品池、双单色器系统、检测器。双单色器系统、检测器。 特殊点：有两个单色器，光源与检测器通常成直角。特殊点：有两个单色器，光源与检测器通常成直角。荧光光度计仪器光路图荧光光度计仪器光路图1. 1. 光源光源： 氙灯和高压汞灯，染料激光器氙灯和高压汞灯，染料激光器( (可见可见- -紫外区紫外区) )光源要求：光源要求：v发射强度足

22、够且稳定的连续光谱发射强度足够且稳定的连续光谱v光辐射强度随波长的变化小光辐射强度随波长的变化小v有足够长的使用寿命有足够长的使用寿命高压汞灯高压汞灯: : 是以汞蒸气放电发光的光源，一般滤光片式的是以汞蒸气放电发光的光源，一般滤光片式的荧光计多采用它为激发光源。荧光计多采用它为激发光源。氙灯氙灯: 是目前荧光分光分度计中应用最广泛的一种光源。它是目前荧光分光分度计中应用最广泛的一种光源。它是一种短弧气体放电灯，具有光强度大，在是一种短弧气体放电灯，具有光强度大，在200800nm 范范围内是连续光源的特点。围内是连续光源的特点。染料激光器染料激光器: 是一种新型的荧光激发光源。是一种新型的荧

23、光激发光源。 I0ItIF,p4. 检测器：检测器： 现在的荧光计多采用光电倍增管进行检测。现在的荧光计多采用光电倍增管进行检测。3. 样品池：样品池：荧光分光光度计荧光分光光度计的样品池四面透光。的样品池四面透光。2. 单色器单色器： 荧光分析仪中应用最多的单色器为光栅单色器，光栅荧光分析仪中应用最多的单色器为光栅单色器，光栅有两块，第一块为激发单色器，用于选择激发光的波长，有两块，第一块为激发单色器，用于选择激发光的波长，第二块为发射单色器，用于选择荧光发射波长。在比较低第二块为发射单色器，用于选择荧光发射波长。在比较低档次的荧光计中，采用滤光片作为单色器。档次的荧光计中，采用滤光片作为单

24、色器。 5.读数装置读数装置8.2.2.2 磷光分析仪器1 1、试样池、试样池 低温磷光一般在液氮温度下低温磷光一般在液氮温度下进行，盛放试样的试样池需放置在盛液进行，盛放试样的试样池需放置在盛液氮的杜瓦瓶内。氮的杜瓦瓶内。2 2、磷光镜、磷光镜 通常借助于荧光和磷光寿通常借助于荧光和磷光寿命的差别，采用磷光镜的装置命的差别，采用磷光镜的装置将荧光隔开。将荧光隔开。8.2.3 荧光的常规测定方法荧光的常规测定方法1. 直接测定法2.间接测定法（1）荧光衍生法（2）荧光猝灭法 （3）敏化荧光法3.多组分混合物的荧光分析8.2.4 磷光的测定方法磷光的测定方法8.2.4.1 低温磷光分析8.2.4

25、.2 室温磷光分析(RTP)（1）固体基质表面室温磷光分析(SS-RTP)（2）胶束稳定的室温磷光分析（MS-RTP）（3）敏化室温磷光分析（S-RTP）8.2.5 荧光、磷光分析法的应用荧光、磷光分析法的应用荧光分析法具有灵敏度高、取样量少等优点1. 无机化合物的分析无机化合物中，能直接产生荧光并应用于测定的为数不多，但与有机化合物生成发荧光的有机配合物后，进行荧光分析的元素达70多种，其中较常采用荧光法测定的元素有：Be、Al、B、Ga、Se、Mg、Zn、Cd及某些稀土元素。2. 有机化合物的分析有机化合物的分析脂肪族有机化合物的分子结构较为简单，本身能发荧光的很少，一般需要与某些试剂反应

26、后才能进行荧光分析。芳香族化合物因具有共轭的不饱和体系，多数能发荧光；可直接用荧光法测定。对于具有致癌活性的多环芳烃荧光分析法是最主要的测定方法。为提高测定的灵敏度，有时也将芳香族化合物与适当试剂反应之后进行测定。能产生磷光的物质数量很少，磷光分析不及荧光分析普遍，但磷光分析法已在药物分析、临床及环境分析领域得到一定的应用。低温磷光分析已应用在萘、蒽、菲、芘、苯并芘等多环芳烃及含O、S、N的杂环化合物分析。固体表面室温磷光分析法已成为多环芳烃和杂环化合物的快速、灵敏的分析手段。8.3 化学发光分析法化学发光分析法8.3.1 概述化学发光是利用化学反应所产生的光辐射现象所建立的分析方法。化学发光

27、与荧光的主要区别：受激发时所需的能量来源不同 化学发光：需要化学反应过程中所提供的化学能激发而发光 荧光：光源激发而发光化学发光分析具有以下特点化学发光分析具有以下特点灵敏度高例：用荧光素酶和三磷酸腺苷ATP的化学发光反应，可测定低至210-17 molL-1 ATP线性范围宽 一般有56个数量级仪器设备简单，成本低廉分析速度快，易实现自动化局限性：可供发光用的试剂有限 发光机理有待进一步研究8.3.2 基本原理基本原理（一）化学发光反应的基本条件发光反应必须满足以下条件1. 化学反应必须产生足够的化学能化学发光基于化学反应提供足够的能量 A + B C* +D 产物接受反应能被激发在可见光区

28、观察化学发光，需170300kJmol-1激发能。具有过氧化物中间产物的氧化还原反应可满足要求。化学反应多是在有O3、H2O2等参加的高能反应中。2. 处于激发态分子能够以辐射跃迁的方式返回基态 C* C + h （二）化学发光效率和发光强度（二）化学发光效率和发光强度化学发光效率CL激发态分子数发射的光子数参加反应的分子数激发态分子数参加反应的分子数发射的光子数frCL激发态分子的化学效率激发态分子的化学效率激发态分子的发光效率激发态分子的发光效率取决于发光所依据的化学反应本身取决于发光所依据的化学反应本身化学发光强度化学发光强度具有高效率的化学发光是生物体中。亦称生物发光。如：萤火虫发光反

29、应的效率几乎接近100%。非生物体的化学发光效率一般不超过1%化学发光强度 ICL（t）与反应速度、化学发光效率有如下关系dtdctICLCL)(对下列化学发光反应对下列化学发光反应 A +B C* +D C + h A + B C* +DA为待测物质，C为发光物质，当反应物B的浓度远远过量于待测物浓度时，B的浓度可认为是常数。因此，发光反应可视为一级反应AAckdtdc1nt 时刻的发光强度与该时刻的分析物浓度成正比时刻的发光强度与该时刻的分析物浓度成正比n化学发光总强度与分析物浓度呈线性关系。根据化学发光总强度与分析物浓度呈线性关系。根据已知时间内的发光总强度来定量分析。已知时间内的发光总

30、强度来定量分析。ACLACLCLcdtdtdcdtIS发光总强度发光总强度ACLACLCLckdtdctI1)(8.3.3 8.3.3 化学发光反应的类型化学发光反应的类型8.3.3.1 8.3.3.1 气相化学发光反应气相化学发光反应a. 一氧化氮与一氧化氮与O3的发光反应的发光反应 NO + O3 NO2* NO2* NO2 + h 发射的光谱范围：发射的光谱范围：600875nm，灵敏度灵敏度1ng/cm-3；b.氧原子与氧原子与SO2、NO、CO的发光反应的发光反应 O3 O2 + O （1000 C石英管中进行石英管中进行） SO2 + O + O SO2* + O2 SO2 * SO2* + h 最大发射波长：最大发射波长：200nm；灵敏度灵敏度1ng/cm-3； （2 2）火焰化学发光）火焰化学发光 在富氢火焰中，也存在着很强的化学发光反应；在富氢火焰中，也存在着很强的化学发光反应；a. 一氧化氮一氧化氮 NO + H HN