离子交换层析ion exchange chromatography

1、离离 子子 交交 换换 层层 析析ion exchange chromatography一、原理一、原理离子交换层析离子交换层析是用是用离子交换剂离子交换剂（具有离子（具有离子交换性能的物质）交换性能的物质）作固定相作固定相，利用它与流动，利用它与流动相中的离子能进行相中的离子能进行可逆的交换可逆的交换性质来分离离性质来分离离子型化合物的层析方法。子型化合物的层析方法。 即溶液中的离子同离子交换剂上即溶液中的离子同离子交换剂上功能基团功能基团交换反应交换反应的过程。的过程。 带电荷量少带电荷量少，亲和力小的，亲和力小的先先被被洗脱洗脱下来，下来，带电荷量多带电荷量多，亲和力大，亲和力大的的后后

2、被被洗脱洗脱下来。下来。离子交换过程示意：离子交换过程示意：起始起始 吸附吸附 解吸解吸 完成完成 x+ : 起始缓冲离子起始缓冲离子 y+ ：待分离离子待分离离子 z+ ：待分离离子待分离离子 二、离子交换剂的种类二、离子交换剂的种类 在惰性载体上引入带有电荷的活性基团即在惰性载体上引入带有电荷的活性基团即离子交换剂。离子交换剂。（一）按活性功能基团带电荷性质不同（一）按活性功能基团带电荷性质不同阳离子交换剂阳离子交换剂 带负电荷，与阳离子交换带负电荷，与阳离子交换阴离子交换剂阴离子交换剂 带正电荷，与阴离子交换带正电荷，与阴离子交换（二）按载体种类不同（二）按载体种类不同1.离子交换树脂离

3、子交换树脂：主要有聚苯乙烯树脂：主要有聚苯乙烯树脂苯乙烯苯乙烯+二乙烯苯二乙烯苯 聚苯乙烯聚苯乙烯 （单体）（交联剂）（单体）（交联剂） 二乙烯苯二乙烯苯交联度交联度 = 100% 苯乙烯苯乙烯 + 二乙烯苯二乙烯苯交联度大，网孔变小，大分子量的离子不交联度大，网孔变小，大分子量的离子不能进入树脂颗粒内发生离子交换。能进入树脂颗粒内发生离子交换。在不影响分离的情况下，以采用在不影响分离的情况下，以采用交联度较交联度较高高的树脂为好，这样可以提高树脂对离子的树脂为好，这样可以提高树脂对离子的选择性的选择性 。目数目数：离子交换树脂的颗粒直径大小：离子交换树脂的颗粒直径大小 Dowex 50 为为

4、20-50目目Dowex 20 840 m 50 297 m 100 149 m （代表二乙烯苯的百分含量）代表二乙烯苯的百分含量）树脂树脂resin（据所含交换基团的性质分）据所含交换基团的性质分）阳离子交换树脂阳离子交换树脂 强酸型强酸型 含磺酸基团含磺酸基团 (R-SO3H) 中等酸型中等酸型 含磷酸基团含磷酸基团 (-O-PO2H4) 弱酸型弱酸型 含酚基、羧基含酚基、羧基阴离子交换树脂阴离子交换树脂 强碱强碱 含季胺基团含季胺基团 -N+(CH3)3 弱碱弱碱 含叔胺、伯胺基团含叔胺、伯胺基团-N(CH3)2 阴离子交换树脂对化学试剂及热都不如阳离阴离子交换树脂对化学试剂及热都不如阳

5、离子交换树脂稳定。子交换树脂稳定。 2.离子交换纤维素离子交换纤维素阴离子交换纤维素阴离子交换纤维素 如如:DEAE-纤维素纤维素 pH8.6以下分离中性或酸性物质以下分离中性或酸性物质,具二乙具二乙胺乙基胺乙基阳离子交换纤维素阳离子交换纤维素如如:CM-纤维素纤维素 一一般般pH4条件下使用条件下使用,具有羧甲基具有羧甲基 3.离子交换凝胶离子交换凝胶 分离大分子物质分离大分子物质如：葡聚糖（如：葡聚糖（Sephadex）、）、 聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺（PAG）、）、琼脂糖（琼脂糖（Sepharose）三、操作注意点三、操作注意点（一）离子交换剂的选择（一）离子交换剂的选择原则：原则：根据被分

6、离物质的性质选择根据被分离物质的性质选择同一性同一性质离子交换剂中选用对被分离物质各组分质离子交换剂中选用对被分离物质各组分之间结合力之间结合力差异大差异大的型号交换剂，以保证的型号交换剂，以保证通过离子交换层析后能得到比较满意的结通过离子交换层析后能得到比较满意的结果。果。考虑因素：考虑因素：1.被分离物质带何种电荷被分离物质带何种电荷2.被分离物质分子的大小被分离物质分子的大小大分子物质选用凝胶，其次选用纤维素大分子物质选用凝胶，其次选用纤维素3.被分离物质所处的环境被分离物质所处的环境4.被分离物质的物理化学性质被分离物质的物理化学性质5.被分离物质的大概数量被分离物质的大概数量根据分离

7、过程的实验条件根据分离过程的实验条件 强酸强碱强酸强碱应用广泛应用广泛 弱酸型弱酸型只能在碱性只能在碱性pH范围内使用范围内使用 弱碱型弱碱型只能在酸性只能在酸性pH范围内使用范围内使用（二）缓冲液的选择（二）缓冲液的选择原则原则：不能发生化学反应，所带电荷应与样：不能发生化学反应，所带电荷应与样品一致。避免使样品变性品一致。避免使样品变性(三三)洗脱剂洗脱剂 原则原则：所用洗脱液比吸着物质具有更活：所用洗脱液比吸着物质具有更活泼的离子或基团泼的离子或基团改变改变pH或离子强度或离子强度 增强洗脱液与离子交换剂的结合力增强洗脱液与离子交换剂的结合力降低分离物与离子交换剂的结合力降低分离物与离子

8、交换剂的结合力 洗脱方式：梯度洗脱洗脱方式：梯度洗脱四、应用四、应用分离多肽蛋白、氨基酸、核酸及其他分离多肽蛋白、氨基酸、核酸及其他带电的生物分子带电的生物分子离子交换层析法分离氨基酸离子交换层析法分离氨基酸 袁均林原理原理 所用样品为天冬氨酸和组氨酸的混合液，所用样品为天冬氨酸和组氨酸的混合液，分别属酸性氨基酸分别属酸性氨基酸( (pI2.77)pI2.77)、碱性氨基酸碱性氨基酸( (pI7.59)pI7.59)，用用强酸型阳离子交换树脂强酸型阳离子交换树脂Dowex50，在一定的洗脱条件下洗脱，将它在一定的洗脱条件下洗脱，将它们分离。利用氨基酸可与茚三酮反应生成有们分离。利用氨基酸可与茚

9、三酮反应生成有色化合物进行氨基酸鉴定。色化合物进行氨基酸鉴定。紫色物质，用于紫色物质，用于氨基酸的比色测定和纸层析显色氨基酸的比色测定和纸层析显色与水含茚三酮的反应：与水含茚三酮的反应：R CHNH2COOHOOOHOH+2H2OOOOONHCHRN CHCOOHRCO2OON CH2ROONH2HRCHO +OOOHOHOONHOOOONOOHH2O Asp HispH4.2pH 10器材器材 1. 层析柱等层析柱等2.2. 沸水浴沸水浴试剂试剂 Dowex50 0.1mol/L NaOHpH4.2柠檬酸缓冲液柠檬酸缓冲液样品液：氨基酸混合液样品液：氨基酸混合液茚三酮混合液茚三酮混合液操作操

10、作 1 1、层析：将、层析：将Dowex50装柱后，用装柱后，用0.1mol/L NaOH清洗树脂清洗树脂5分钟。再用分钟。再用pH4.2柠檬酸缓柠檬酸缓冲液冲液平衡平衡10分钟。（方法同凝胶层析法）分钟。（方法同凝胶层析法）加样加样8滴。当样品进入树脂后，加入滴。当样品进入树脂后，加入pH4.2柠檬酸缓冲液洗脱加样后立即收集，每管柠檬酸缓冲液洗脱加样后立即收集，每管收集收集3ml（控制流速控制流速15滴滴/ /分钟）。当第一分钟）。当第一峰一出现，换用峰一出现，换用0.1mol/L NaOH作洗脱液，作洗脱液，直至第二峰收集完毕。用直至第二峰收集完毕。用pH4.2缓冲液再平缓冲液再平衡衡10分钟，再生。分钟，再生。2 2、检测：从第、检测：从第2管起每收集管中加入管起每收集管中加入2ml茚三茚三酮显色液，充分混合，沸水浴酮显色液，充分混合，沸水浴15分钟，自分钟，自来水冷却，观察氨基酸与茚三酮的显色反来水冷却，观察氨基酸与茚三酮的显色反应，若生成紫色化合物，则