抗vegf受体单克隆抗体及其制备方法和应用

1、抗抗 vegf 受体单克隆抗体及其制备方法和应用受体单克隆抗体及其制备方法和应用CN 101245106 B摘要摘要本发明涉及一种人源抗 VEGF 受体 II 单克隆抗体。提供了单克隆抗体的免疫球蛋白重链和轻链氨基酸序列，该单克隆抗体的制备方法和在制备抑制血管生长药物中的应用。本发明的单克隆抗体适用于制备治疗肿瘤和视网膜病变的药物。 权利要求权利要求(8)1. 一种血管内皮细胞生长因子受体 2 的单克隆抗体，具有 SEQ ID No. 1 所示的免疫球 蛋白重链氨基酸序列和 SEQ ID NO 2 所述的免疫球蛋白轻链氨基酸序列。2. 一种编码权利要求 1 所述单克隆抗体的 DNA。3.根据权

2、利要求 2 所述的 DNA，其特征在于，所述的 DNA 序列为 cDNA。4. 一种含有权利要求 2 所述 DNA 的核酸载体序列。5. 一种携带权利要求 2 所述 DNA 的宿主细胞。6.权利要求 1 所述单克隆抗体的制备方法，依次包括如下步骤：(1)逆转录权利要求 5 所述的宿主细胞的总 RNA，获得 cDNA ；(2)利用 SEQ ID No. 3 或 SEQ ID No. 4 为反向引物，以步骤所述的 cDNA 为模板，通 过 PCR 扩增获得血管内皮细胞生长因子受体 2 抗体重链和轻链的DNA 序列；(3)将步骤（2)所述的血管内皮细胞生长因子受体 2 抗体重链和轻链的 DNA 序列

3、分别 插入到哺乳动物表达质粒；(4)将步骤 C3)所述的质粒纯化，通过共转染 CHO 细胞得到从质粒表达的重组抗体； 或者，依次包括如下步骤：(1)将权利要求 3 所述的 cDNA 插入到编码有二氢叶酸还原酶的质粒，使重链和轻链的 cDNA 位于同一质粒，并且分别由各自的 CMV 启动子驱动，二氢叶酸还原酶基因由 SV40 早期 启动子驱动；(2)提取步骤（1)所述的质粒并将质粒转人二氢叶酸还原酶缺陷的 CHO 细胞；(3)选择性培养经过消化的步骤（所述的 CHO 细胞，筛选高表达的细胞株；(4)将步骤 C3)获得的细胞株进行 MTX 梯度加压，MTX 浓度最终加至500-2000nM，选择表

4、达量最高的克隆。7. 一种用于制备抑制血管生长药物的组合物，包含治疗有效浓度的权利要求 1 所述单 克隆抗体和药学上可接受的载体。8.根据权利要求 7 所述的组合物，其特征在于，所述的治疗有效浓度范围为静脉注射 每千克体重 0. 1IOOmg 或眼内玻璃体注射每眼 0. 01lOOmg。说明说明抗 VEGF 受体单克隆抗体及其制备方法和应用技术领域0001 本发明属生物技术领域，特别是涉及一种单克隆抗体。 背景技术0002 血管新生（angiogenesis)是指从已经存在的血管上生长出新的血管的过程。对 绝大多数成年个体的器官来说，正常情况下并无血管的新生。血管新生在正常生理状况下 只见于极

5、少数的组织器官，例如月经周期中的子宫内膜等。但在某些病理状态下，例如肿瘤 和创伤修复等过程中，可发生血管新生。业已证明，在肿瘤等疾病，血管新生是疾病发展过 程中的重要步骤。如果能抑制血管新生，便可阻止肿瘤等疾病的病情发展，从而达到治疗 疾病之目的(Folkman, 2002, Role of angiogenesis in tumor growth and metastasis, Semin Oncol. 29(6Suppl 16) :15-8 ；Witmer et al. ,2003, Vascularendothelial growth factors and angiogenesis i

6、n eye disease, Prog RetinEye Res. 22:129。0003 血管新生受多种因子的调控，其中血管内皮细胞生长因子（vascularendothelial cell growth factor, VEGF)是诱导血管新生的关键因子(Leung etal.，1989，Vascular endothelial growth factor is a secreted angiogenicmitogen, Science,246 ： 1306-1309 ；Ferrara et al.,2003, The biology ofVEGF and its receptors, N

7、ature Medicine 9:669-676)。VEGF 是一种多肽，可由多种细胞分泌产生，在肿瘤细胞 VEGF 的表 达量尤其高。且其表达量与肿瘤的恶性程度成正比。VEGF 与位于血管内皮细胞的特异受 体相结合，经受体信号传递系统刺激血管内皮细胞的分裂增生，形成新的血管。VEGF 可与两 个受体结合，它们分别是 VEGF 受体 I (VEGFRl)和 VEGF 受体 II (VEGFR2)。其中 VEGFR2 是 传导 VEGF 信号，促进血管形成的关键受体（Neufeld et al.，1999，Vascular endothelial growth factor (VEGF)and

8、itsrec 印tors，The FASEB Journal，13 :9-22)。VEGFR2 蛋白分 子由细胞外区，跨膜区和胞质区三部分组成。VEGF 能与 VEGFR2 的细胞外区相结合，这一结 合可诱发 VEGFR2 胞质区酪氨酸激酶基团的磷酸化，从而启动细胞内的信号传递，引起血管 内皮细胞的增生、迁移和血管形成，并阻止血管内皮细胞的凋亡。鉴于 VEGFR2 在促进血管 新生信号传递过程中的关键性作用，抑制 VEGF 与 VEGF2 的结合便可达到阻止血管新生，冶 疗疾病的作用。具有阻断 VEGFR2功能的药物便可用来治疗肿瘤等血新生疾病。0004 单克隆抗体由于特异性强，体内半衰期长，

9、毒副作用小而成为了新一代的药物形 式。尤其近年来开发的人源化或全人源单克隆抗体避免了早期鼠源抗体的免疫反应问题， 是一种理想的药物形式。在人体内存在有成千上万分泌不同抗体的淋巴细胞。每一个淋巴 细胞只表达一种抗特定抗原决定簇的单克隆抗体。因此每一个人体内都存在一个庞大的单 克隆抗体库。在不同的个体中，由于接受到刺激的抗原不同，所分泌的抗体亦不尽相同。在 某些个体，由于自身生理或病理状况的特殊状态，亦可产生抗自身蛋白质的抗体。因此分离 能分泌特异性抗体的人淋巴细胞是制备人源抗体的一个可行途径。另外也可以用其他方法 制备全人源单抗，例如用人噬菌体抗体文库筛选法或利用人 Ig 转基因鼠等。中国专利申

10、请 00805856. 3 公开了一种与KDR(即 VEGFR2)结合的，亲和性和人类 VEGF 可比的，能够中和3KDR 的激活的免疫球蛋白分子，并公开了其氨基酸序列。目前尚没有与本发明相同或相近的 氨基酸序列的全人源抗 VEGFR2 单克隆抗体，用于抑制血管增生、治疗血管增生性疾病的报 道。发明内容0005 所要解决的技术问题0006 本发明所要解决的技术问题是提供一种抗 VRGF 受体单克隆抗体及其制备方法和 用途，以填补目前在抗 VRGF 受体单克隆抗体种类上的空白，克服现有抗血管新生药物特异 性和人源化等方面的缺陷。0007 技术方案0008 本发明的技术方案之一是提供一种 VEGF

11、R2 的单克隆抗体，具有 SEQ IDNo. 1 所示 的免疫球蛋白重链氨基酸序列和 SEQ ID NO 2 所述的免疫球蛋白轻链氨基酸序列，或者添 加、取代、插入或缺失一个或多个氨基酸的同源序列，或其等位基因及其衍生序列所对应的 氨基酸序列。0009 本发明的技术方案之二是提供一种编码上述 VEGFR2 单克隆抗体的 DNA 序列。优 选所述的 DNA 序列为 cDNA。0010 本发明的技术方案之三是提供一种含有上述 VEGFR2 单克隆抗体的 DNA 序列的核 酸载体序列。所述核酸载体序列是指质粒、病毒序列等携带有所述 DNA 序列的核酸。0011 本发明的技术方案之四是提供一种携带上述

12、 VEGFR2 单克隆抗体 DNA 序列的宿主 细胞。0012 本发明的技术方案之五是提供上述全人源抗血管内皮生长因子受体 II 的单克隆 抗体的制备方法，依次包括如下步骤：0013 (1)通过细胞移植在免疫缺陷的小鼠体内扩增人源的分泌特异性抗 VEGFR2 抗体 的淋巴细胞；0014 (2)用步骤所述的淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞相融合，制备分泌单克隆抗体 的杂交瘤细胞；0015 (3)筛选分离获得抗 VEGFR2 的杂交瘤细胞株；0016 或者，依次包括如下步骤：0017 (1)逆转录宿主细胞的总 RNA，获得 cDNA ；0018 (2)利用 SEQ ID No. 3 或 SEQ ID No

13、. 4 为反向引物，以步骤（1)所述的 cDNA 为模 板，通过 PCR 扩增获得 VEGFR2 抗体重链和轻链的 DNA 序列；0019 (3)将步骤所述的 VEGFR2 抗体重链和轻链的 DNA 序列分别插入到哺乳动物表 达质粒；0020 (4)将步骤（所述的质粒纯化，通过共转染 CHO 细胞得到从质粒表达的重组抗 体；0021 或者，依次包括如下步骤：0022 (1)将带有 VEGFR2 单克隆抗体编码序列的 cDNA 插入到编码有二氢叶酸还原酶 (DHFR)的质粒，使重链和轻链的 cDNA 位于同一质粒，并且分别由各自的 CMV 启动子驱动， DHFR 基因由 SV40 早期启动子驱动

14、；40023 (2)提取步骤（1)所述的质粒并将质粒转人 DHFR 缺陷的 CHO 细胞；0024 (3)选择性培养经过消化的步骤（2)所述的 CHO 细胞，筛选高表达的细胞株；0025 (4)将步骤（3)获得的细胞株进行 MTX 梯度加压，MTX 浓度最终加至 500-2000nM，选择表达量最高的克隆。0026 本发明的技术方案之六是提供一种用于制备抑制血管生长药物的组合物，包含治 疗有效浓度的上述单克隆抗体和药学上可接受的载体。优选地，所述的治疗有效浓度范围 为静脉注射每千克体重 0. 1IOOmg 或眼内玻璃体注射每眼 0. 01lOOmg。0027 本发明的技术方案之七是提供一种中和

15、 VEGFR2 的方法包括，对哺乳动物细胞施 用有效浓度的上述的抗体使之中和 VEGFR2。0028 本发明的技术方案之八是提供一种抑制肿瘤或视网膜血管生长的方法包括，对哺 乳动物细胞施用有效浓度的上述的抗体使之中和 VEGFR2。0029 本发明是通过以下方式实现的：0030 为了制备人源的单克隆抗体，本发明首先筛选了大量病人的血清，从中发现了一 例呈抗 VEGFR2 阳性的样品。进一步用细胞移植的方法在免疫缺陷的小鼠扩增特异性抗 VEGFR2抗体的淋巴细胞，再用该淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞相融合制备分泌单克隆抗体的 杂交瘤细胞。利用这一方法，本发明分离到了若干抗 VEGFR2 的杂交瘤细胞株

16、。通过进一步 的实验，得到了一个能阻断 VEGFR2 与其配体 VEGF 相结合的全人源抗人 VEGFR2 单克隆抗 体。0031 本发明提供了该抗 VEGFR2 单克隆抗体的氨基酸序列。该单克隆抗体重链的氨基 酸序列如 SEQ NO 1，其轻链的氨基酸序列如 SEQ NO 2。该单克隆抗体的 DNA 序列从该抗体 的杂交瘤细胞的 RNA 经逆转录制备才 DNA 和 PCR 扩增后直接获得。根据分子生物学的常识， 同一氨基酸可由不同的 DNA 序列所编码.因此，该单克隆抗体可以由不同的 DNA 序列所编 码，这些序列都属于本发明的内容之内。同时，根据抗体的结构知识，对抗体的氨基酸序列 作一定的

17、改变后，仍能保持抗体的生物学活性，有时氨基酸序列的改变还能增强抗体的生 物学活性或改善原抗体的某些特牲。因此，可以利用基因工程的方法改变该抗体的氨基酸 序列，得到在生化或生物学特性上与原抗体类似或有差别的抗体蛋白质。这些改变了氨基 酸序列的抗体是本发明抗 VEGFR2 抗体的变种，属于本发明的内容之内。0032 在获得了抗体的 DNA 序列后，可以用基因工程的方法生产该单克隆抗体。一般而 言，可以将编码有抗体重链和轻链的 DNA 插入到适当的载体（vector)内。本发明的实例中 以细菌质粒（plasmid)为载体。但其他载体也可以用来表达或生产该单克隆抗体，例如病 毒，DNA片段等。在载体内

18、，编码抗体的 DNA 阅读框位于启动子的下游。启动子驱动抗体阅 读框mRNA 的转录。抗体阅读框包括含有起始密码和终止密码。重链和轻链的 DNA 可以插 入到同一载体中，也可以分别插入到两个独立的载体。0033 带有抗体 DNA 序列的载体可以用适当的方法导入到宿主细胞中，用来表达重组单 克隆抗体。多种细胞可用来作为宿主细胞。然而，由于单克隆抗体含有糖基化的氨基酸，用 哺乳动物细胞表达的抗体具有与自然抗体较似的糖基修饰，因此是比较理想的宿主细胞。 常用的哺乳动物细胞包括中国仓鼠卵巢细胞（CHO)，小鼠骨髓瘤细胞，HEK293 细胞，等等。 除此以外，其他哺乳动物细胞也可用来表达该抗体，因此也包

19、括在本发明的抗体所适用的 宿主细胞范围。同时，也可以用非哺乳动物细胞表达或生产本发明所描述的抗体。适用的5 非哺乳动物细胞包括其他真核生物的细胞，例如植物细胞，昆虫细胞，酵母细胞等任何真核 细胞。适用的非哺乳动物细胞还包括细菌，真菌等任何原核生物的细胞。因此，表达本发明 单克隆抗体的宿主细胞可以是任何真核或原核细胞。将含有抗体序列的载体转入宿主细胞 的方法包括分子生物学中所用的方法。对于质粒来说，常用的方法有电钻孔转染法和脂质 体转染法等。本发明采用电钻孔转染法，但其他许多方法都可以用来达到同样的目的。0034 除了用细胞培养的方法外，还可以用其他方法生产本发明的单克隆抗体。根据生 物技术的知

20、识，单克隆抗体可以用转基因的方法在动物的器官内表达，例如通过转基因在 动物的乳腺，肌肉和卵等表达。此外，该单克隆抗体还可以用转基因的方法在植物的器官表 达，例如转基因植物的叶子等。0035 本发明还提供了该抗体的从细胞培养上请液纯化的初步工艺。纯化后的单克隆抗 体蛋白与制剂辅料相混合，得到最终的单克隆抗体药物。0036 本发明还进一步用实施例揭示了该抗体的生物学活性。0037 有益效果0038 本发明的实验证明该抗体在蛋白质水平上能阻断 VEGF 受体 II 与 VEGF 的结合，在 细胞水平上能抑制血管内皮细胞的增生，因此该抗体具有抑制血管新生的作用，可用于治 疗肿瘤，视网膜病变，老年性黄斑

21、变性等血管新生疾病。具体实施方式0039 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人 员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定 的范围。0040 下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如：分子克隆操作 手册 Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Sambrook, et al. , Cold Spring Harbor Laboratory Press)禾口 Antibodies :A

22、Laboratory Manual, (Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press)，等等，或按照制造厂商所建议的条件。0041 实施例 1.人源抗 VEGFR2 单克隆抗体的制备0042 为了制备全人源抗 VEGFR2 抗体，本发明首先对病人血清用 ELISA 法筛选抗 VEGF 受体 II 抗件阳性的病人。该方法首先用 VEGFR2 重组蛋白质包被 96 孔板，用 2%牛血清白 蛋白封闭，加入浠释的病人血清，再与 HRP 际记的羊抗人抗体反应，并用过氧化物酶底物显 色，用酶标仪读取 OD 值。利用该方法，筛选到

23、了一个抗 VEGF 受体 II 抗件阳牲的病人。取 该病人外周血，用 Ficoll 密度梯度离心法分离外周血单个核细胞（PBMC)，然后将人 PBMC 移 植入 SCID 小鼠。用纯化的 VEGFR2 重组蛋白质对已植入人 PBMC 的 SCID 小鼠进行多次免疫。 用 ELISA 确定小鼠血清内抗 VEGFR2 的含量。待小鼠血清获得高效抗 VEGFR2 滴度后，取小 鼠脾脏，分离脾脏细胞，然后按照杂交瘤技术的常规方法将脾脏细胞与小鼠骨髓细胞相融 合。将融合的细胞在 96 孔板用选择性培养基培养，得到杂交瘤细胞克隆。0043 实例 2.抗 VEGFR2 单抗能有效地与 VEGFR2 结合00

24、44 在获得杂交瘤细胞株后，将杂交瘤细胞用 RPMI-1640 完全培养基培养在 96 孔细胞 培养板。取各杂交瘤细胞株的细胞培养上清液，用 ELISA 法检测特异性抗体。该方法用可溶6 性 VEGFR2 重组蛋白质包被 ELISA 板，2% BSA 封闭，加入杂交瘤细胞培养上清液。清洗后加 入 HRP 标记的羊抗人 IgG 抗体。过氧化物酶底物显色后，用酶标阅读仪在 650 纳米波长读 取 OD 值。用该法筛选到了若干分泌抗 VEGFR2 抗体的杂交瘤细胞株。将分泌抗 VEGFR2特 异性抗体的杂交瘤细胞株在六孔细胞培养板及 T175 培养瓶扩大培养。收集杂交瘤细胞培 养上请液。用 IgG

25、亚型 ELISA 试剂盒 anvitrogen 公司）确定各杂交瘤细胞株分泌抗体的 亚型，以相应亚型的纯化 IgG 作标淮曲线用 ELISA 方法确定细胞培养上请液中抗体的含量。 将各上清液的抗体调节至相同浓度，并进行梯度稀释，用 ELISA 方法比较各单抗与 VEGFR2 的结合能力，确定具高亲和力的抗体克隆。用这一方法，本发明获得若干株对 VEGFR2 具高 亲和力的单克隆抗体克隆。0045 实例 3.抗 VEGFR2 单抗能完全阻断 VEGFR2 与 VEGF 的结合0046 经初筛得到具有高亲和力的抗 VEGFR2 抗体杂交瘤后，本发明进一步确定了这些 抗体对 VEGF 与 VEGFR

26、2 的结合的阻断能力。将 96 孔酶标板用 VEGF 包被，加 BSA 封闭酶标 板。同时，在另一酶标板将待测的单克隆抗体与 VEGFR2 重组蛋白相混合，置 37C 反应 1 小时，将单抗和 VEGFR2 的混合物加入到上述封闭洗涤后的 ELISA 板内。孵育并洗涤后，加 入 HRP 标记山羊抗人 IgG Fe。孵育并洗涤。加入底物液，用酶标阅读仪在 650 纳米波长读 取 OD 值。经此法获得了一株能完全阻断 VEGFR2 与 VEGF 结合的抗 VEGFR2 单克隆抗体克隆 AC88。用人单克隆亚型抗体检测，确定 AC88 抗体是人 IgGl 亚型。0047 实例 4.抗 VEGFR2

27、单抗能完全阻断 VEGF 诱导的 HUVEC 细胞分裂增生0048 为了证明这一新的抗 VEGFR2 单抗的抗血管新生作用，本发明进一步检测了其对 血管内皮细胞增生的作用。人脐静脉血管内皮细胞（HUVEC)是血管新生研究中最常用的体 外细胞培养模形。由于 HUVEC 表面具有 VEGF 受体，HUVEC 细胞可在 VEGF 刺激下发生分裂增 生，因此可以利用这一体外细胞培养模型确定抗体对 VEGF 受体的中和能力。在此实验中， 将 HUVEC 细胞接种于 M 孔细胞培养板，24 小时后，换含有每毫升 5-20ng VEGF 的基础培养 基，加入不同浓度（0. l-5yg/ml)的 AC88 抗

28、体，在 37 摄氏度 10 %的二氧化碳培养箱继续 培养。48 小时后消化细胞并计数。对照组加入不同浓度的正常 IgG。结果显示，在加入了 每毫升 1 微克的抗 VEGFR2 单抗的培养孔中，HUVEC 细胞分裂受到完全抑制，而在加入了同 浓度正常 IgG 的对照组中，HUVEC 细胞分裂没有受到影响。因此，本发明所获得的抗 VEGFR2 单抗能抑制血管内皮细胞的增生，从而能抑制血管的新生。进一步的实验发现克隆 AC88 抗 体对鼠 VEGFR2 无结合能力，因此不宜用小鼠实验评估该抗体在体内的生物学活性。0049 实例 5.抗 VEGFR2 单克隆抗体的基因克隆及重组抗体蛋白质在细胞培养系统

29、中的 表达0050 杂交瘤细胞不适于单克隆抗体的大规模工业化生产。为了表达重组单克隆抗体， 本发明利用分子生物学方法克隆了 AC88 的 DNA 序列。由于抗体的可变区是未知序列，本发 明用cDNA 末端快速扩增法（Rapid amplification ofcDNA ends,RACE)获得重链和轻链的 DNA 序列。取培养的 AC88 杂交瘤细胞，用总 RNA 试剂盒（Promega 公司）提取细胞总 RNA， 再用逆转录酶（BDBiosciences 公司)制备 cDNA。用 PCR 从 AC88 的 cDNA 用 RACE cDNA 扩 增试剂盒（BD Biosciences 公司）扩

30、增抗体重链和轻链的 DNA 序列。PCR 反应的正向引物 来自试剂盒，反向引物为 IgGl 重链恒定区末端序列（SEQ IDNO 幻或 kappa 轻链末端序列 (SEQ ID NO 4)。PCR 反应条件为根据试剂盒说明书设定。PCR 产物经琼脂糖电泳监定。7 然后，将 PCR 产物插入 TA cloning 载体（Invitrogen 公司）。用限制性内切酶消化确定含插 入片断的克隆。所得质粒经 DNA 测序确定插入片断的 DNA 序列，从而获得了 AC88 的重链和 轻链的 DNA 序列。进一步的序列分析显示所获得的抗体重链序列中含有 IgG 可变区和恒定 区，轻链序列含 kappa 轻

31、链的可变区和恒定区。AC88 的重链恒定区序列与人 IgGl 相一致。 将确证后的抗体重链或轻链 DNA 用内切酶消化，分别插入到哺乳动物表达质粒 pcDNA3. 1。 将含有抗体重链或轻链 cDNA 的 pcDNA3. 1 质粒纯化，用 Iipofectamine 试剂盒 Qnvitrogen 公司）将重链和轻链质粒 DNA 共转染入 CHO 细胞，转染后 48-72 小时后用 ELISA 法检测上 清液中抗体的含量。经此法本发明得到了从质粒表达的 AC88 重组抗体，说明 AC88 可用基 因工程的方法生产。0051 实例 6.抗 VEGFR2 单克隆抗体高效表达细胞株的建立0052 为了高