第十章 反刍动物营养实验技术1

1、第十章 反刍动物营养实验技术第一节 人工瘤胃技术一. 人工瘤胃技术概述人工瘤胃技术是体外研究瘤胃微生物营养与代谢的一类技术方法，又称瘤胃模拟培养法。由于人工瘤胃技术不受试验动物的限制，可以在常规实验室条件下进行研究，因此得到了越来越广泛的应用。早期的人工瘤胃技术主要应用于较简单的研究目的。如Woodman和Evans(1938)，通过体外瘤胃发酵证实纤维素在瘤胃内降解的唯一中间产物是葡萄糖，终产物是VFA和乳酸。Quin（1943）用体外法研究了不同碳水化合物瘤胃发酵的产气量。Pearson和Smith（1943）用体外法研究了瘤胃微生物对尿素的利用等。McDougall（1948）关于绵羊唾

2、液矿物质组成的研究在人工瘤胃技术发展史上具有重要意义，之后的各种人工瘤胃系统人工唾液的配制均参照了McDougall的研究结果。早期的人工瘤胃发酵装置比较简单，不少装置仅是在厌氧的条件下对瘤胃液进行简单的培养。由于发酵产物在系统内的不断积累，这类系统不能用于要求长时间发酵的研究工作，通常有效的发酵时间为1224小时。Louw于1949年设计了一套带有透析系统的人工瘤胃装置，将瘤胃液和底物放入渗析袋或半透膜中，然后悬浮在缓冲液内。该装置在一定程度上将底物和发酵终产物分离开，延长了有效发酵时间。二十世纪五十年代至六十年代，人工瘤胃技术在牧草有机物和纤维素瘤胃降解研究方面得到了大量应用。用人工瘤胃技

3、术研究的内容包括不同牧草以及牧草与纯纤维体外降解速度比较；牧草颗粒大小对体外降解速度的影响；体外评定牧草营养价值；用体外牧草发酵测定结果预测体内发酵等。这一阶段的人工瘤胃装置也趋于复杂，以更加接近瘤胃发酵的真实情况。如Donfer使用的发酵装置由32个发酵瓶组成，每个发酵瓶的容积为90ml，装入的发酵液容量为50ml。每个瓶均有进气口和出气口，以每分钟160个气泡的速度向瓶内通入二氧化碳。二十世纪七十年代，随着反刍动物蛋白质营养研究的深入，人工瘤胃技术开始应用于饲料蛋白质的瘤胃降解率评定。1972年，Ben Braver发现体外培养法中的氨浓度与瘤胃内氨浓度有很好的相关，并用短期培养法对饲料蛋

4、白质的瘤胃降解率进行了评定。Monhadeva（1979）、Broderik（1978，1979）用短期培养法评定了饲料蛋白质的瘤胃降解率和微生物蛋白的产量。Road（1983）根据瘤胃产气量与氨利用量之间的关系，用能量、微生物蛋白合成量计算了饲料蛋白质的降解率。我国的吴毓群（1988），任鹏（1989）等分别用短期发酵法和持续发酵法测定了饲料蛋白质与干物质的降解率。二十世纪八十年代后期，人工瘤胃技术的应用范围扩展到研究营养物质对瘤胃微生物合成量的影响及营养物质的匹配关系。这方面的研究因难以控制瘤胃内环境而不能在体内进行，例如进行瘤胃NH3浓度与瘤胃微生物合成量关系的研究由于瘤胃和动物本身对N

5、H3浓度有调节作用，这样就不能根据不同NPN在瘤胃内NH3浓度的差异和消失速度判断NPN的优劣。人工瘤胃技术由于容易实现试验条件的控制而具有体内法不可比拟的优越性。这一时期人工瘤胃装置以可控性持续动态发酵的模拟装置为主，中国农业大学自行研制的RS型瘤胃持续动态模拟装置即属此类型。二. 短期人工瘤胃发酵装置测定瘤胃产气量短期人工瘤胃发酵装置可以根据研究目的进行不同的设计，其共同特点是静态发酵，不对底物和产物进行分离，因而只能持续较短的时间。但试验装置简单，在饲料营养价值评定等研究方面仍具有很大的价值。下面介绍英国Rowett研究所用于测定瘤胃微生物产气量的人工瘤胃技术，其主要用途是研究不同粗饲料

6、及添加剂等对饲料瘤胃降解及甲烷气能损失的影响。人工唾液的制备：人工唾液由蒸馏水、矿物质元素溶液、微量元素溶液、刃天青（reazurin）溶液混合而成。将混合溶液置于三角瓶中，水浴加热至39之后加入还原液。将以上混合溶液置于39磁力搅拌器上不断搅拌，同时通入CO2气泡，直至溶液颜色由蓝变至粉红最后变为无色透明，表明人工唾液已呈还原状态。升高CO2通气管至液面以上，并连续通入CO2，调整PH值至7.07.30。矿物质溶液:Na2HPO4 5.7g KH2PO4 6.2gMgSO4 0.6g 加蒸馏水至1升微量元素溶液:CaCl2·2H2O 16.12g MnCl2·4H2O 1

7、0.0gCoCl2·6H2O 1.0g FeCl2·6H2O 0.8g加蒸馏水至1升缓冲溶液（PH7.07.3）:NaHCO3 35g（NH4）HCO3 4g 加蒸馏水至1升刃天青溶液:100mg/100ml人工唾液:最终容积（ml）500100015002000蒸馏水23.75475712.5950.0矿物质溶液120.0240.0360.0480.0缓冲液120.0240.0360.0480.0微量元素溶液0.060.120.180.24刃天青0.611.221.832.44还原溶液蒸馏水23.847.571.395.01MNaOH1.02.03.04.0Na2S9&#

8、183;H2O(mg)168336504672瘤胃液制备：抽取瘤胃液（一般从2-3只试验动物抽取并混合，经三层纱布过滤）。将瘤胃滤液加入到人工唾液中，人工唾液与瘤胃滤液的体积比例为2:1。发酵管的制备：发酵管可以选用50100ml的玻璃注射器，上有刻度。称取200mg待测样品加入每一个发酵管中，并准确记录加入的待测样品重量。抽入30ml瘤胃液，排出空气后用橡皮帽封口。置入39水溶摇床上发酵。空白对照管仅加入瘤胃液，不加待测样品，以校正产气管。对于化学物质等对产气量的影响研究还应加入不含化学物质而仅含待测样品和瘤胃液的对照。对粗饲料，读产气量数据的时间为3，6，12，24，48，72小时；对于精

9、饲料，24小时内的读数次数应适当增加。开始发酵的前24小时内应轻轻混匀发酵管内容物2-3次。三. 持续动态人工瘤胃发酵系统持续动态人工瘤胃发酵系统的结构较为复杂，可以应用于常规饲料营养价值评定、蛋白质饲料瘤胃保护技术、各种化学试剂和药物对微生物代谢影响及瘤胃营养调控等方面的研究。由于应用持续动态人工瘤胃系统进行的研究通常要求持续发酵的时间为2-10天，因此需要对整个系统的技术条件有一个严格的要求，以接近瘤胃发酵的真实情况。 持续动态人工瘤胃发酵系统的技术指标1.1 瘤胃液与人工唾液的比例：以1:1较为理想，随着人工唾液比例的增加，发酵液的PH增大，NH3浓度下降。1.2 外流速度：早期的持续动

10、态人工瘤胃装置固相和液相的外流速度相同，后来认识到这与瘤胃内容物的排空情况不一致。Hoover等（1991）在总结相关研究工作的基础上提出，持续动态人工瘤胃装置的液相外流速度以0.12%/h、固相外流速度以0.042%/h为好。在实际应用过程中最好根据研究目的，通过试验确定。1.3 温度：对系统的发酵温度控制一定要准确，即使0.5的差异也会对结果产生明显的影响。由于瘤胃微生物对高温特别敏感，应特别注意发酵温度不超过40，即使在40下经过较长时间，也可观察到活性下降。适宜的发酵温度为39。1.4 PH值：发酵液的最佳PH值在6.7至7.0之间。以淀粉或糖类为发酵底物时，容易导致发酵液的PH值下降

11、。一般在发酵初期每小时调节一次PH值，可用碳酸氢钠调节至6.9。以尿素为底物时易导致发酵液PH值的上升，由于瘤胃微生物对于高PH值更为敏感，因此应及时调节，可用磷酸调节至6.9。 瘤胃微生物来源和接种方法：用于提取瘤胃微生物的动物，其日粮应根据研究目的而定。如以淀粉的瘤胃降解为研究目的，动物的日粮中应含有较高比例的淀粉。瘤胃微生物可以从瘤胃液制备，也可以从瘤胃内容物制备。从瘤胃液制备时，用硬质塑料管从瘤胃的不同部位吸取瘤胃液，过滤后备用。从瘤胃内容物制备时，取瘤胃内容物置入盛有生理盐水的塑料袋中，用力拍打后过滤，滤液备用。如以获得微生物的最大活力为目的，可将瘤胃液直接加入系统中；如研究目的为测

12、定微生物的养分需要量，则应向系统中加入提取的瘤胃微生物。 维持厌氧状态：发酵系统应有良好的气密性，以防止空气进入。发酵开始前向系统中通入CO2和N2的混合气体（CO2 95%+N2 5%），以排除原有空气。发酵过程中的厌氧状态可以通过不断通入CO2（40m2/min）来维持，气密性良好的情况下也可靠发酵过程中产生的CO2来维持。 搅拌：在持续发酵装置中可以通入的CO2起到搅拌的作用，也可由电机（6-7转/分）或磁力搅拌器进行搅拌。发酵系统的搅拌不易太剧烈，有研究表明剧烈搅拌对纤维素的降解有不利影响。 氧化还原电位（Eh）：在厌氧环境中，不断积累的还原性物质使发酵系统的还原性不断增强。在瘤胃内通

13、过产生烷排除多余的电子对，将瘤胃液的Eh维持在-350-500V之间。对于持续发酵的人工瘤胃系统可以通过加入还原剂调节Eh，常用的还原剂有硫化铜、维生素C及半胱氨酸和胱氨酸等。四. 持续动态人工瘤胃发酵系统RSRS是中国农业大学动物科技学院冯仰廉主持研制的持续动态系统。该系统吸收了短期发酵装置和尼龙袋为固相的长期发酵装置（Rusitec）的优点，进行试验研究的重复性好，不同试验周期和不同发酵罐间测定结果的变异系数一般小于5%。该系统在模拟瘤胃内环境方面做到了非均一性，即在让饲料与发酵测定混合的同时，可以模拟瘤胃内饲料自然分层的现象。发酵罐的喂料量和喂料次数可人为调节，持续发酵间长达10天以上，

14、能模拟真实瘤胃内固相和液相外流速度的不同状况，试验期间可收集发酵产生的气体。 RS的设计与组成10-1是的正面图，装置放在长×宽×高为180cm×120cm×60cm的操作台上。装置的支架为长方体框架，长×宽×高为140cm×40cm×90cm，用3cm的三角铁焊成。框架上面是一块厚3cm的木板，上面安装有电机、减速器及连杆、温度控制仪。框架内下部放有137cm×37cm×30cm的有机玻璃水槽，外周是硬质塑料板。有机玻璃槽内底部有6个发酵罐固定座，用于固定6个发酵罐。框架前面的操作台上放有蠕动

15、泵和缓冲液槽。框架左上侧固定有电源板，由下面的稳压器输送电流。操作台的右侧为高纯二氧化碳瓶。图101 北京农大RS正面图。图10-2 北京农大RS背面图10-2是RS的背面图，紧靠框架的6个细长管为集气管，与集气管在一起的6个罐是气液分离罐，操作台下有6个集液瓶。图10-3 北京农大RS功能单位图RS装置有6个发酵罐，因此有6个功能单位。10-3是一个简化的功能单位图，从右侧到左侧依次为缓冲液槽、蠕动泵、发酵罐、集气管、气液分离罐和集液瓶。按照功用，可以将RS功分为发酵系统、温度控制系统、搅拌系统和样品收集系统4大部分。分述如下：发酵系统该系统由发酵罐、蠕动泵和缓冲液槽组成。蠕动泵（L-075

16、24-10，Cole-perm Inc.USA）有6根输液管道，分别接6个发酵罐，输液范围为036ml/min，其作用是以恒定速率同时把缓冲液连续输入6个发酵罐。10-3右侧为蠕动泵，同时显示了连接路线。10-3中间是发酵罐的示意图，为有机玻璃制成，高20.5cm、内径9.0cm，容积约1300ml，发酵罐的盖分上下两层，中间用密封圈密封。盖面上共有5个连接内外的管道，外长均为4cm，中央管道是搅拌条的通道，通道管外刻有螺纹，内有一圆形小槽，装满密封油，然后用有机玻璃螺母旋紧密封，并保证搅拌条上下自如运动。发酵罐盖中央管道的周围有4个管，与蠕动泵软管连接的是缓冲液入孔，内径3cm，罐内长17c

17、m。与样品收集部分相联的是外流液出孔，内径3cm，罐内长3cm，外流液出管的罐内部分接尼龙网管，长10cm，通过改变尼龙网的孔径控制流出颗粒的大小。外流液出孔与样品收集系统之间用内径3cm的软质透明塑料管连接。喂料管较粗，内径5cm，罐内长度8cm；另外一个内径3cm的管为输气管，罐内长10cm，从输气管通入二氧化碳维持厌氧发酵。上述4个管的出口处都由开关控制。温度控制系统温度由电热管和控温仪调节。该系统包括有机玻璃水槽、电热管、控温仪和小型循环水泵。有机玻璃水槽的容积为135cm×30cm×24cm，槽底平面上有6个发酵罐固定支架；水槽两端各有一根800W的电热管，与控温

18、仪（wmzk-02型，上海医用仪表厂）相连，温敏探头放入水槽中间，精度为±0.5；水槽内一端固定一台小型循环水泵（江苏宝应县水泵厂），循环水量为5升/分钟，使水槽内的水每12分钟全部循环一次，消除水槽内上下、两端与中间的温度差，效果可达±0.1。搅拌系统该系统包括电机、减速器、连杆、铝合金方盒横杆、搅拌条等部分（见10-1）。电机为永磁低速同步电动机（苏州电讯电机厂），转速为60/72转/分钟；电机与减速器连接，减速器为H型蜗轮减速器（上海奉贤减速器厂），比速为12:1；电机经减速器与连杆相连，最终转速为56转/分钟。连杆下端是一铝合金方盒（2cm×2cm）的横杆

19、，长140cm，距离发酵罐上端15cm，在横条上面对应发酵罐的位置固定6根镀镍搅拌条，直径0.4cm，长30cm，经发酵罐中央通道进入发酵罐内，在搅拌条底端安装一直径4cm的有机玻璃盘（见10-3）。该系统的作用是电机经减速器带动连杆和下端横条，使横条上固定的6根搅拌条在发酵罐内以5-6次/分钟的速度上下运动，起到缓慢搅拌发酵罐内容物，模拟瘤胃蠕动的效果。样品收集系统该系统包括外流液收集和发酵产气收集两部分，10-2是整体图。10-3为单位图，由发酵罐向左依次为集气管、气液分离罐和外流液收集瓶。外流液和发酵气体依靠蠕动泵持续输入缓冲液的压力从发酵罐的外流液出口流出，经管道进入气液分离罐。气液分

20、离罐内径9cm，高19cm，有机玻璃做成。分离罐上盖有两个孔，内径3cm，外流液和气体由一个管孔进入后，液体下落，由分离罐底部的出孔（内径3cm）进入集液瓶。发酵气体则上浮，由分离罐盖上的另一管孔进入集气管。集气管的连接见10-3，该管为细长管，内径4.5cm，高100cm，容积1590ml，其上有3个与外界相通的孔；其操作程序为：在试验前向管内灌满水，然后关闭上端孔，开下端孔，让水流出，直至水压与外界大气压相等，水停止流出，使集气管上部为负气区，当发酵气体进入分离罐时，气体就进入负气区，同时排出一定量的水。当试验结束时，用与集气管规格相同的开口管与集气管组成“U”形管，并调节“U”形管的水平

21、面，使两者相等，这时集气管内的气体压力与大气压相同，即可测定发酵气体体积，并能从上端孔取样分析气体组成，然后换算成标准大气压下的体积和组成。 RS装置的检查与连接从10-1可以看出搅拌系统相连的路线，10-2是整套装置连接后的背面图，10-3则是一个功能单位的连接图。下面简述装置连接流程和注意事项：2.1 装置密封性能检测：首先检查发酵罐的密封性。将发酵罐盖中央管的密封槽内装满密封油，用螺母旋紧，使搅拌条上下运动自如，在上下盖中间装好密封圈，拧紧螺丝，并关闭除CO2入口外的所有开关，将发酵罐浸没水中，以1.0kg/cm2的压力通入CO2半分钟，如果水中没有气泡，说明发酵罐密封良好，可以使用。同

22、样检查气液分离罐和集气管的密封性。2.2 电系统检查检查稳压电源输出电压和蠕动泵转速的稳定性，以及电机和减速器运转正常与否。2.3 系统间连接流程按照10-3，首先把蠕动泵的6根软管一端穿过橡皮塞放入缓冲液槽内，另一端分别连接6个发酵罐的进液孔。再将发酵罐的外流液出孔与气液分离罐入孔相接，气液分离罐的气体出口与集气管的侧孔相连接，气液分离罐下端的液体出口与集液瓶相连，集气管的下端孔与水平调节管相接。最后，也即在装置运转前连接发酵罐的搅拌条，密封发酵罐。至此，装置连接完毕。 瘤胃持续动态模拟装置（RS）的操作程序3.1 制备日粮发酵罐使用颗粒日粮。制作方法是首先将所需的饲料用1.00mm的筛孔粉

23、碎两遍，然后按需要的比例称重并混合均匀，用颗粒机压制成直径0.6cm，长3cm的颗粒备用。3.2 配制缓冲液近几年新出现的缓冲液配方很多，但都以McDougall在1948年测定的绵羊唾液矿物质组成为基础，并根据试验要求稍微修改得到的人工唾液。McDougall（1948）人工唾液的配方为每10升蒸馏水内含：NaHCO3 98克，Na2HPO4·12H2O 93克，NaCl 4.7克，KCl 5.7克，MgSO4·7H2O 1.2克，无水CaCl2 0.4克。配制方法是先把除无水CaCl2以外的其它试剂溶于蒸馏水并稀释至刻度，然后加入CaCl2，此时缓冲液的PH约为7.8-

24、8.0，并有白色沉淀，这时迅速按1.5kg/cm2的压力向缓冲液内通入CO2，直至溶液澄清，pH降到7.0-7.2（约30分钟），最后将缓冲液密封保存。缓冲液尽量在使用前配制，不要放置过久，以免PH变化和缓冲力下降。3.3 准备固体接种将被测日粮提前12小时装入尼龙袋，通过牛瘤胃瘘管放入瘤胃内，供微生物附着消化。3.4 装置连接与预热装置按本章的流程连接完毕后，向有机玻璃水浴槽内加60升蒸馏水，即水面到达发酵罐下盖处。启动加热管，调节控温仪为39，开动循环水泵，并在每个发酵罐内倒入620ml缓冲液，以使缓冲液得到预热，盖好水浴槽。3.5 试验期操作在瘘管牛晨饲2小时后，取3头牛的瘤胃液共200

25、0ml，用两层纱布过滤，然后迅速向每个发酵罐内加入620ml。同时从瘤胃内取出已放置12小时的试验日粮接种袋，倒入相应的发酵罐中，每个罐内加入10克固体接种物。固体接种后再向每个发酵罐内加入一天的试验日粮，然后密封发酵罐，启动蠕动泵。向每个发酵罐内以1.0kg/cm2的压力通入CO2 2分钟，此时集气管与气液分离罐之间的连接开关必须关闭，通气完毕后，打开开关。4小时后，启动搅拌系统。3.6 喂料按试验需要的喂料量称取颗粒日粮，并把每天的喂料量分成所需等分，根据需要可以每天饲喂2次到8次。每次喂料6个发酵罐共需要2分钟，每次喂料后都要向发酵罐内通入1分钟CO2，维持厌氧。3.7 试验周期一个完整

26、的试验期为10天，适应期7天，采样期3天。试验周期可以根据需要调节，但是适应期不得少于5天。3.8 收集样品包括发酵罐内采样、集液瓶采样、细菌分离和气体采样。 发酵罐内采样通过CO2进口进行。这种采样的主要目的是研究NH3-N、VFA和PH等指标随时间变化的动态规律。采样方法是用50ml注射器接10cm细塑料管从CO2进口采样，立即分析各种指标。若不能立即分析样品，须向样品内加入一滴饱和氯化汞溶液，并于低温保存。 集液瓶采样是大量采样。目的在于研究各种营养成分变化的总量，包括NH3-N、VFA、TN和MCP，以及饲料各种成分的降解量。采样方法是将集液瓶放在2水浴中，按与外流总液体量的1:100

27、向瓶内加入饱和氯化汞溶液。在采样期内每天都将外流液混合均匀，从每个集液瓶各取混合均匀的样品600ml，在-20冷冻保存，在采样期结束时将每个发酵罐连续3天的样品混合均匀，取2份500ml进行冷冻干燥，并将干燥样品经1mm筛孔粉碎，密封于低温下保存供以后分析。另取1份混合液50ml，-20保存，供测定总氮（TN），氨氮（NH3-N）和挥发性脂肪酸（VFA）。 细菌分离。在每个试验期最后一天取样结束后，用每个发酵罐内的样品分别收集细菌。方法是：先用两层纱布过滤每个发酵罐的全部内容物，然后把过滤液在1000g下离心10分钟以除去饲料颗粒和原虫，再将上清液在2000g下离心20分钟，将上清液倒掉，并将

28、沉淀物（细菌细胞）重新悬浮于去离子水中第二次离心，然后将沉淀物冷冻干燥，得到的细菌细胞用于测定嘌呤含量。 气体取样。每天或全期试验结束后用“U”形管调节水平面，使发酵气体与外界大气的压力相等，然后读出体积，并换算为标准大气压下的体积。用注射器从集气管上部的开关孔取样，供分析气体组成。第二节 消化道瘘管法给试验动物安装消化道瘘管的目的是从消化道的不同部位取得食糜样品，以对饲料营养物质在各段消化道的消化代谢进行研究。对于反刍动物，饲料营养物质的瘤胃降解和后段消化道消化的机制完全不同，前者是瘤胃微生物的发酵，后者是动物自身消化酶的消化，常需分开研究。因此消化道瘘管法也就成为反刍动物消化代谢研究的基本

29、方法。研究中经常使用的瘘管有瘤胃瘘管、十二指肠瘘管和回肠瘘管。瘤胃瘘管根据研究目的可单独安装或与其它瘘管结合，十二指肠、回肠瘘管通常需结合安装。本节主要介绍消化道瘘管的外科手术安装方法及瘘管的制作。一. 瘘管的式样 瘤胃瘘管：牛的瘤胃瘘管由硬质塑料或橡胶制成，大口径瘘管一般采用橡胶材料，小口径瘘管可用60cm聚乙烯塑料棒车床加工而成。羊的瘤胃瘘管多用硬质塑料制成。硬质塑料瘤胃瘘管由底座、直管、旋套和瘘管盖构成，橡胶瘘管由上、下底座、直管和瘘管塞构成。根据研究目的，瘤胃瘘管的内径可适当增加或缩小，牛瘤胃瘘管的内径一般为515cm，羊的瘘管内径一般为48cm。瘘管壁不应过厚，一般<0.5cm

30、。瘘管底座、旋套外径约较直管外径大2cm。 十二指肠和回肠瘘管：十二指肠瘘管分为过桥瘘管和T形瘘管。过桥瘘管由两套瘘套管组成，分别安装在断开十二指肠的向心端和离心端。在体外由过桥套管将两套瘘套管连接，十二指肠食糜由向心端瘘套管流出体外，再经离心端瘘套管流入体内。过桥瘘管的优点是可以采到有代表性的十二指肠，缺点是不能长时间维持，无法用于持续数月的试验研究。T型瘘管由粘合在一起的底片、直管和可分离的外夹片、圆形卡组成。底片和直管呈T型，并因此得名。回肠瘘管与T型十二指肠瘘管相同。十二指肠和回肠瘘管用无毒的软质塑料或较硬的橡胶制成。牛用瘘管的直管外径一般不超过2.5cm,羊用瘘管的直管外径一般不超过

31、1.5cm。底片两端为半椭圆形，宽与直管外径相同，侧翼长度牛用瘘管34cm，羊用瘘管23cm。 1 5 2 3 4 6 左图 右图图 104 瘤胃瘘管式样左图为硬质塑料瘘管，右图为橡胶瘘管。1、瘘管盖 2、直管 3、旋套 4、底座 5、上下底座 6、 瘘管塞 1 2 3 上图 4 5 6 7 下图图 105十二指肠、回肠瘘管式样上图为十二指肠过桥瘘管，下图为T型十二指肠和回肠；瘘管1 向心端瘘套管 2、离心端瘘套管 3、过桥套管 4、T型瘘管直管和底座 5、橡胶瘘管塞 6、外夹片 7、圆形卡二. 手术前的准备 试验动物的选择与管理：应用消化道瘘管法进行试验研究，考虑到试验成本，一般尽量减少使用

32、的试验动物数量，这就要求严格选择试验动物，确保获得可靠的试验结果。选择之前应充分考虑研究目的，确定选择目标。所选动物应健康、无病、体况良好、性情温顺，最好选用有完整系谱、生长记录的动物，严格遵守国家有关试验动物的法律法规。 对于选定的试验动物应由研究人员提出饲养管理要求，最好由参与研究工作的人员饲养管理，其他人员管理时应进行必要的培训。管理人员对试验动物的采食量、体重、生长情况及行为习性等应做好记录。 试验动物的饲养不宜过于丰厚，以免过肥造成不必要的手术困难。手术前应禁饲至少24小时，这对于防止手术过程发生瘤胃鼓气、异物性肺炎等至关重要。 手术器械及场所消毒：对手术过程使用的器械、缝线、敷料、

33、手套、创巾、隔离衣等应进行严格消毒。一般应采用高压蒸汽灭菌，灭菌温度为121，此时蒸汽锅的压力约为1.05kg/cm2。不同物品的灭菌时间见表101。手术过程中需要对器械进行快速消毒时，可采用5%来苏儿浸泡、11000洗必太浸泡30min.、95%酒精燃烧灭菌等方法。手术室一般不少于40m2，通风良好，设备齐全。每次手术后对地面、墙壁、手术台、器械台进行彻底清洗，干燥后用2%来苏儿喷雾消毒，或用福尔马林高锰酸钾或乳酸熏蒸消毒。手术前1小时打开紫外线灯进行室内照射。表101 1.05kg/cm2（121）下不同物品的灭菌时间物 品灭菌时间（min.）金属器械、搪瓷器皿2030玻璃器皿、注射器20

34、橡胶、乳胶管、手套、药液1520布料、敷料3040引自动物试验外科手术学，中国农业出版社 手术人员准备：患有上呼吸道感染、皮肤化脓感染及刚处理过化脓感染创、进行过直肠检查和尸体剖检的人员不得参与手术。手术人员进入手术室前应更换清洁的专用衣裤，并戴上手术帽和口罩，手术帽应齐眉将头发全部遮住，口罩应遮住鼻孔。进入手术室后首先进行手、臂的清洁消毒。手术人员事先应剪断指甲并除去甲缘下的污垢。可用肥皂清洗或氨水浸泡后消毒，应特别注意将指甲下缘、指间、指关节、腕关节和肘后清洗干净。用清水冲洗时应手朝上，使水自手向肘关节流下，直到冲洗干净为止。手、臂清洁消毒的程序如下：肥皂清洗、消毒液浸泡法：氨水擦洗、酒精

35、浸泡法：肥皂清水（低碱肥皂，1020%）刷洗（2次，每次2min.）0.05%氨水2盆（在第一盆内擦洗 3min.后，再在第二盆内擦洗3min.）清水冲洗残留肥皂无菌巾拭干无菌巾拭干0.1%新洁而灭，或0.1%消毒净、0.02%洗必太，含1%有效碘的PVP碘浸泡（35min.）70%酒精浸泡（5min.）2%碘酊涂擦指甲缘、指间、腕部，70%酒精脱碘手、臂清洁消毒完毕后可穿戴灭菌的手术衣和手套。穿戴时应避免手术衣和手套的外面，并远离其他人员，在空间较大的地方进行。提起衣领，展开手术衣，将手术衣向空中轻掷，就势将手臂伸入衣袖内，由助手在身后拉紧并系扣。干戴手套时，先将灭菌滑石粉扑擦双手，用右手提

36、起左手手套袖口并外翻，左手伸进手套内；用戴有手套的左手协助右手戴上手套；分别将手套翻转部分压住手术衣袖口，戴好手套。最后用生理盐水冲去手套外的滑石粉。湿戴手套的方法与干戴法相似，戴前手套内盛满液体，戴完后用生理盐水冲洗手套外的消毒液。 施术动物术部准备：动物进入手术室前应去处术部及周围的被毛。方法是用肥皂水清洗术部及周围大面积的被毛，用毛巾拭干，之后将被毛剪断、剃净。使用脱毛剂除毛最好在手术前进行。脱毛剂配方是68硫化钠或硫化钡水溶液或硫化钠（硫化钡）、氧化锌、淀粉按122混匀，温水调成糊状。用棉球蘸上溶液涂擦脱毛部位，约5min.后被毛成糊状，纱布擦去并用清水冲洗后即可。使用糊状脱毛剂可以避

37、免脱毛剂的流散，使用时先将脱毛部位的被毛剪断，用水湿润后涂上脱毛剂，约10min.后擦去糊剂，用水冲洗。脱毛剂有臭味，有时可使脱毛部位充血，导致皮肤增厚，手术时出血增多。个别动物对除毛剂敏感。手术之前，用肥皂水洗净术部皮肤，先用碘酊消毒，后用酒精脱碘，也可用新洁而灭、洗必太、PVP碘等消毒。消毒区域应包括术部以外1015cm以上范围，擦洗时从中心部位逐渐向外涂擦。术部消毒后铺盖创巾。三. 施术动物麻醉动物麻醉的方法分为局部麻醉和全身麻醉。局部麻醉由分为表面麻醉、浸润麻醉、区域阻滞麻醉、传导麻醉和硬膜外腔麻醉；全身麻醉又分为吸入麻醉和非吸入麻醉。进行瘘管安装手术，对羊通常实施全身麻醉，对牛通常实

38、施局部麻醉。 麻醉前用药：麻醉前用药（浅麻）的目的是减少全身麻醉的用药量，增加安全范围和减少腺体分泌、胃肠蠕动和防止呕吐。可在麻醉前使用的药物包括抗胆碱能药物、镇定剂、鸦片及非鸦片类镇痛剂。各种麻醉前用药的给药途径及参考剂量见表102。表102：麻醉前用药的给药途径及参考剂量类型名称给药途径参考剂量（mg/kg）牛绵羊山羊抗胆碱能阿托品IM、IV0.0040.30.3镇静剂氯丙嗪IM1.11.22.22.2氯丙嗪IV0.21.11.11.1三氟丙嗪IV1.12.22.2丙嗪IV1.1丙酰异丙嗪IV0.221.11.11.1安定IM0.551.10.551.1镇痛剂龙朋IM0.10.20.10.

39、30.050.5龙朋IV0.03-0.10.05-0.10.01-0.5注：IM为肌肉注射；IV为静脉注射。 综合自动物实验外科手术学 局部麻醉：常用局部麻醉剂包括酯类与酰胺类。普鲁卡因、丁卡因、可卡因、氯普卡因等属酯类；利多卡因、地布卡因、卡博卡因、布大卡因等属酰胺类。表103：常用局部麻醉剂药名药效毒性使 用 浓 度作用时间（小时）别名表面麻醉浸润麻醉传导麻醉脊髓麻醉普鲁卡因115以上0.25-1%25231左右奴佛卡因丁卡因102010200.50.1-0.33%0.1-0.33%23地卡因潘妥卡因的卡因四卡因利多卡因21以下与普鲁卡因近似40.5-1%221.52赛洛卡因利格洛卡因表面

40、麻醉是将局麻药直接用于粘膜表面，对粘膜产生麻醉作用。浸润麻醉是将麻醉药注射入手术部位组织，通过进入麻醉感觉神经，方法有直线浸润、菱形浸润、扇形浸润和分层浸润等。区域阻滞麻醉是将麻醉药注射在手术部位的周围及其基地部的组织内，形成一个圆锥形、盆形或环状包围圈，阻滞圈内组织痛觉的传导。传导麻醉则是将麻醉药注射在神经干周围，麻醉该神经干所支配的区域。硬膜外腔麻醉是将麻醉药注射到脊髓硬膜外腔，阻滞脊神经的传导，使躯干的某一段产生麻醉。进行牛的瘘管安装手术时，可采用速眠新注射液（846合剂）按0.010.015mg/kg的剂量进行全身浅麻醉，手术部位用0.8盐酸普鲁卡因进行局部浸润麻醉。 全身麻醉：全身麻

41、醉分为非吸入麻醉和吸入麻醉。非吸入麻醉是通过静脉、皮下或肌肉注射麻醉药物达到全麻的效果。吸入麻醉则是使动物通过呼吸道吸入挥发性麻醉剂达到全麻的效果。吸入麻醉的优点是可以比较准确地控制麻醉深度，麻醉后动物复苏快；缺点是操作比较复杂，需要专门的麻醉装置。可用于瘘管手术的非吸入麻醉药包括巴比妥类药物、龙朋、静松灵等。巴比妥类药物具有“葡萄糖效应”，即给复苏动物注射葡萄糖后会使动物再次进入麻醉状态。目前没有龙朋的有效解毒药，使用时应特别注意剂量。静松灵是我国合成的一种麻醉药物，肌肉注射时牛的用量为0.20.6mg/kg，水牛为0.41mg/kg，羊为13mg/kg，马鹿为25mg/kg，梅花鹿为13m

42、g/kg。吸入麻醉的常用麻醉剂有氟烷、甲氧氟烷、安氟醚、氧化亚氮等。氟烷的优点是麻醉性强、诱导和复苏快速平稳、不刺激粘膜且具有扩张支气管的作用、不易燃易爆；缺点是肌松不充分、对肝脏有不良影响、过量时发生循环抑制。甲氧氟烷的麻醉效果类似于氟烷，但诱导和复苏较慢，对肝、肾功能有显著影响。安氟醚麻醉性能强、诱导复苏平稳、不刺激呼吸道粘膜、肌松效果良好，使用过程中禁用肾上腺素。氧化亚氮是一种毒性最小的吸入麻醉剂，单独使用时麻醉作用弱，肌松效果差，常和其它全身麻醉剂或麻醉佐剂复合使用。四. 手术操作 手术部位：瘤胃瘘管部位在动物左侧腹侧部，躯干侧中线稍上。十二指肠瘘管手术部位在动物右腹侧部，最后肋骨后下

43、方，躯干侧垂线的下三分之一段中点。回肠瘘管手术部位在动物右腹侧部，腰角前下方，躯干侧垂线上三分之一段中点。 打开腹腔：在手术部位纵向切开皮肤，切口应略大于瘘管底座直径。在暴露的皮下筋膜上切一小口，用手术剪纵向剪开。逐层钝性分离肌肉组织，暴露腹膜。用组织镊或止血钳提起腹膜，作一小切口，将食指和中指深入腹膜下，用手术剪沿指缝切开腹膜，暴露腹腔。 瘤胃瘘管安装：打开腹腔即可暴露出瘤胃壁。选择血管较少的区域从切口出拉出。用生理盐水浸泡过的纱布塞紧瘤胃壁的四周，以防手术过程流出的瘤胃内容物进入腹腔造成腹膜炎。在拟切开胃壁的部位四周作椭圆形缝合，缝针应穿入胃壁肌肉层，且注意不要穿透胃壁。缝合过程中不要拉紧

44、缝线，最后一针的位置与起始针基本平行，两针之间应预留一小缺口，以免发现胃壁切口过小时无法延长切口。用组织镊或止血钳提起胃壁，用手术刀或手术剪在胃壁上作一小切口。由助手提起胃壁，术者用手术剪沿椭圆形缝合方向切开胃壁。将瘤胃瘘管底座放入瘤胃内，逐渐拉紧预埋缝线，拉紧时注意将胃壁切口边缘内翻向瘤胃内。预埋缝线拉紧后打结，剪去线头。沿瘘管四周胃壁再缝入一圈缝线，作荷包缝合。打开瘤胃瘘管盖，用灭菌纱布塞住瘘管口。酒精消毒拉出的瘤胃壁，生理盐水冲洗后将拉出的胃壁放入腹腔内。在原切口后侧相距约23cm处，相同方向作一小切口，切口大小应略小于瘘管直管外径。将止血钳或持针钳通过切口伸入腹腔，夹住瘘管壁，将瘘管从

45、小切口拉出。之后逐层缝合大切口，腹膜和肌肉层连续单纯缝合，皮肤作结节或双间断缝合。如有必要，对小切口瘘管壁上下两侧的皮肤作结节缝合。缝合后用碘酊等消毒创口，大切口用四层灭菌纱布覆盖。旋上瘘管旋套和瘘管盖。如瘘管直径较大，也可不作小切口，将瘘管直接在原切口处固定。 十二指肠瘘管安装：打开腹腔，将手伸入腹腔找到真胃，沿真胃向后即可找到十二指肠。安装瘘管部位应距幽门5cm以上，以防瘘管底座侧翼将幽门阻塞。将十二指肠一段由切口拉出，浸泡生理盐水的灭菌纱布塞住切口。安装“T”形瘘管时，在肠系膜附着的对侧，沿肠管方向缝入一圈缝线，要求与与瘤胃瘘管相同。纵向切开肠管，置入瘘管底座，作双层荷包缝合（同瘤胃瘘管

46、安装）。在原切口后方作一略小于直管外径的小切口，拉出瘘管，缝合切口，外夹片和圆形夹体外固定瘘管。作十二指肠过桥瘘管时，先安装向心端瘘管，拉出向心端瘘管的小切口在原切口的前方，之后安装离心端瘘管。切断十二指肠，断口处作内翻荷包缝合。缝合切口，外夹片和圆形夹体外固定瘘管，过桥套管将两侧瘘管连接。 回肠瘘管安装：回肠瘘管安装与十二指肠基本相同。寻找回肠时，可先找到盲肠，之后沿盲肠找到回盲口。回盲口是回肠与盲肠的连接处。安装瘘管的部位应离开回盲口。安装十二指肠和回肠瘘管时，应注意瘘管体外方向稍偏向地面，以方便食糜的采集。五. 瘘管动物的术后护理和维护 动物手术后应尽快使其从麻醉状态中恢复。术后一周内每

47、天注射抗菌素（如青霉素、链霉素），并消毒创口。一周后可拆线。 保证充足的清洁饮水。喂给优质的柔软粗饲料。尤其安装十二指肠和回肠瘘管时，应控制喂量。术后第一天喂量，羊50g左右，视情况每日递增50g;牛250g左右，每日递增250g。食欲恢复正常后开始恢复补饲精料。 一般术后1个月即可用于试验。使用过程中应定期清除瘘管四周被毛、清洗并消毒瘘管及皮肤。瘘管动物使用较多的实验室应配备电动毛剪（羊用或犬用剪均可），以方便维护。第三节 血管导管法血管导管法（cannulation of arteries and veins）是将很细的血管导管（catheters of blood vessels）一端插

48、入血管中，另一端引出体外以取得血液样品的一种外科手术方法，广泛应用于各种动物，包括人的代谢研究中。与穿刺法比较，血管导管法对动物的刺激极小，不会导致穿刺采样时通常出现的血糖升高、血钙和其它血液成份的变化，因而取得的血液样品更具代表性。对深部血管以及连续采集血样时，必须采用血管导管法。一. 导管的材料与维护 材料：早期用聚乙烯管（polyethylene tubing）制作血管导管，缺点是容易扭结。之后采用医用PVC管（polyvinyl tubing）制作。PVC管对组织的刺激较小，需用ethylenoxide消毒，且消毒后需放置至少24h以排出消毒时产生的有毒物质。蒸汽消毒使PVC管的物理性

49、质发生不利变化。特氟隆（聚四氟乙烯，Teflon）和硅胶管也是制作血管导管的良好材料，其价格较高。 导管结构及维护：血管导管一般由内管、外套管、顶端磨平的注射针头和单通阀组成。一端的内管长于外套管，是插入血管内的部分；另一段的内管与磨平的针头和单通阀连接，是引出体外的部分。外套管的作用是固定导管和防止内管纽结。血管导管安装好后，通过经常地用11000或12000的肝素生理盐水冲洗保持导管的通畅。即使如此，也经常发生导管的阻塞，阻塞一般是在导管插入血管端的头部形成了纤维蛋白瓣膜所致。此时可顺利地由导管向血管内注入液体，但因抽取血样时形成的负压使瓣膜盖住导管头部而不能抽出血样。导管体外端的固定方法

50、有两种。一是将导管用缝线固定在皮肤上，这种方法较为简单，应注意固定部位皮肤的消毒，以防引起感染。二是做一长方形厚布袋，将布袋用粘合剂粘在皮肤上，引出体外的导管至于布袋内。该方法不易造成皮肤感染，但随着被毛的生长，需要经常剪除被毛，重新粘结布袋。 导管的种类及应注意的问题：反刍动物营养研究中常用的血管导管包括颈静脉导管、颈动脉导管、门静脉导管、肠系膜静脉导管、股动脉导管、股静脉导管、右侧瘤胃静脉导管等。在安装和使用各种血管导管时均需注意以下问题：3.1 可在同一侧安装股静脉、股动脉导管。安装之后很快形成侧循环代偿原有血液循环通道。3.2 静脉导管较动脉导管容易发生阻塞。3.3 股动脉导管插入血管

51、内的深度不应超过肾动脉的分支处，否则导管头部形成纤维蛋白膜或血凝块并脱落时，有可能进入肾脏导致梗死。3.4 为保持导管通畅，手术后12h内应用生理盐水冲洗导管，之后每天冲洗一次。冲洗之后在导管内注满肝素生理盐水。注入量以恰好注满导管为宜，注意不要过量。尽管肝素在体内仅能维持短时间的活性，过量注入有可能影响试验结果。3.5 发生导管阻塞时，用细的弹性钢丝有可能去处阻塞物，但操作时要注意严格消毒。3.6 导管的安装手术和安装后的维护要精心，以使导管维持较长的通畅时间。一般安装后导管可使用数月。但即使精心手术和维护，仍有可能发生阻塞，应准备后备的试验动物。3.7 安装血管导管的试验动物一般应单栏饲养

52、，以防互相咀嚼导管。用导管向体内灌注溶液时，应注意保定好动物，防止动物嚼断导管。3.8 安装股动脉导管时应特别注意结扎股动脉的侧支血管，防止手术过程出血过多，造成术野模糊，难以安装导管。二. 血管导管的制作血管导管的长短、粗细视插入的血管而定，可根据实验室条件和可用材料制作。下面介绍Les Bruce使用的方法，制作的导管主要用于绵羊门静脉、肠系膜经脉和股动脉的导管安装，初次制作导管时可作参考。 材料：直尺（约30cm），刀片，剪刀，注射器针头（各种型号），小锉刀，1ml注射器，乳胶手套，镊子，肥皂。硅胶：流体，用于粘合PVC管套和硅胶管。二甲苯：用于浸泡PVC管，使其扩张。环己酮：用于粘合P

53、VC管套，使用时先将PVC管套好，用带25号针头的1ml注射器将环己酮少量注入到管间的缝隙中。强力万能胶：用于粘结缝针于静脉导管的内套管上。 动脉导管制作：动脉导管式样见图106图106 动脉导管式样a医用硅胶管（0.76mm i.d., 1.65mm o.d.） b1.2.0mm i.d, 3.0mm o.d. PVC管 b2.1.0mm i.d., 1.5mm o.d. PVC管 b3.1.0mm i.d., 2.0mm o.d. PVC管 c.19号针头 d.单通阀e.缝线图中为股动脉导管的尺寸，其它动脉导管的制作材料相同，尺寸可根据情况而定。制作时，准备好单通阀、PVC管、硅胶管、各种

54、粘合剂。19号针头截取顶端针尖、磨平备用。PVC管b2、b3剪成1cm左右小段，浸泡在盛有二甲苯的小玻璃瓶中。直尺量取114cm硅胶管和78cmPVC管b1。操作者戴乳胶手套，将硅胶管、PVC管b1用肥皂水清洗，清水冲洗并晾干。先在硅胶管上套前端的PVC管b3，再套上PVC管b1和后端PVC管b3，PVC管b1应套住两段PVC管b3。最后将PVC管b2套在硅胶管上， b2 与b3间留12mm的间隙。在套PVC管b2 、b3的部位事先涂少量硅胶，在PVC管b1和b3的间隙中注入少量环己酮粘合。待粘合剂凝固后，用缝针在后端PVC管b3上缝入约25cm缝线，注意缝针要穿入PVC管b3内，但不能穿透硅胶管。将磨平的19号针头插入硅胶管内，单通阀与针头连接。酒精冲洗消毒导管内部，晾干后用纱布包裹并蒸汽消毒备用。 静脉导管的制作：颈静脉导管仅将约25cm硅胶管或1.5mm o.d.医用PVC管与磨平针头和单通阀连接即可，在导管15cm处作一标记，为导管插入静脉的长度。其它静脉导管的式样见图107。图107 静脉导管式样a医用硅胶管（0.64mm i.d., 1.19mm o.d.） b1.1.5mm i.d, 2.10mm o.d. PVC管 b2.1.0mm i.d., 1.5mm o.d. PVC管 c.20号针头 d.单通阀 e.缝线 f.9号缝针静脉导管的制作方法