医用分子生物学 讨论课 基因组DNA提取 琼脂糖凝胶电泳 RNA提取

1、分子生物学讨论课汇报展示 第五小组1人类基因组DNA提取2限制性核酸内切酶切割的原理、方法3琼脂糖凝胶电泳结果分析（DNA）4琼脂糖凝胶电泳的应用(DNA)5人类细胞质RNA提取6RT-PCR的原理、方法7琼脂糖凝胶电泳结果分析(RNA)8琼脂糖凝胶电泳的应用(RNA)目录人类基因组DNA提取限制性核酸内切酶切割的原理、方法汇报人： 哺乳动物的一切有核细胞都可以用来制备DNA， 除特殊要求外，白细胞、肝或脾组织是最常用的 材料。原始材料较少或较难获得时（如羊水细 胞），还必须经过细胞培养来获得足够量的细 胞；有时为了简便易行起见，还可以无创伤地采 集材料，如用口腔上皮脱落细胞、发根细胞。产 前

2、诊断所用的材料则为胎儿的羊水细胞或者绒毛 膜细胞SDS是一种去污剂，破坏细胞膜的脂质 膜；蛋白酶K是一种很强的蛋白水解酶，能消化各种蛋白质（包括糖蛋白和肽类）及脂类 和胺类物质，但糖蛋白的降解物常与DNA 一同沉淀下来，干扰酶的活性，消化后需 要用酚、氯仿抽提纯化；人类基因组DNA提取 原理 principle1酚能变性蛋白质而且还能将变性的蛋白质溶解在 其中； （加入1/3体积的饱和NaCl溶液，也可较好地祛除细 胞降解物而纯化DNA，可以避免酚的污染。） 氯仿也是一种有效的蛋白变性剂，它还能促进两 相的分离；DNA上清溶液再经氯仿抽提后用乙醇沉淀，分离 纯化的DNA。人类基因组DNA提取

3、原理 principle1人类基因组DNA提取1提取方法从全血中提取12从口腔上皮脱落细胞，发根细胞中提取人类基因组DNA提取1操作方法（全血）点细胞裂解与RNase/蛋白酶K 消化1. 取100 l抗凝全血置于1.5ml Eppendorf离心管中，再加入100 l裂解液和20 l RNaseA/蛋白酶K液，用移液器来回吹打混匀，室于55温浴35分钟，其间来回颠倒离心管几次，直至溶液呈水溶状。2. 加入10l 3M的NaAc(pH 4.8)，随后加入1250 l结合缓冲液，充分振荡混匀，12，000 rpm离心30秒。人类基因组DNA提取1DNA与吸附柱的结合操作3用移液器Tip转移上清并加

4、入到离心吸附柱（套好收集管）中，放置1分钟，12，000 rpm离心30秒，倒掉收集管中的废液。注意：待转移上清约1300l，离心吸附柱容量约650 l，故需每次转移上清650 l到离心吸附柱中，离心，倒掉收集管中的废液，重复实验操作步骤3。人类基因组DNA提取1DNA的纯化操作4. 再加入600 l洗涤缓冲液（washing buffer）到离心吸附柱（套好收集管）中，12，000 rpm 离心30秒。5重复步骤4一次，12，000 rpm 离心3分钟以充分除去洗涤缓冲液。6小心取出离心吸附柱，弃收集管，将离心吸附柱套入一个干净的1.5ml Eppendorf 离心管，并加入50 l洗脱缓冲

5、液(elution buffer) 到离心吸附柱中(洗脱缓冲液一定要加在离心吸附柱的正中)，放置1分钟，于12，000 rpm 离心30秒。7取出Eppendorf 离心管，其中便是所提取基因组NA。无水乙醇沉淀时可见白色絮状物0.8%琼脂糖凝聚电泳可见一基因组DNA条带OD值测定人类基因组DNA提取 实验结果 experimental result1饱和酚吸取时记得吸取下层的有机相乙醇沉淀时，要沿离心管壁向DNA溶液中加入无水乙醇，轻轻摇动离心管混合至体系完全均一，见白色絮状DNA收集细胞的多少是实验成功与否的关键沉淀中加入1mlSTE后，打散细胞团便于充分消化细胞人类基因组DNA提取 注意

6、事项 matters needing attention1限制性核酸内切酶切割的原理、方法1定义限制性核酸内切酶是可以识别特定的核苷酸序列，并在每条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键进行切割的一类酶，简称限制酶。限制性核酸内切酶切割的原理、方法1限制性核酸内切酶分类根据限制酶的结构，辅因子的需求切位与作用方式，可将限制酶分为三种类型，分别是第一型（Type I）、第二型（Type II）及第三型（Type III）。型限制性内切酶既能催化宿主DNA的甲基化，又催化非甲基化的DNA的水解；而型限制性内切酶只催化非甲基化的DNA的水解。III型限制性内切酶同时具有修饰及认知切割的作用类和类酶

7、在同一蛋白质分子中兼有切割和修饰（甲基化）作用且依赖于ATP的存在。类酶结合于识别位点并随机的切割识别位点不远处的DNA，而类酶在识别位点上切割DNA分子，然后从底物上解离。类中的限制性内切酶在分子克隆中得到了广泛应用，它们是重组DNA的基础。绝大多数类限制酶识别长度为4至6个核苷酸的回文对称特异核苷酸序列（如EcoR识别六个核苷酸序列：5- GAATTC-3），有少数酶识别更长的序列或简并序列。类酶切割位点在识别序列中，有的在对称轴处切割，产生平末端的DNA片段（如Sma：5-CCCGGG-3）；有的切割位点在对称轴一侧，产生带有单链突出末端的DNA片段称粘性末端。1限制性核酸内切酶切割的原

8、理、方法限制性核酸内切酶切割的原理、方法 限制性内切酶的作用机制1琼脂糖凝胶电泳结果分析应用汇报人： 1、分析条带出现拖尾 原因：蛋白质没有去除干净2、最下端出现明亮的条带 原因：样本中含有RNA琼脂糖凝胶电泳结果分析 结果分析 interpretation of result2 3、条带的粗细 原因：表明提取出的DNA的多少4、条带没有出现 原因：1）胶太浓了，DNA跑不进来 2） 最后洗胶的时候冲跑了琼脂糖凝胶电泳结果分析 结果分析 interpretation of result2琼脂糖凝胶电泳的应用2 1检测疾病基因 2药物靶 3基础生物学应用 人类基因组研究的一个关键应用是通过位置克

9、隆寻找未知生物化学功能的疾病基因。这个方法包括通过患病家族连锁分析来绘制包含这些基因的染色体区域图，然后检查该区域来寻找基因。琼脂糖凝胶电泳的应用 检测疾病基因2 基因组序列的可用性同样允许疾病基因的旁系同源性的快速识别，对于两个理由是有价值的。首先，旁系同源基因的突变可以引起相关遗传疾病。通过基因组序列使用发现的一个很好的例子是色盲（完全色盲）。CNGA3基因，编码视锥体光感受器环GMP门控通道的a亚单位，显示在一些色盲家系中存在突变体。基因组序列的计算机检索揭示了旁系同源基因编码相应的b亚单位，CNGB3（在EST数据库中没有出现）。CNGB3基因被快速认定为是其他家系的色盲的原因。另一个

10、例子是由早衰1和早衰2基因提供的，它们的突变可能导致Alzheimer疾病的的早期发生。第二个理由是旁系同源体可以提供治疗敢于的机会，例子是在镰刀状细胞疾病或地中海贫血的个体中试图再次激活胚胎表达的血红蛋白基因，它是由于-球蛋白基因突变引起的。琼脂糖凝胶电泳的应用 检测疾病基因2 在过去的世纪里，制药产业很大程度上依赖于有限的药物靶来开发新的治疗手段。最近的纲要列举了483个药物靶被看作是解决了市场上的所有药物。知道了人类的全部基因和蛋白质将极大的扩展合适药物靶的寻找。虽然，仅仅人类的小部分基因可以作为药物靶，可以预测这个数目将在几千之上，这个前景将导致基因组研究在药物研究和开发中的大规模开展

11、。琼脂糖凝胶电泳的应用 药物靶2 半胱氨酰基白三烯的收缩和炎症作用，先前认为是过敏反应的慢反映物质（SRS-A），通过特定的受体介导。第二个类似的受体，CysLT2，使用老鼠EST和人类基因组序列的重组得到识别。这导致了与先前识别的唯一的其它受体有38%氨基酸一致性的基因的克隆。这个新的受体，显示高的亲和力和几个白三烯的结合，映射在与过敏性哮喘有关的第13号染色体区域上。这个基因在气道平滑肌和心脏中表达。作为白三烯途径中抗哮喘药物开发中一个重要的靶，新受体的发现有明显的重要的作用琼脂糖凝胶电泳的应用 药物靶2 人体基因组图谱是全人类的财产，这一研究成果理应为全人类所分享、造福全人类，这是参与人

12、类基因组工程计划的各国科学家的共识。值得关注的是，目前在人类基因组研究领域，出现了一些私营公司争相为其成果申请专利的现象。美国塞莱拉基因公司曾表示，想把一部分研究成果申请专利，有偿提供给制药公司。琼脂糖凝胶电泳的应用 基础生物学2 找到了一批主宰人体疾病的重要基因如：肥胖基因、支气管哮喘基因。这类基因的新发现每年都有新报道。这些基因的发现，增进了人们对许多重要疾病机理的理解，并且推动整个医学思想更快的从重治疗转向重预防。例如：湖南医科大学夏家辉教授组于1998.5.28发表克隆了人类神经性高频性耳聋的致病基因（GJB3），这是第一次在中国克隆的基因。琼脂糖凝胶电泳的应用 基础生物学2人类细胞质

13、RNA提取RT-PCR的原理、方法汇报人：人类细胞质RNA提取3真核细胞细胞质中总RNA主要由rRNA、 tRNA和核内小分子RNA、mRNA 组成，其中rRNA、tRNA和mRNA位于细胞质中。人类细胞质RNA提取3一般步骤 破碎组织 分离RNA沉淀RNA洗涤RNA融解RNA保存RNA破碎：可以用盐酸胍、硫氰酸胍、NP-40、SDS、蛋白 酶K等破碎组织 加入 -ME可以抑制RNA酶活性分离：一半用酚、氯仿等有机溶剂，加入少量异戊 醇，经过此步，离心，RNA一般分布于上层， 与蛋白层分开。一半用酚、氯仿等有机溶剂，加入少量异戊 醇，经过此步，离心，RNA一般分布于上层， 与蛋白层分开。沉淀：

14、一般用乙醇、3M NaAc（pH-5.2）或异丙醇。洗涤：使用70乙醇洗涤，有时，为避免RNA被洗掉， 此步可以省掉，洗涤之后可以晾干或者烤干 乙醇，但是不能过于干燥，否则不易溶解。溶解：一般使用TE。保存：应该尽量低温人类细胞质RNA提取 具体操作 operation33分析不同发育时期基因的表达状况获得新基因研究基因的拼接分析相应的蛋白产物人类细胞质RNA提取即逆转录PCR，提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。RT-PCR的原理、方法 RT-PCR

15、原理 principle3RT-PCR的原理、方法 RT-PCR方法 method3提取总提取总RNA合成合成cDNAPCRRT-PCR的原理、方法3RT-PCR的原理、方法3逆转录酶是存在于RNA病毒体内的依赖RNA的DNA聚合酶，至少具有以下三种活性：1、依赖RNA的DNA聚合酶活性：以RNA为模板合成cDNA第一条链；2、Rnase水解活性：水解RNA杂合体中的RNA；3、依赖DNA的DNA聚合酶活性：以第一条DNA链为模板合成互补的双链cDNA.逆转录反应 (RT)RT-PCR的原理、方法3PCR技术(olymerase chain reaction)在模板、引物和四种脱氧核苷酸存在的

16、条件下依赖于DNA聚合酶的酶促反应，其特异性由两个人工合成的引物序列决定。反应分三步：A、变性：通过加热使DNA双螺旋的氢键断裂，形成单链DNA；B、退火：将反应混合液冷却至某一温度，使引物与模板结合。C、延伸：在DNA聚合酶和dNTPs及Mg2存在下，退火引物沿5 3方向延伸。以上三步为一个循环，如此反复。PCR琼脂糖凝胶电泳结果分析应用汇报人： 哺琼脂糖凝胶电泳是用琼脂或琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。对于分子量较大的样品，如大分子核酸、病毒等，一般可采用孔径较大的琼脂糖凝胶进行电泳分离。琼脂糖凝胶电泳是用琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。其分析原理与其他支持物电泳最主要区别是:它兼有分子筛和电泳的双重作用。琼脂糖凝胶电泳结果分析 琼脂糖凝胶电泳 agarose gel electrophoresis4琼脂糖凝胶电泳结果分析4PCR产物在琼脂糖凝胶上的电泳检测在基因组DNA的提取中，用蒸馏水溶解提取出的DNA，在1.0%的琼脂糖胶进行电泳，以Marker（分子质量标准）作为参照，用5V/cm的电泳3060min，最后采用EB溶液进行染色后在凝胶成像系统中进行观察拍照。琼