微生物检验基本技能

1、微生物检验基本技能微生物检验基本技能微生物及免疫学科组微生物及免疫学科组内内 容容无菌技术无菌技术安全要求安全要求微生物分离培养（细菌）微生物分离培养（细菌）微生物保藏微生物保藏微生物检验技术微生物检验技术1.形态学检测技术（染色、镜检技术）形态学检测技术（染色、镜检技术）2.培养特征检测技术（计数、生长性状）培养特征检测技术（计数、生长性状）3.基于生理生化特征的检测技术基于生理生化特征的检测技术 4.致病性检测技术致病性检测技术5.药物敏感性检验技术药物敏感性检验技术6.血清学检测技术血清学检测技术 微生物检验技术微生物检验技术7.免疫荧光抗体技术免疫荧光抗体技术8.酶联免疫技术酶联免疫技

2、术9.放射免疫分析技术放射免疫分析技术10.免疫金技术免疫金技术11.抗体芯片技术抗体芯片技术12.复合检测技术复合检测技术 免疫免疫PCR技术技术13. 微生物自动化仪器与检测技术微生物自动化仪器与检测技术 14. 生物传感器检测技术生物传感器检测技术 微生物微生物分子生物学分子生物学检验技术检验技术核酸探针技术，核酸探针技术，PCR技术，技术，环介导等温扩增技术，环介导等温扩增技术，荧光定量荧光定量PCR技术，技术，固相基因芯片技术，固相基因芯片技术，液相基因芯片技术。液相基因芯片技术。一、消毒与灭菌一、消毒与灭菌 消毒消毒(disinfection)：杀死物体上病原微生物的方法，并不一定

3、：杀死物体上病原微生物的方法，并不一定能杀死含芽胞的细菌或非病原微生物。用以消毒的药品称为消毒能杀死含芽胞的细菌或非病原微生物。用以消毒的药品称为消毒剂剂(disinfectant)。 灭菌灭菌(sterilization)：杀灭物体上所有微生物的方法。灭菌比消：杀灭物体上所有微生物的方法。灭菌比消毒要求高，包括杀灭细菌芽胞在内的全部病原微生物和非病原微毒要求高，包括杀灭细菌芽胞在内的全部病原微生物和非病原微生物。生物。 抑菌抑菌(bacteriostasis)：抑制体内或体外细菌的生长繁殖。常用：抑制体内或体外细菌的生长繁殖。常用的抑菌剂为各种抗生素。的抑菌剂为各种抗生素。 防腐防腐(ant

4、isepsis)：防止或抑制体外细菌生长繁殖的方法。细菌：防止或抑制体外细菌生长繁殖的方法。细菌一般不死亡。一般不死亡。 无菌无菌(asepsis)：不存在活菌。：不存在活菌。热力灭菌法热力灭菌法辐射杀菌法辐射杀菌法滤过除菌法滤过除菌法超声波杀菌法超声波杀菌法干燥与低温抑菌法干燥与低温抑菌法物理消毒灭菌法物理消毒灭菌法v干热灭菌法干热灭菌法 焚烧：废弃物、尸体焚烧：废弃物、尸体 灼烧：接种环、试管口灼烧：接种环、试管口 干烤：玻璃器皿干烤：玻璃器皿 红外线：医疗器械红外线：医疗器械v湿热灭菌法湿热灭菌法 巴氏消毒法：巴氏消毒法：61.6-62.8 30min或或71.7 15-30s,主要用于

5、牛乳消毒。主要用于牛乳消毒。 煮沸法煮沸法 流动蒸汽消毒法流动蒸汽消毒法 间歇蒸汽消毒法间歇蒸汽消毒法 高压蒸汽灭菌法高压蒸汽灭菌法 热力灭菌法热力灭菌法 紫外线紫外线 波长波长200-300nm的紫外线具有杀菌作用。的紫外线具有杀菌作用。 其主要作用于其主要作用于DNA，使一条，使一条DNA链上相邻的两个胸腺嘧链上相邻的两个胸腺嘧 啶共价结合形成二聚体，导致细菌变异和死亡。啶共价结合形成二聚体，导致细菌变异和死亡。 电离辐射电离辐射 高速电子、高速电子、X射线、射线、射线射线 微波微波 波长波长1mm1m辐射杀菌法辐射杀菌法v赛氏滤器赛氏滤器v玻璃滤器玻璃滤器v薄膜滤器薄膜滤器滤过除菌法滤过

6、除菌法消毒剂的种类：消毒剂的种类：酚类、醇类、重金属盐类、氧酚类、醇类、重金属盐类、氧化剂、表面活性剂、烷化剂。化剂、表面活性剂、烷化剂。消毒剂的应用：消毒剂的应用：病人排泄物与分泌物、皮肤、病人排泄物与分泌物、皮肤、粘膜、饮水、厕所、空气、手。粘膜、饮水、厕所、空气、手。化学消毒灭菌法化学消毒灭菌法 消毒剂的性质、浓度与作用时间消毒剂的性质、浓度与作用时间 微生物的种类与数量微生物的种类与数量 温度温度 酸碱度酸碱度 有机物有机物影响消毒灭菌效果的因素影响消毒灭菌效果的因素二、二、 培养基培养基(culture medium)培养基：是由人工方法培配置而成的，专供微生培养基：是由人工方法培配

7、置而成的，专供微生物生长繁殖使用的混合营养物制品。物生长繁殖使用的混合营养物制品。 营养物质是微生物生存的物质基础，而营养是微生营养物质是微生物生存的物质基础，而营养是微生物维持和延续其生命形式的一种生理过程。物维持和延续其生命形式的一种生理过程。营养物质营养物质: :能够满足机体生长、繁殖和完成各种生理能够满足机体生长、繁殖和完成各种生理 活动所需要的物质。活动所需要的物质。营养营养: :微生物获得和利用营养物质的过程。微生物获得和利用营养物质的过程。 基本概念基本概念细菌的营养物质细菌的营养物质二二. 细菌的营养物质：细菌的营养物质：水、碳源、氮源、无机盐、生长因子。水、碳源、氮源、无机盐

8、、生长因子。二、营养物质及其生理功能二、营养物质及其生理功能u微生物的营养要求微生物的营养要求碳源碳源氮源氮源能源能源无机盐无机盐生长因子生长因子水水类类型型元素水平元素水平 化合物水平化合物水平 培养基原料水平培养基原料水平有有机机碳碳C CH HO ON NX X复杂蛋白质、核酸等复杂蛋白质、核酸等牛肉膏、蛋白胨、牛肉膏、蛋白胨、 花生饼粉等花生饼粉等C CH HO ON N多数氨基酸、简单蛋白多数氨基酸、简单蛋白质等质等一般氨基酸、明胶等一般氨基酸、明胶等C CH HO O糖、有机酸、醇、脂类糖、有机酸、醇、脂类等等葡萄糖、蔗糖、各种淀粉、葡萄糖、蔗糖、各种淀粉、糖蜜等糖蜜等C CH H

9、烃类烃类天然气、石油及其不同馏份、天然气、石油及其不同馏份、石蜡油等石蜡油等无无机机碳碳C(?)C(?)C CO OCOCO2 2COCO2 2C CO OX XNaHCONaHCO3 3NaHCONaHCO3 3、CaCOCaCO3 3、等、等微生物的碳源谱微生物的碳源谱类类型型 元素水平元素水平化合物水平化合物水平培养基原料水平培养基原料水平有有机机氮氮N NC CH HO OX X复杂蛋白质、核酸等复杂蛋白质、核酸等牛肉膏、酵母膏、饼粕牛肉膏、酵母膏、饼粕粉、蚕蛹粉等粉、蚕蛹粉等N NC CH HO O尿素、一般氨基酸、简单蛋白尿素、一般氨基酸、简单蛋白质等质等尿素、蛋白胨、明胶等尿素、

10、蛋白胨、明胶等无无机机氮氮N NH HNHNH3 3、铵盐等、铵盐等(NH4)(NH4)2 2SOSO4 4等等N NO O硝酸盐等硝酸盐等KNOKNO3 3等等N NN N2 2空气空气微生物的氮源谱微生物的氮源谱u微生物的营养要求微生物的营养要求3.3.能源能源能为微生物的生命活动提供最初能量来源营养物或辐射能能为微生物的生命活动提供最初能量来源营养物或辐射能能源谱能源谱化学物质化学物质辐射能辐射能化能异养微生物的能源化能异养微生物的能源有机物有机物无机物无机物化能自养微生物的能源化能自养微生物的能源光能自养和光能异养微生物的能源光能自养和光能异养微生物的能源u微生物的营养要求微生物的营养

11、要求4.4.生长因子生长因子那些微生物生长所必需而且需要量很小，但微生物那些微生物生长所必需而且需要量很小，但微生物自身不能合成的或合成量不足以满足机体生长需要自身不能合成的或合成量不足以满足机体生长需要的有机化合物的有机化合物 。微微 生生 物物生长因子生长因子需要量（需要量（mlml-1-1）IIIIII型肺炎链球菌型肺炎链球菌胆碱胆碱6ug6ug金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌硫胺素硫胺素0.5ng0.5ng白喉棒杆菌白喉棒杆菌B-B-丙氨酸丙氨酸1.5ug1.5ug破伤风梭状芽孢杆菌破伤风梭状芽孢杆菌尿嘧啶尿嘧啶0-4ug0-4ug肠膜状串珠菌肠膜状串珠菌吡哆醛吡哆醛0.025ug0.02

12、5ugu微生物的营养要求微生物的营养要求5.5.无机盐无机盐为微生物细胞生长提供碳、氮源以外的多种重要为微生物细胞生长提供碳、氮源以外的多种重要元素（包括大量元素和微量元素）的物质，多以元素（包括大量元素和微量元素）的物质，多以无机盐的形式共给。无机盐的形式共给。大量元素：大量元素：P P、S S、K K、MgMg、CaCa、NaNa、Fe Fe （1010-3-31010-4-4mol/Lmol/L）微量元素：微量元素：CuCu、ZnZn、MnMn、MoMo、Co Co （1010-6-61010-8-8mol/Lmol/L） 细胞内一般分子成分（细胞内一般分子成分（P、S、Ca、Ma 、F

13、e等）等） 一般功能一般功能 渗透压的维持（渗透压的维持（Na+等）等） 生理调节物质生理调节物质 酶的激活剂（酶的激活剂（M a2+等）等） 大量元素大量元素 pH的稳定的稳定无无 化能自养菌的能源（化能自养菌的能源（S、Fe2+、NH4+、NO2-等）等）机机 特殊功能特殊功能 盐盐 无氧呼吸时的氢受体（无氧呼吸时的氢受体（NO3-、SO42-等）等） 酶的激活剂（酶的激活剂（Cu2+、Mn2+ 、Zn2+等）等） 微量元素微量元素 特殊分子结构成分（特殊分子结构成分（Co、Mo等）等）无机盐的生理功能无机盐的生理功能u微生物的营养要求微生物的营养要求6.6.水水水的生理功能（PAGE80

14、）起到溶剂与运输介质的作用，营养物质的吸收与代谢产物的分泌必须以水为介质才能完成；参与细胞内一系列化学反应；维持蛋白质、核酸等生物大分子稳定的天然构象；因为水的比热高，是热的良好导体，能有效地吸收代谢过程中产生的热并及时地将热迅速散发出体外，大而有效地控制细胞内温度的变化；通过水合作用与脱水作用控制由多亚基组成的结构，如微管、鞭毛的组装与解离。保持充足的水分是细胞维持自身正常形态的重要因素。 培养基的类型及应用培养基的类型及应用按用途不同划分按用途不同划分基础培养基基础培养基鉴别培养基鉴别培养基含有一般微生物生长繁殖所需的含有一般微生物生长繁殖所需的基本营养物质的培养基基本营养物质的培养基用来

15、将某种或某类微生物从混杂的用来将某种或某类微生物从混杂的微生物群体中分离出来的培养基微生物群体中分离出来的培养基选择培养基选择培养基微生物产生某种代谢产物，与培养微生物产生某种代谢产物，与培养基中的特殊化学物质发生特定的化基中的特殊化学物质发生特定的化学反应，产生明显的特征变化学反应，产生明显的特征变化加富培养基加富培养基特殊营养物质包括血液、血清、酵特殊营养物质包括血液、血清、酵母浸膏、动植物组织液等母浸膏、动植物组织液等按其物理状态分类：固体培养基、液体培养基、半固体培养基。按其物理状态分类：固体培养基、液体培养基、半固体培养基。按其成分分类：合成培养基、天然培养基。按其成分分类：合成培养

16、基、天然培养基。1. 营养物质营养物质2. 氢离子浓度氢离子浓度(pH)3. 温度温度4. 渗透压渗透压5. 气体气体专性需氧菌：具有完善的呼吸酶系统，仅能在有氧环境下生长。专性需氧菌：具有完善的呼吸酶系统，仅能在有氧环境下生长。 微需氧菌：在低氧压（微需氧菌：在低氧压（5%-6%）生长最好。）生长最好。 兼性厌氧菌：兼有有氧呼吸和无氧发酵两种功能，但以有氧时兼性厌氧菌：兼有有氧呼吸和无氧发酵两种功能，但以有氧时 生长较好。大多数病原菌属于此。生长较好。大多数病原菌属于此。 专性厌氧菌：缺乏完善的呼吸酶系统（氧化还原电势高的呼吸专性厌氧菌：缺乏完善的呼吸酶系统（氧化还原电势高的呼吸 酶、分解有

17、毒氧基团的酶），只能在无氧环境中酶、分解有毒氧基团的酶），只能在无氧环境中 进行发酵。进行发酵。细菌的生长的环境因素细菌的生长的环境因素厌氧罐厌氧罐细菌的培养基及性状观察细菌的培养基及性状观察三、细菌的分离培养及性状观察三、细菌的分离培养及性状观察在细菌学检验中，细菌的分离培养是重要的基本技术之一。在细菌学检验中，细菌的分离培养是重要的基本技术之一。从混杂微生物中获得单一菌株纯培养的方法称为分离；从混杂微生物中获得单一菌株纯培养的方法称为分离；纯培养是纯培养是指一株菌种或一个培养物中所有的细菌都是由一个细胞分裂、繁指一株菌种或一个培养物中所有的细菌都是由一个细胞分裂、繁殖而产生的后代。殖而产生

18、的后代。分离培养的目的在于分离培养的目的在于从被检材料中，或者从污染的众多杂从被检材料中，或者从污染的众多杂菌中分离出纯的病原菌菌中分离出纯的病原菌。细菌分离培养应先从被检材料或病料中。细菌分离培养应先从被检材料或病料中分离培养单个菌落，然后钓取可疑菌落进行纯培养，再将纯培养分离培养单个菌落，然后钓取可疑菌落进行纯培养，再将纯培养物移植培养。物移植培养。菌落的形状、边缘和表面构造菌落的形状、边缘和表面构造1.圆形、边缘整齐、表面光滑；圆形、边缘整齐、表面光滑；2圆形、边缘整齐、表面有同心圆圆形、边缘整齐、表面有同心圆；3圆形、叶状边缘、表面有放射状皱褶；圆形、叶状边缘、表面有放射状皱褶；4圆形

19、、锯齿状边缘圆形、锯齿状边缘、表面较不光滑；、表面较不光滑；5不规则形、波浪状边缘、表面有不规则皱纹不规则形、波浪状边缘、表面有不规则皱纹；6圆形、边缘残缺不全、表面呈颗粒状；圆形、边缘残缺不全、表面呈颗粒状；7毛状毛状 ；8根状根状细菌在固体培养基中的生长情况细菌在固体培养基中的生长情况光滑型菌落粗糙型菌落粘液型菌落细菌在固体培养基中的生长情况细菌在固体培养基中的生长情况菌膜菌膜菌沉淀菌沉淀均匀浑浊均匀浑浊对照对照 细菌在液体培养基中的生长情况细菌在液体培养基中的生长情况细菌在半固体培养基中的生长情况细菌在半固体培养基中的生长情况1、3：有动力：有动力2：无动力：无动力细菌的代谢产物细菌的代

20、谢产物（一）分解代谢产物和细菌的生化反应糖发酵试验糖发酵试验VP试验试验甲基红试验甲基红试验枸橼酸盐利用试验枸橼酸盐利用试验吲哚试验吲哚试验硫化氢试验硫化氢试验尿素酶试验尿素酶试验自动化仪器分析自动化仪器分析 不同的细菌不同的细菌 含有不同的分解代谢的酶含有不同的分解代谢的酶 具有不同的分解代谢途径具有不同的分解代谢途径 对同一营养物质的分解代对同一营养物质的分解代谢及其产物有所不同谢及其产物有所不同细菌的代谢产物细菌的代谢产物分解代谢产物和细菌的生化反应分解代谢产物和细菌的生化反应糖糖的的发发酵酵甲基红试验甲基红试验单糖发酵试验单糖发酵试验VP试验试验蛋蛋白白质质的的发发酵酵吲哚试验吲哚试验

21、硫化氢试验硫化氢试验枸橼酸盐利用试验枸橼酸盐利用试验尿素酶试验尿素酶试验其其他他试试验验糖发酵试验糖发酵试验细菌生化鉴定管编码细菌生化鉴定管编码肠杆菌科细菌生化鉴定管肠杆菌科细菌生化鉴定管非发酵细菌生化鉴定管非发酵细菌生化鉴定管弧菌科细菌生化鉴定管弧菌科细菌生化鉴定管奈瑟氏菌细菌生化鉴定管奈瑟氏菌细菌生化鉴定管酵母样真菌糖同化试验鉴定管酵母样真菌糖同化试验鉴定管糖发酵实验糖发酵实验将糖发酵管甩至两端，标记后折断，每组细菌接种将糖发酵管甩至两端，标记后折断，每组细菌接种于两套糖发酵管中，倒立于两套糖发酵管中，倒立37培养培养24h。药敏试验药敏试验药敏试验药敏试验药敏试验药敏试验菌种的保藏与复壮

22、菌种的保藏与复壮 菌种衰退的基本原因是变异，变异是不菌种衰退的基本原因是变异，变异是不可避免的，而减缓变异速度则是可能的。可避免的，而减缓变异速度则是可能的。不良环境条件能促进变异，频繁或过多不良环境条件能促进变异，频繁或过多传代也是造成衰退变异的重要原因。传代也是造成衰退变异的重要原因。为菌种创造良好条件，减缓菌种衰退，为菌种创造良好条件，减缓菌种衰退，这就是菌种保藏与复壮工作。这就是菌种保藏与复壮工作。 一、菌种保藏一、菌种保藏微生物菌种保藏目的是要使菌种性状微生物菌种保藏目的是要使菌种性状保持稳定保持稳定, ,力求把这种衰退现象推迟减缓力求把这种衰退现象推迟减缓到最低限度。到最低限度。菌

23、种保藏菌种保藏菌种保藏有许多的方法，其共同的目标是把菌株菌种保藏有许多的方法，其共同的目标是把菌株的性状保存下来，防止退化、死亡或杂菌污染。的性状保存下来，防止退化、死亡或杂菌污染。保藏是将获得的纯菌种以其休眠和停止生长的条保藏是将获得的纯菌种以其休眠和停止生长的条件下保藏。件下保藏。微生物生长要求适宜的温度、水分、空气和营养微生物生长要求适宜的温度、水分、空气和营养物质等，如将菌种处于物质等，如将菌种处于低温、干燥、无氧和缺乏低温、干燥、无氧和缺乏营养营养的条件下，就可以使菌种暂时处于休眠状态。的条件下，就可以使菌种暂时处于休眠状态。一、菌种保藏一、菌种保藏(一一)低温保藏法低温保藏法 (二

24、二)低温定期移植法低温定期移植法 (三三)石蜡油低温保藏法石蜡油低温保藏法 (四四)干燥保藏干燥保藏 ( (五五) )甘油管保藏法甘油管保藏法 (六六)真空冷冻干燥法真空冷冻干燥法 (七七)液氮超低温保存液氮超低温保存 现行的菌种保藏方法有下列诸种:低温是保藏菌种的重要因素，也是常用的一种简单易行的方法。低温是保藏菌种的重要因素，也是常用的一种简单易行的方法。在作低温保藏时，注意尽量不损伤细胞。在作低温保藏时，注意尽量不损伤细胞。在缓慢冷冻时，胞外基质一般较快结冰而形成冰晶使基质浓度在缓慢冷冻时，胞外基质一般较快结冰而形成冰晶使基质浓度增高，造成细胞水分外渗而大量脱水，可能使细胞死亡。增高，造

25、成细胞水分外渗而大量脱水，可能使细胞死亡。如快速降温，胞内也很快形成冰晶，胞内外渗透压基本平衡，如快速降温，胞内也很快形成冰晶，胞内外渗透压基本平衡，同时胞内冰晶较小，对细胞及原生质膜的损伤也较小，菌株不易死同时胞内冰晶较小，对细胞及原生质膜的损伤也较小，菌株不易死亡，影响也较小。亡，影响也较小。与低温相关的保藏方法，如冷冻干燥法、超低温保藏法等，都与低温相关的保藏方法，如冷冻干燥法、超低温保藏法等，都是利用低温条件下细胞与环境的特殊平衡原理而设计的。是利用低温条件下细胞与环境的特殊平衡原理而设计的。低温保藏菌种低温保藏菌种(一)低温保藏法 这是一种常用的简便方法。这是一种常用的简便方法。放在

26、放在44冰箱内保藏，这种温度条件下不能使菌体进入休眠，而冰箱内保藏，这种温度条件下不能使菌体进入休眠，而仅是抑制微生物的生命活动。因此，保藏时间不宜过长，一般不超仅是抑制微生物的生命活动。因此，保藏时间不宜过长，一般不超过过1 12 2个月为宜。个月为宜。本方法虽然简便，但由于菌株处于较高的水平活性下，这对保本方法虽然简便，但由于菌株处于较高的水平活性下，这对保藏株的性状是不利的，因此，生产菌种一般不采用此法保藏。藏株的性状是不利的，因此，生产菌种一般不采用此法保藏。(二)低温定期移植法 斜面：把培养好的斜面菌种放在低温干燥处保存，定期移植，斜面：把培养好的斜面菌种放在低温干燥处保存，定期移植

27、，一般一般3 36 6个月移植一次个月移植一次( (视菌种特征而定视菌种特征而定) )。穿刺培养定期移植法：保藏细菌效果较好。穿刺培养是将含穿刺培养定期移植法：保藏细菌效果较好。穿刺培养是将含0.60.60.80.8的琼脂培养基装试管灭菌后直立冷凝后，用接种针尖的琼脂培养基装试管灭菌后直立冷凝后，用接种针尖挑取少量菌体，垂直刺入琼脂培养基中心，放在适当温度下培养，挑取少量菌体，垂直刺入琼脂培养基中心，放在适当温度下培养，待菌长好后即可放低温保存，此法较斜面保存有利，大肠杆菌可保待菌长好后即可放低温保存，此法较斜面保存有利，大肠杆菌可保藏藏2 2年以上不发生明显变异。年以上不发生明显变异。(二)

28、低温定期移植法 斜面定期移植与穿刺移植法有其缺陷斜面定期移植与穿刺移植法有其缺陷容易发生容易发生遗传变异遗传变异，连续传代可使一些性状，连续传代可使一些性状丢失或减弱，也易于污染杂菌。因此，一些丢失或减弱，也易于污染杂菌。因此，一些贵重菌株不宜用此法保藏。贵重菌株不宜用此法保藏。(三)石蜡油低温保藏法 原理：是在长好的斜面菌上覆盖灭菌的原理：是在长好的斜面菌上覆盖灭菌的液体石蜡，达到菌体与空气隔绝，使菌处于液体石蜡，达到菌体与空气隔绝，使菌处于生长和代谢停止状态，同时石蜡油还防止水生长和代谢停止状态，同时石蜡油还防止水分蒸发，在低温下达到较长期的保藏菌种的分蒸发，在低温下达到较长期的保藏菌种的

29、目的。保藏温度要求在目的。保藏温度要求在-4-444下。液体石蜡下。液体石蜡法适用于不产孢子的菌种。法适用于不产孢子的菌种。(三)石蜡油低温保藏法具体操作：具体操作：菌种为斜面培养菌种，斜面不宜过长；菌种为斜面培养菌种，斜面不宜过长；选择纯净优质石蜡油，置三角烧瓶中经选择纯净优质石蜡油，置三角烧瓶中经过过121121高压蒸汽灭菌高压蒸汽灭菌1 12h2h，将其放烘箱中，将其放烘箱中(160(160左右左右) )干热处理，去除灭菌时渗入的水干热处理，去除灭菌时渗入的水分；分；待石蜡油变得清澈透明后冷却即可加入待石蜡油变得清澈透明后冷却即可加入斜面，斜面上不能出现气泡，液蜡添加量以斜面，斜面上不能

30、出现气泡，液蜡添加量以高出斜面顶部约高出斜面顶部约1cm1cm左右为宜。左右为宜。(四)干燥保藏 微生物生长需要水分，干燥法是使菌处于干微生物生长需要水分，干燥法是使菌处于干燥条件下停止生长及处于休眠状态，达到较长期燥条件下停止生长及处于休眠状态，达到较长期保藏的目的。保藏的目的。此法是细菌芽孢或产分生孢子的菌种较常用此法是细菌芽孢或产分生孢子的菌种较常用的菌种保藏方法。为了转接方便，控制接种量以的菌种保藏方法。为了转接方便，控制接种量以及对菌种的保护作用，通常将菌种吸附于一些载及对菌种的保护作用，通常将菌种吸附于一些载体表面放至干燥容器里进行常压干燥或真空干燥，体表面放至干燥容器里进行常压干

31、燥或真空干燥，所用载体有沙土、滤纸、硅胶及大所用载体有沙土、滤纸、硅胶及大( (小小) )米等。米等。1.沙土管法 取河取河( (海海) )沙，过沙，过0.78mm(240.78mm(24目目) )筛，用筛，用1010盐酸盐酸浸泡浸泡24h24h，倒去盐酸用清水冲洗至，倒去盐酸用清水冲洗至pHpH呈中性，去呈中性，去水烘干或晒干。取菜园或果园土粉碎过筛，把烘水烘干或晒干。取菜园或果园土粉碎过筛，把烘干的沙土按干的沙土按3 3：2 2或或1 1：1 1混合装入指形管或高混合装入指形管或高100mm100mm，直径为，直径为10mm10mm的小试管中，高约的小试管中，高约1cm(1cm(约约2g)

32、2g)，塞棉塞塞棉塞121121灭菌灭菌1h1h，也可用，也可用1702h1702h干热灭菌干热灭菌( (或蒸汽三次间歇灭菌或蒸汽三次间歇灭菌) )，蒸汽灭菌后需烘干。经，蒸汽灭菌后需烘干。经肉汤检查确实证明无菌即可使用。将要保存的斜肉汤检查确实证明无菌即可使用。将要保存的斜面菌种制成浓悬液面菌种制成浓悬液(106/ml)(106/ml)，用灭菌滴管或吸，用灭菌滴管或吸管吸取悬液滴入无菌沙土上，每管约管吸取悬液滴入无菌沙土上，每管约0.30.30.5ml0.5ml，用接种环将其混合均匀。用接种环将其混合均匀。1.沙土管法将沙土管抽真空干燥。将沙土管抽真空干燥。这时管内砂土松散，表明已干燥。将干

33、燥的这时管内砂土松散，表明已干燥。将干燥的砂土管放置在干燥器或密闭容器内、干燥器下部砂土管放置在干燥器或密闭容器内、干燥器下部放置变色硅胶等干燥剂，于放置变色硅胶等干燥剂，于44下保存。下保存。也可将用接种环从斜面直接挑取放入沙土中，也可将用接种环从斜面直接挑取放入沙土中，混匀后，可以不抽真空直接放干燥器内保存。混匀后，可以不抽真空直接放干燥器内保存。1.沙土管法在沙土保藏初期菌死亡率高，以后逐渐减慢，在沙土保藏初期菌死亡率高，以后逐渐减慢，存活下来的孢子在以后保存期间稳定性较好。存活下来的孢子在以后保存期间稳定性较好。用沙土管保藏的某些菌保藏期可达用沙土管保藏的某些菌保藏期可达1818年到年

34、到2222年，容易产生变异的菌种，就不适合作长期的沙年，容易产生变异的菌种，就不适合作长期的沙土管保存。土管保存。1.沙土管法(五)甘油管保藏法本法也是利用微生物在甘油中生长和代谢受本法也是利用微生物在甘油中生长和代谢受到抑制的原理达到保藏目的。到抑制的原理达到保藏目的。将将80%80%的甘油高压蒸汽灭菌待用。的甘油高压蒸汽灭菌待用。将培养好的斜面菌种用无菌种用无菌水制成将培养好的斜面菌种用无菌种用无菌水制成高浓度的菌悬液高浓度的菌悬液(10(108 810101010/ml)/ml)。取。取1ml1ml灭菌甘油灭菌甘油放入与甘油充分混匀，使甘油浓度约为放入与甘油充分混匀，使甘油浓度约为20-

35、40%20-40%，于于-20-20下冻存。下冻存。(六)真空冷冻干燥法 真空冷冻干燥保藏法是兼具低温、干燥、除真空冷冻干燥保藏法是兼具低温、干燥、除氧三方面菌种保藏的主要因素，对病毒、细菌、氧三方面菌种保藏的主要因素，对病毒、细菌、放线菌、酵母及丝状菌孢子等各类微生物都适用，放线菌、酵母及丝状菌孢子等各类微生物都适用，不宜用冻干法保存的微生物不到不宜用冻干法保存的微生物不到2%2%。冷冻干燥保。冷冻干燥保存的菌种存活时间长、效果好，一般菌种可保存存的菌种存活时间长、效果好，一般菌种可保存5 5年以上，有的可保藏年以上，有的可保藏1515年以上不发生变异。年以上不发生变异。还具有体积小、不易污

36、染、便于运输等优点，还具有体积小、不易污染、便于运输等优点，是一种用得最为广泛的菌种保藏方法。是一种用得最为广泛的菌种保藏方法。(六)真空冷冻干燥法冷冻干燥法是在低温下快速将细胞冻结，然冷冻干燥法是在低温下快速将细胞冻结，然后在真空条件下干燥，使微生物的生长和酶活动后在真空条件下干燥，使微生物的生长和酶活动停止。为了防止在冷冻和水分升华过程中对细胞停止。为了防止在冷冻和水分升华过程中对细胞的损害，要采用保护剂来制备细菌悬液，使菌在的损害，要采用保护剂来制备细菌悬液，使菌在冻结和脱水过程中起到保护作用的溶质，通过氢冻结和脱水过程中起到保护作用的溶质，通过氢键和离子键对水和细胞所产生的亲和力来稳定

37、细键和离子键对水和细胞所产生的亲和力来稳定细胞成分的构型。胞成分的构型。(六)真空冷冻干燥法1.1.冷冻干燥的基本原理冷冻干燥的基本原理 即是使样品中的水分在冰冻状态下，抽真空减压，使即是使样品中的水分在冰冻状态下，抽真空减压，使冻结的冰直接升华为水蒸气，使样品达到干燥。干燥后的冻结的冰直接升华为水蒸气，使样品达到干燥。干燥后的微生物在真空下封装，与空气隔绝，达到长期保藏的目的。微生物在真空下封装，与空气隔绝，达到长期保藏的目的。2.设备设备 冷冻干燥备有不同型号和类型，但都由四个部分组冷冻干燥备有不同型号和类型，但都由四个部分组成：干燥箱、蒸汽捕集器、真空泵、冷冻系统。干燥箱可成：干燥箱、蒸

38、汽捕集器、真空泵、冷冻系统。干燥箱可控制温度范围为控制温度范围为-4040。 (六)真空冷冻干燥法3.操作方法 (1)安瓿管准备 选取规格中性玻璃安瓿管，先用2%盐酸浸泡810h，再经自来水冲洗多次，用蒸馏水涮洗23次，烘干；在每管内放入打好菌号及日期的标签，字面朝向管壁，管口塞好棉塞，灭菌备用。 (六)真空冷冻干燥法(六)真空冷冻干燥法(2)(2)保护剂的选择及制备保护剂的选择及制备 冷冻干燥保藏法使用的保护剂种类很多，列冷冻干燥保藏法使用的保护剂种类很多，列于表于表2-82-8，效果不尽相同，通常采用高分子化合物，效果不尽相同，通常采用高分子化合物与低分子化合物混合使用效果更好。在配制时注

39、与低分子化合物混合使用效果更好。在配制时注意比例、浓度、意比例、浓度、PHPH和灭菌方法。一些对热敏感的和灭菌方法。一些对热敏感的保护剂如血清等用过滤除菌，牛奶、葡萄糖及乳保护剂如血清等用过滤除菌，牛奶、葡萄糖及乳糖等要控制灭菌温度。糖等要控制灭菌温度。一般情况下，多数菌种可以用脱乳为保护剂。一般情况下，多数菌种可以用脱乳为保护剂。(六)真空冷冻干燥法(3)菌种准备及分装菌种准备及分装 菌种要求为生长良好的纯菌种要求为生长良好的纯种，菌龄以处于稳定期为好，孢子是新鲜的。每种，菌龄以处于稳定期为好，孢子是新鲜的。每支长好的斜面加支长好的斜面加23ml保护剂，用接种环将菌苔保护剂，用接种环将菌苔轻

40、轻刮起轻轻刮起(注意勿刮起培养基注意勿刮起培养基)，制成菌悬液。如用，制成菌悬液。如用液体培养的菌种，则需经离心收集和用灭菌生理液体培养的菌种，则需经离心收集和用灭菌生理盐水洗涤细胞，收集的菌体用保护剂悬浮制成菌盐水洗涤细胞，收集的菌体用保护剂悬浮制成菌悬液。悬液中菌数要求达到悬液。悬液中菌数要求达到1081010cfu/ml为宜。为宜。悬液制备完成尽快分装和冻结。分装安瓿时可用悬液制备完成尽快分装和冻结。分装安瓿时可用灭菌的长滴入安瓿管底部，装量可依据冷冻干燥灭菌的长滴入安瓿管底部，装量可依据冷冻干燥机效能而定。机效能而定。 (六)真空冷冻干燥法(4)(4)预冻预冻 分装好的安瓿管需要进行预

41、冻，即放在分装好的安瓿管需要进行预冻，即放在-30-304040下冻结下冻结202060min60min，也可以用干冰和无水乙醇冻，也可以用干冰和无水乙醇冻5 510min10min。(5)(5)冷冻干燥冷冻干燥 经预冻的安瓿放入干燥箱中开始抽真经预冻的安瓿放入干燥箱中开始抽真空干燥。此时干燥箱温度控制在空干燥。此时干燥箱温度控制在-30-30以下，并尽快以下，并尽快使真度达到使真度达到66Pa66Pa以下。此后可还渐升温以加速水分升以下。此后可还渐升温以加速水分升华，但升温不宜过快，以免引起样品融化。干燥时间华，但升温不宜过快，以免引起样品融化。干燥时间视冻干机效率、样品装量及性质等而寂，以

42、样品最终视冻干机效率、样品装量及性质等而寂，以样品最终水分含量达到水分含量达到1%1%3%3%为准。具体操作时是根据冻干样为准。具体操作时是根据冻干样品呈酥块工松散片状；真空度接近空载时最高真空；品呈酥块工松散片状；真空度接近空载时最高真空；样品温度与管外温度接近。样品温度与管外温度接近。干燥完毕将安瓿管在真干燥完毕将安瓿管在真空下用火焰烧熔密封，并用高频真空检测真空度。空下用火焰烧熔密封，并用高频真空检测真空度。(六)真空冷冻干燥法(6)(6)保藏及冻干管的启用保藏及冻干管的启用 密封好的冻干管在密封好的冻干管在44或或-18-18下保藏。当需用冻干菌种时，取出安下保藏。当需用冻干菌种时，取出安瓿管用酒精表面消毒，用小砂轮在无菌条件下打瓿管用酒精表面消毒，用小砂轮在无菌条件下打开，或将安瓿顶部在酒精灯火焰上灼烧，迅速滴开，或将安瓿顶部在酒精灯火焰上灼烧，迅速滴上冷的无菌水，使管破裂，然后用镊子等轻轻敲上冷的无菌水，使管破裂，然后用镊子等轻轻敲碎管口，加入碎管口，加入0.30.30.