流式—周期 凋亡

1、细胞流式技术讲解细胞流式技术讲解 以凋亡和周期为例以凋亡和周期为例讲解人：李新鑫2013.11.8原理n 流式细胞仪是对细胞进行自动分析和分选的装置。它可以快速测量、存贮、显示悬浮在液体中的分散细胞的一系列重要的生物物理、生物化学方面的特征参量，并可以根据预选的参量范围把指定的细胞亚群从中分选出来。n 流式细胞仪主要由四部分组成。它们是：流动室和液流系统；激光源和光学系统；光电管和检测系统；计算机和分析系统。 n流动室和液流系统流动室和液流系统 流动室由样品管、鞘液管和喷嘴等组成，样品管贮放样品，单个细胞悬液在液流压力作用下从样品管射出；鞘液由鞘液管从四周流向喷孔，包围在样品外周后从喷嘴射出。

2、由于鞘液的作用，被检测细胞被限制在液流的轴线上。 n 激光源和光学系统激光源和光学系统 经特异荧光染色的细胞需要合适的光源照射激发才能发出荧光供收集检测。n光电管和检测系统光电管和检测系统 经荧光染色的细胞受合适的光激发后所产生的荧光是通过光电转换器转变成电信号而进行测量的。n计算机和分析系统 经放大后的电信号被送往计算机分析器。 细胞凋亡分析 Annexin V/PI双染法检测细胞凋亡n原理原理 细胞凋亡普遍存在于生物界，既发生于生理状态下，也发生于病理状态下。细胞凋亡对胚胎发育及形态发生（morphogenesis）、组织内正常细胞群的稳定、机体的防御和免疫反应、疾病或中毒时引起的细胞损伤

3、、老化、肿瘤的发生进展起着重要作用。 在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine, PS）位于细胞膜的内侧，但在细胞凋亡的早期，PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。Annexin-V是一种分子量为35.8KD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力特异性结合。将Annexin-V 进行荧光素FITC标记，以标记了的Annexin-V 作为荧光探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。 碘化丙啶(Propidine Iodide, PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI 能够透过细胞膜而使细

4、胞核红染。 因此将因此将 Annexin-V 与与 PI 匹配使用，就可以将凋亡早晚期的细胞以及死匹配使用，就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来。细胞区分开来。实验步骤n1.细胞收集，染色 离心收集悬浮细胞，微量离心机转速 500rcf，离心时间5min，弃培养基。 （贴壁细胞用不含 EDTA 的胰酶消化收集，胰酶消化时间不易过长，以防引起假阳性） 用冷 PBS 洗涤细胞两次（2000rcf，离心时间 3min 收集细胞）。 用 300ul 1X Binding Buffer 悬浮细胞， 在细胞悬浮液中加入 3ul Annexin V-FITC，轻轻混匀后放置于冰上。 避光条件下孵育 1

5、5 分钟。 加入 3ul PI 后轻轻混匀于 2-8C 避光条件下孵育 5 分钟。 在 1 小时内用流式细胞仪或荧光显微镜检测。2.上机检测 细胞周期分析 PI染法检测细胞周期n原理 细胞周期指由细胞分裂结束到下一次细胞分裂结束所经历的过程，所需的时间叫细胞周期时间。可分为四个阶段（见图）： G1期(gap1)，指从有丝分裂完成到期 DNA复制之前的间隙时间； S期(synthesis phase)，指DNA复制的时期； G2期(gap2)，指DNA复制完成到有丝 分裂开始之前的一段时间； M期又称D期(mitosis or division)，细胞分裂 开始到结束。 n从增殖的角度来看，可将

6、高等动物的细胞分为三类：连续分裂细胞，在细胞周期中连续运转因而又称为周期细胞，如表皮生发层细胞、部分骨髓细胞。休眠细胞暂不分裂，但在适当的刺激下可重新进入细胞周期，称G0期细胞，如淋巴细胞、肝、肾细胞等。不分裂细胞，指不可逆地脱离细胞周期，不再分裂的细胞，又称终端细胞，如神经、肌肉、多形核细胞等等。细胞周期的时间长短与物种的细胞类型有关，如：小鼠十二指肠上皮细胞的周期为10小时，人类胃上皮细胞24小时，骨髓细胞18小时，培养的人了成纤维 细胞18小时，CHO细胞14小时，HeLa细胞21小时。不同类型细胞的G1长短不同，是造成细胞周期差异的主要原因。n流式细胞结果图各参数的意义：流式细胞结果图

7、各参数的意义：常用的流式细胞术分析细胞周期的方法是依据细胞DNA含量（横坐标）来分析的：G1期：细胞DNA复制还没有开始，也是DNA含量最少的，即流式检测结果图的第一个峰；S 期：细胞开始复制，到完成复制，是一个一倍DNA到二倍DNA的过程，在流式结果图中显示期跨度特别大（第二个不高但很宽的峰）；G2期：DNA复制完成至分裂的一段时间，此时细胞内含二倍DNA，在流式结果图中的第二个峰；M期：细胞分裂过程，此时细胞内也是二倍DNA，用DNA含量的方法是无法与G2期分开，所以有第三峰明显升高时报告：G2/M期阻滞。 Cell Cycle Analysis by DNA Content (Propi

8、dium Iodide)Fixation1. Wash cells by centrifugation (e.g. 200 x g, 5 min, 4C) in protein-free buffer, such as Phosphate Buffered Saline without Ca+2 or Mg+2 (PBS). 2. (Optional) Repeat step 1. 3. Resuspend at 2 x 106 cells in 1 ml ICE COLD BUFFER. Cell number will effect staining quality!Optional: U

9、se pre-coated or silanized polypropylene tubes to minimize sticking. Pre-coat tubes overnight with 2% Bovine Serum Albumin (BSA) in PBS. 4. Vortex gently, slowly adding the cell suspension dropwise to 9 ml of 70% ethanol in a 15 ml polypropylene centrifuge tube (Falcon Cat. No. 352097). OR: Vortex g

10、ently, slowly adding the cell suspension dropwise to an equal volume of COLD ABSOLUTE ethanol. Optional: Observe cell preparation with a microcope to verify minimum cell clumping. 5. Store at 4C to - 40C for AT LEAST 2 hours, 12 - 24 hours is best. Can be stored for up to 2 years before staining. 6.

11、 Centrifuge cells at 200 x g, 10 min, 4C. 7. Resuspend pellet in 3 ml COLD PBS and transfer to Falcon 12 X 75 mm (Cat. No. 352054) polystyrene tubes for staining if other tubes (polypropylene) were used for the fixation steps above. Falcon Cat. No. 352235 have nylon filter caps and will remove clump

12、s. Staining with Propidium Iodide (PI)1. Wash cells at least once with COLD PBS. Cells may form a diffuse ring-shaped pellet, so centrifuge longer ( e.g. 200 x g, 10 min, 4C). 5. Resuspend cells in 300 - 500 l PI/Triton X-100 staining solution: to 10 ml of 0. 1 % (v/v) Triton X-100 (Sigma) in PBS ad

13、d 2 mg DNAse-free RNAse A (Sigma) and 0.40 ml of 500 g/ml PI (e.g., Roche). Prepare freshly. A stock solution of PI, made by dissolving 1 mg PI in 2 ml water, can be stored several months at 0 to 4C. (Or buy 500 g/ml PI from Roche new Catalog # 11348639001, old Cat. No. 1348639). Note: If the RNAse

14、is not DNAse-free, boil a solution of 2 mg RNAse A in 1 ml water for 5 min. Aliquot and store at -20C. 3. Incubate 37C for 15 minutes or for 30 min at 20C. 4. Transfer tubes to ice or store at 4C PROTECTED FROM LIGHT. 5. Acquire data on flow cytometer within 48 hours (but might last up to 2 weeks).

15、May require nylon mesh filtration (eg, Filcons, BD Cat. No. 340627) to remove cell clumps or syringing (25 gauge, UCSD Storehouse # 7245) to break up cell clumps. Can acquire 5-30 samples per hour, depending on cell preparation. 6. MulticycleAV (IBM-PC) or ModFit LT (Macintosh) is used to fit the data to various cell cycle models. See below for examples Mo