第四章发酵工业的无菌技术

1、第四章 发酵工业的无菌技术 n发酵工业的无菌处理n发酵工业污染的防治策略n发酵工业的无菌技术n发酵培养基及设备管道灭菌n空气除菌n绝大多数工业发酵采用纯种培养，要求发酵过程只能有生产菌，不允许有“杂菌”污染。n如果污染杂菌，那么它就会在最短的时间内大量繁殖，与生产菌争夺营养成分或分泌代谢产物抑制生产菌的生长和代谢，从而干扰生产菌正常发酵，甚至造成倒罐，严重影响生产。n为了保证纯种发酵，在生产菌种接种之前要对发酵培养基、空气系统、流加料、发酵罐及管道系统进行灭菌，还要对环境进行消毒，防止杂菌和噬菌体的大量繁殖。n消毒与灭菌技术统称为发酵工业的无菌技术。n当然要实现每批次发酵都完全达到无杂菌污染几

2、乎是不可能的，一般采用“污染概率”作为评价标准。n发酵工业中允许的染菌概率是10-3，即灭菌1000批次的发酵中只允许有一次染菌。n现代大规模的发酵生产往往需要更高的无菌要求，应该尽可能始终保持完全无杂菌状态。第一节 发酵工业的无菌处理n灭菌：指用物理或化学的方法杀死物料或设备中所有生命物质的技术或工艺过程。 n消毒：用物理或化学的方法杀死空气、地表以及容器和器具表面的微生物。n除菌：用过滤方法除去空气或液体中的微生物及其孢子。n防腐：用物理或化学方法杀死或抑制微生物的生长和繁殖。n消毒与灭菌的区别在于，消毒仅仅是杀灭生物体或非生物体表面的微生物，灭菌时杀灭所有的生命体。n灭菌适合培养基等物料

3、的无菌处理。n消毒一般只能杀死营养细胞，而不能杀死细菌芽孢和真菌孢子等，特别适合于发酵车间的环境和发酵设备、器具的无菌处理。第二节 发酵工业污染的防治策略n一 杂菌污染的危害：n杂菌消耗发酵培养基，造成生产能力的下降。n杂菌合成一些新的代谢产物，或杂菌污染后改变了发酵液的某些理化性质，使发酵产物的提取和分离变得困难，造成产物收率降低或产品质量下降。n杂菌代谢会改变原反应体系的pH，是发酵发生异常变化。n杂菌分解产物，使生产失败。n细菌发生噬菌体污染，微生物细胞被裂解，导致整个发酵失败。n染菌对发酵产率、提取收率、产品质量有重大影响，关系发酵生产过程的成败。n染菌轻者影响产率、产物提取收率和产品

4、质量，严重者造成“倒罐”，浪费大量原料，造成严重的经济损失，而且扰乱生产秩序，破坏生产计划。n由于发酵生产的产品不同、污染杂菌的种类和性质不同、染菌发生的时间不同以及染菌的途径和程度不同，染菌所造成的危害及后果也不同。n1 染菌对不同菌种发酵的影响n细菌发酵中防止噬菌体污染n有机酸发酵主要是防止发酵前期染菌n酵母发酵中注意生长较快的细菌污染和野生酵母的污染n疫苗的发酵中染活菌、死菌或是毒素都应该全部废弃。n2 不同发酵时期染菌对发酵的影响n种子扩大时期染菌 应严格控制种子污染，一旦染菌均应灭菌后弃去，此时处理造成的损失最小。n发酵前期染菌 应迅速重新灭菌，再接种，进行从头发酵。有时还要根据前期

5、染菌时的营养成分的消耗情况补充必要的营养成分。n发酵中期染菌 由于营养成分大量消耗，发酵产物正在大量积累，一般挽救处理困难，危害性很大，故在实际发酵生产过程中尽可能做到早发现、快处理。处理方法应根据各种发酵的特点和具体情况来决定。n发酵后期染菌 此时染菌对发酵的影响相对要小一些，一般可继续发酵，即使污染迅速加重，也可以采取提前放罐来减少染菌的损失。n3 杂菌污染对发酵产物提取和产品质量的影响 n杂菌污染不仅严重影响生产菌的生长繁殖和代谢产物的合成，而且对发酵后处理也有极大的影响，尤其是增加了发酵产物的提取难度，同时还将影响发酵产品的质量。二 杂菌污染的防治n1 染菌的检查与类型的判断n显微镜检

6、查法 简单染色法或革兰氏染色法，将菌体染色后在显微镜观察。n对于霉菌、酵母发酵，先用低倍镜观察生产菌的特征，然后再用高倍镜观察有无杂菌存在。n方法简单、直接、常用，需要一定数量n平板划线培养检查法 先将待检样品在无菌平板上划线，根据可能的污染类别分别置于37、27下培养划线平板，以适应嗜中温和低温菌的生长，一般在8h后即可观察到是否有杂菌污染。n对于噬菌体检查，可采用双层平板培养法，上层和下层同为肉汤琼脂培养基，上层减少琼脂糖用量，先将灭菌的下层培养基融化后倒入平板，凝固后再将上层培养基溶解并保持40，加上生产菌作为指示菌核待检测样品混合后迅速倒在下层平板上。置培养箱保温培养经12-20h培养

7、，观察有无噬菌斑。n肉汤培养检查法 将待检测样品接入无菌的肉汤培养基中，分别置于37和27下进行培养，随时观察微生物生长情况，并取样镜显，判断是否污染杂菌。n发酵过程的异常现象观察法 发酵过程出现的异常现象如溶解氧、pH、尾气中CO2含量，发酵液黏度等的异常变化，都可能产生污染的重要信息。2 污染的原因分析n发酵染菌之后，必须找出染菌的原因，以总结发酵染菌的经验教训和犯罪措施，以减少染菌带来的巨大损失。n种子带菌、空气带菌、设备渗漏、灭菌不彻底、操作失误和技术管理不善是造成各个发酵厂污染杂菌的普遍原因。n从污染杂菌的种类进行分析 n耐热芽孢杆菌，培养基或设备灭菌不彻底n不耐热的杂菌，种子带菌、

8、空气除菌不彻底、设备渗漏或操作问题n浅绿色菌落，冷却盘管渗漏n霉菌，无菌室灭菌不彻底或无菌操作问题n酵母菌，糖液灭菌不彻底，糖液放置时间长n从污染时间进行分析 n发酵前期，种子带菌、培养基或设备灭菌不彻底、接种操作不当或无菌空气带菌n发酵后期，中间补料污染、设备渗漏或操作问题n从染菌的程度进行分析n各个发酵罐或多数发酵罐染菌，空气系统存在问题，空气系统结构不合理、空气过滤器介质失效n个别罐连续染菌，个别设备存在问题3 杂菌污染的途径及其预防n种子带菌及其防治 培养基及器具彻底灭菌，避免菌种在移接过程中受污染，避免菌种在培养过程中或保藏过程中受杂菌污染n过滤空气带菌及其防治 正确选择采气口，提高

9、采气口的位置或安装前置粗过滤器，提高空压机进口空气的洁净度。n根据发酵工厂所在地区的气候条件，设计合理的空气预处理流程，尽可能减少过滤空气的含油量和湿度，适当提高进入过滤器的空气湿度，降低空气的相对湿度，保持过滤介质的干燥状态。设计和安装合理的空气过滤器，防止过滤器失效，选用除菌效率高的过滤介质。n设备的渗漏或“死角”造成的染菌及其防治 n设备的渗漏染菌主要是指发酵设备、管阀门等在长期使用过程中，由于化学腐蚀、电化学腐蚀、磨蚀、加工制作不良等原因形成微小漏孔后发生渗漏而染菌。n设备的“死角”是指由于操作、设备结构或人为因素造成的屏障等原因，是蒸汽不能到达预定的灭菌部位或该部位的冷空气不易在加热

10、过程中排净，从而不能达到彻底灭菌要求的部位。n常见的设备、管道“死角”n发酵罐的“死角”，管道安装不当或配置不合理形成的“死角”n培养基灭菌不彻底导致染菌及其防治n原料性状的影响n灭菌时湿度与压力不对应造成染菌n灭菌过程中产生的泡沫造成的染菌n连续灭菌维持时间不够或压力波动大而造成染菌n灭菌后期的罐压骤变造成的染菌n操作不当造成的染菌 操作一定要严格规范，防止操作失误引起染菌n噬菌体染菌及其防治 环境污染是噬菌体染菌的主要根源。以净化环境为中心的综合防治法，主要有净化生产环境、消灭污染源、提高空气的净化度、保证纯种培养、轮换使用不同类型的菌种、使用抗噬菌体的菌种、改进设备装置消灭“死角”、遵从

11、操作规范。第三节 发酵工业的无菌技术n保持发酵过程无杂菌污染，最重要的是要建立发酵工业中的无菌技术。常用的无菌技术和方法主要有以下几种，可根据灭菌的对象和要求选用不同方法。1 干热灭菌干热灭菌 n利用电热或红外线在加热设备内将待灭菌物品加热到一定温度杀死微生物。n微生物对干热耐受力比对湿热强得多n常用方法：灼烧和电热箱加热，140-180 1-2小时n使用范围：玻璃及金属用具及沙土管灭菌2 湿热灭菌 n利用饱和蒸汽进行灭菌的方法n原理：蒸汽冷凝放出大量潜热，具有穿透力，且在高温有水分条件下，蛋白质易变性。n常用方法：n水煮常压灭菌：100n饱和蒸汽灭菌：一般121，30分钟n使用范围：培养基和

12、发酵设备灭菌。 3 辐射（射线）灭菌n利用紫外线、高能电磁波或放射性物质产生的高能粒子进行灭菌的方法n原理：利用高能量的电磁辐射与菌体核酸的光化学反应造成菌体死亡。 n常用：紫外线、X射线和射线。 n使用范围：用于室内空气及器皿表面灭菌 4 化学物质灭菌n某些化学试剂能与微生物发生反应而具有杀菌作用n原理：药物与微生物细胞中的成分反应，使蛋白质变性酶失活。n使用范围：n器皿、双手和实验室、无菌室的环境灭菌， 不能用于培养基灭菌 常用的灭菌剂常用的灭菌剂化学物质名称化学物质名称有效浓度有效浓度化学物质名称化学物质名称有效浓度有效浓度新洁尔灭新洁尔灭(苯扎溴铵苯扎溴铵)0.25%甲醛甲醛37%杜灭

13、芬杜灭芬0.25%戊二醛戊二醛2%高锰酸钾高锰酸钾0.1%-0.25%苯酚苯酚0.1%-0.15%漂白粉漂白粉5%过氧乙酸过氧乙酸0.02%-0.2%酒精酒精75%焦碳酸二乙酯焦碳酸二乙酯0.01%-0.1%煤酚皂（来苏尔）煤酚皂（来苏尔）1%5% *5 过滤除菌 n利用过滤的方法阻留微生物以达到除菌的目的。n原理：利用微生物不能透过滤膜除菌。n方法: 0.010.45 m孔径滤膜， n使用范围：用于压缩空气、酶溶液及其他不耐热化合物溶液除菌。 6 火焰灭菌法n利用火焰直接杀死微生物的灭菌方法。n方法简单、灭菌彻底n适用范围有限，接种针、接种环、接种铲、小刀、镊子、玻璃三角瓶口第四节 发酵培养

14、基及设备管道灭菌n在发酵工业中，对于大量培养基和发酵设备的灭菌，最有效、最常用的方法是湿热灭菌法。n热死时间，在规定的温度下杀死一定比例的微生物所需要的时间。n恰当掌握加热温度和受热时间是灭菌工作的关键。1 1 湿热灭菌原理湿热灭菌原理n每一种微生物都有一定的生长稳定范围。n当微生物处于生长温度的下限时，代谢作用几乎处于停止而处于休眠状态。当温度超过生长温度的上限时，微生物细胞中的蛋白质等大分子物质会发生不可逆变性，使微生物在很短时间内死亡，加热灭菌就是根据微生物的这一特性进行的。n杀死微生物的极限温度称为致死温度。n在致死温度下，杀死全部微生物所需要的时间称为致死时间。n在致死温度以上，温度

15、越高，致死时间越短。n微生物对热的抵抗力称为热阻，即指微生物在某一条件下（主要是温度）的致死时间。n相对热阻是指某一微生物在某一条件下的致死时间与另一微生物在相同条件下的致死时间之比。1.生物热死动力学（对数残存定律）n dN / dt =- K N N：菌体个数（个） t : 灭菌时间（min） k：反应速度常数（min-1）dN / dt: 菌受热死亡速率(个/min)Ln N/ N0 = - K t N= N0 e- K t以菌的残留数Ln N/ N0的对数与时间t 作图，得出一条直线，其斜率为- K （P66图4-5）反应速率常数K 如何通过实验根据对数残存定律确定某一温度,某一微生物

16、的K ？1). K 与菌种的特性有关相同温度下，微生物越耐热， k值越小。相同温度下，微生物越不耐热，k值越大。2). K 与灭菌温度有关K=A e E / RT（阿累尼乌斯方程）Ln K =Ln A- E/ RTA：比例常数R：气体常数(J/ mol K)T：绝对温度( K)E：杀死细菌所需的活化能（J/ mol）嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢的热死曲线0.00010.0010.010.110510152025加热时间（m i n ）N/N01211181151101052 培养基灭菌时间的选择nt =1/ k * Ln( N0/ N)n其中 K：一般耐热的细菌芽孢的K值 N0 ：细菌及芽孢数之和 N

17、：10 -33 培养基灭菌温度的选择n选择即能达到灭菌要求，又保证营养成分不被破坏的温度n1.培养基营养成分破坏动力学方程-dC/dt = K C-dC/dt :营养物降解速度 mol / L hC: 营养物浓度 mol / LK : 营养物降解反应速度常数 1 / st ：时间( S )Ln (C/ C0 ) = - K tK = A e- E/ RT Ln K =Ln A- E/ RTA：比例常数R：气体常数(J/ mol K)T：绝对温度( K)E：营养物破坏所需的活化能（J/ mol）2.根据实验结果灭菌活化能大于培养基破坏活化能E E P68 表4-43. 灭菌反应营养物破坏反应 T

18、1 Ln K1 =Ln A- E/ RT1 Ln K1 =Ln A- E/ RT1 T2 Ln K2 =Ln A- E/ RT2 Ln K2 =Ln A- E/ RT2 Ln ( K2/ K1) = E/ R(1/ T1- 1/ T2 ) Ln ( K2 / K1 )= E/ R(1/T1- 1/T2)Ln( K2/ K1) = ELn ( K2 / K1 ) E Ln ( K2 / K1) Ln ( K2 / K1 ) K2 / K1 K2 / K1 当温度升高时微生物死亡速度常数比营养物质降解速度常数变化得大4达到相同灭菌效果，T越高，K越大，所需t 越短，采用高温短时（HTST）灭菌效果

19、好4 影响灭菌效果的因素n培养基成份：油脂、蛋白质增加微生物的耐热性npH：酸性pH下可加快微生物热死速率 n微生物种类：不同的微生物k值不同n培养基物理状态：固体需要时间长n初始菌量：在保持N值不变的前提下，t 与初始菌量N0的对数成正比n泡沫：泡沫中的空气形成隔热层，使传热困难，对灭菌极为不利，可加入少量消沫剂n培养基中的微生物数量：天然基质培养基中含菌量多，灭菌时间要求长n传热与混合状况：影响受热均匀度 n培养基中固体颗粒的存在影响热穿透 n蒸汽中空气的存在降低蒸汽分压和灭菌温度 5 培养基和发酵设备的灭菌方法（一）实验室种子培养基灭菌方法使用高压蒸汽灭菌锅 手提式灭菌锅。容量小。立式或

20、卧式灭菌锅。容量较大，一般能装几十瓶或几百瓶。灭菌柜。要和蒸汽锅炉配套，用于大量种瓶培养基的灭菌，一次能装几百至几千瓶(袋)。n（二）分批灭菌(batch sterilization) n1定义： 将配制好的培养基输入发酵罐中，用蒸汽加热，使培养基和设备同时灭菌的一种灭菌方式。n 2操作过程：空罐准备：清洗、检修和检测。升温：把培养基加热到灭菌所需的温度。保温维持：在灭菌温度下保持灭菌所需时间。冷却保压：把培养基的温度降低到接种的温度。温度随灭菌时间的变化温度随灭菌时间的变化三路进汽：三路进汽：直接蒸汽直接蒸汽从通风、取样和出料从通风、取样和出料口进入罐内直接加热，口进入罐内直接加热，直到所规

21、定的温度，直到所规定的温度，并维持一定的时间。并维持一定的时间。这就是所谓的这就是所谓的“三路三路进气进气”。*四路出汽：四路出汽：直接蒸汽直接蒸汽从排气、接种、进料从排气、接种、进料和消沫剂管排气和消沫剂管排气分批灭菌设备示意图分批灭菌设备示意图n（三）连续灭菌(continuous sterilization)1定义：将培养基通过专门设计的灭菌器，进行连续流动灭菌后，进入预先灭过菌的发酵罐中的灭菌方式。 2流程： 1)由热交换器组成的灭菌系统 2)蒸汽直接喷射型的连续灭菌系统 3)由连消塔、维持罐和喷淋冷却组成的灭菌系统由热交换器组成的灭菌系统工艺流程图温度随时间的变化蒸汽直接喷射型的连续

22、灭菌系统温度随灭菌时间的变化由连消塔、维持罐和喷淋冷却组成的灭菌系统三）连续灭菌与分批灭菌的比较与选择三）连续灭菌与分批灭菌的比较与选择分批灭菌分批灭菌优点：优点：1不需附加设备不需附加设备2蒸汽利用率高蒸汽利用率高3节约劳动力节约劳动力缺点缺点1培养基质量比较差培养基质量比较差2罐的利用率低罐的利用率低3.冷却水用量大冷却水用量大连续灭菌连续灭菌优点：优点：1采用高温快速灭菌法采用高温快速灭菌法2可以把培养基按其性质分开灭菌可以把培养基按其性质分开灭菌3有利于自动控制有利于自动控制4节省冷却水节省冷却水缺点缺点1投资费用高投资费用高2对物料要求高对物料要求高3蒸汽用量大蒸汽用量大选择原则：选

23、择原则： 1培养基成份（易降解成分、液化情况等） 2设备状况（冷却面积、传动装置等） 3.动力条件 （四）高温对培养基成分的有害影响及其防止 消除高温有害影响的措施消除高温有害影响的措施n（1）采用特殊加热灭菌法(连续灭菌方法）n（2）对易破坏的含糖培养基进行灭菌时，应先将糖液与其他成分分别灭菌后再合并；n（3）对含Ca2+或Fe3+的培养基与磷酸盐先作分别灭菌，然后再混合，就不易形成磷酸盐沉淀；n（4）对含有在高温下易破坏成分的培养基（如含糖组合培养基）可进行低压灭菌第五节第五节 空气除菌空气除菌n一、无菌空气的要求 n1 .空气中的微生物 空气中的微生物种类以细菌和细菌芽孢较多，也有酵母，

24、霉菌孢子和病毒。 这些微生物大小不一，一般附着在空气中的灰尘上或雾滴上，空气中微生物的含量一般为103104个米3。 灰尘粒子的平均大小约0.6m左右，所以空气除菌主要是去除空气中的微粒(0.6-1m ）n无菌空气的标准 n百分数：99.99n美国联邦宇航局等级标准：100级（直径小于0.5微米粒子数少于3.5个/L）温度：25 40 湿度：30%45% n空气除菌的方法较多，如辐射除菌、加热除菌、静电除菌、过滤除菌n过滤除菌是发酵工业生产中最常用、最经济的空气除菌方法n空气过滤除菌采用定期灭菌的介质阻截流过的空气中所含微生物而制成的无菌压缩空气 1.纤维或颗粒介质填充床过滤器：棉花、玻璃纤维、腈纶、涤纶、维尼纶或活性炭等 2.折叠式硼硅酸超细纤维过滤器：超细玻璃纤维 3.烧结金属、陶瓷过滤器 n二 介质除菌：原理：过滤介质填充到过滤器中，空气流过时借助惯性碰撞、阻截、扩散、静电吸附、沉降等作用将尘埃微生物截留在介质中，达到除菌的目的。主要设备：填充床过滤器发酵生产中制备无菌空气的大致过程 介质除菌介质除菌 高空取气管高空取气管是远离地面几十米的管子。一般而言，地面附近空气中所含的 微生物和灰尘等均比高空空气中含