第八章 催化水解反应的金属酶.

1、第八章第八章第一节第一节 概概 述述第二节第二节 羧羧 肽肽 酶酶第三节第三节 碳碳 酸酸 酐酐 酶酶根据酶催化反应的类型，把酶分为六类根据酶催化反应的类型，把酶分为六类 ：氧化还原酶类氧化还原酶类 催化氧化还原反应催化氧化还原反应转移酶类转移酶类 催化功能基团转移反应催化功能基团转移反应裂解酶类裂解酶类 催化从底物移去一个基团而留下催化从底物移去一个基团而留下双键的反应或其逆反应双键的反应或其逆反应异构酶类异构酶类 催化异构体互相转变催化异构体互相转变合成酶类合成酶类 催化双分子合成一种新物质同时催化双分子合成一种新物质同时使使ATP分解的反应分解的反应水解酶类水解酶类 催化水解反应催化水解

2、反应第一节第一节 概述概述 一、水解酶一、水解酶 六大酶类之中研究的最多并应用最广泛的六大酶类之中研究的最多并应用最广泛的一类，其中有不少水解酶的活性与金属离子一类，其中有不少水解酶的活性与金属离子有关。有关。 后页表中列出若干水解金属酶和金属离子激后页表中列出若干水解金属酶和金属离子激活酶。活酶。 金属离子激活酶是指必须加入金属离子才具金属离子激活酶是指必须加入金属离子才具有活性的酶。有活性的酶。水解酶根据水解酶根据水解键的类型水解键的类型不同分为六个亚类。不同分为六个亚类。 酯酶酯酶 作用于酯键，使其水解为酸和醇作用于酯键，使其水解为酸和醇 糖苷酶糖苷酶 作用于糖基化合物，使糖键水解作用于

3、糖基化合物，使糖键水解 醚酶醚酶 作用于醚键，使其水解作用于醚键，使其水解 肽酶肽酶 作用于肽键，使其水解作用于肽键，使其水解 C-NC-N酶酶 作用于其它作用于其它C-NC-N键键 酸酐酶酸酐酶 作用于酸酐作用于酸酐本章仅对本章仅对肽酶肽酶及及酯酶酯酶作一些介绍作一些介绍 肽酶肽酶催化蛋白质的肽键水解催化蛋白质的肽键水解蛋白质为高分子物质，不能透过细胞膜，必须蛋白质为高分子物质，不能透过细胞膜，必须水解成小分子才能被肠吸收。蛋白质由各种肽水解成小分子才能被肠吸收。蛋白质由各种肽酶催化，水解成小分子，被肠吸收。酶催化，水解成小分子，被肠吸收。肽酶肽酶肽链端解酶肽链端解酶肽链内切酶（蛋白酶）肽链

4、内切酶（蛋白酶）氨肽酶氨肽酶羧肽酶羧肽酶嗜热菌嗜热菌蛋白酶蛋白酶 根据作用方式，肽酶又分为根据作用方式，肽酶又分为肽链端解酶肽链端解酶和和肽链肽链内切酶内切酶。肽链端解酶肽链端解酶从肽链羧基末端和氨基末从肽链羧基末端和氨基末端切下氨基酸，前者称端切下氨基酸，前者称羧肽酶羧肽酶，后者称，后者称氨肽酶氨肽酶。 内切酶内切酶是另一类肽酶，用于切断蛋白质分子内是另一类肽酶，用于切断蛋白质分子内部肽键使之变成小分子多肽，如嗜热菌蛋白酶。部肽键使之变成小分子多肽，如嗜热菌蛋白酶。 酯酶酯酶催化酯键水解，其中催化酯键水解，其中羧酸酯酶羧酸酯酶催化羧酸催化羧酸酯水解酯水解RCOOR + H2O RCOOH +

5、 ROH磷酸酯酶磷酸酯酶催化磷酸酯键水解催化磷酸酯键水解 O O ROPOR + H2O RO POH +ROH | | OH OHR=H时，磷酸单酯酶（如：碱性磷酸酯酶）时，磷酸单酯酶（如：碱性磷酸酯酶）磷酸二酯酶（如：磷脂酶磷酸二酯酶（如：磷脂酶C) 水解金属酶之中很多都与水解金属酶之中很多都与Zn2+有关。有关。 其次：其次：Ca2+、Mg2+，还有少数酶含，还有少数酶含Mn2+ 由于水解过程不发生电子转移，所以金属由于水解过程不发生电子转移，所以金属离子的氧化态在催化过程中不变化。离子的氧化态在催化过程中不变化。二、水解金属酶研究中的过渡金属离子二、水解金属酶研究中的过渡金属离子 EP

6、R、Mssbauerssbauer、d-dd-d电子光谱电子光谱金属酶存金属酶存在某种过渡金属在某种过渡金属。 ZnZn2+2+,Ca,Ca2+2+,Mg,Mg2+2+等离子不具有未充满的等离子不具有未充满的d d轨道，轨道，因此含有因此含有ZnZn2+2+,Ca,Ca2+2+,Mg,Mg2+2+等离子的金属酶就难以等离子的金属酶就难以应用上述检测技术获得有用信息。应用上述检测技术获得有用信息。 为了深入研究金属酶的性质，通常采用探针。为了深入研究金属酶的性质，通常采用探针。一般采用一般采用CoCo2+2+代替代替ZnZn2+2+，用，用MnMn2+2+代替代替MgMg2+2+。非过。非过渡金

7、属渡金属TlTl+ +作为作为K K+ +的的NMRNMR探针。探针。 使用探针离子遵循的原则：使用探针离子遵循的原则：同晶置换同晶置换，即，即探针离子在酶分子中占据原有金属离子所探针离子在酶分子中占据原有金属离子所在的同一位置。在的同一位置。 电子构型、离子半径、配位几何构型。电子构型、离子半径、配位几何构型。 很关键问题：是否能继续保持酶分子的生很关键问题：是否能继续保持酶分子的生物活性。物活性。 金属配位键的强弱对于决定反应的途径也金属配位键的强弱对于决定反应的途径也很重要，而这种配位键的强度可随金属不很重要，而这种配位键的强度可随金属不同而变化。同而变化。 Zn2+的电子结构：的电子结

8、构：d10，在可见区没有吸收。，在可见区没有吸收。在羧肽酶研究中采用在羧肽酶研究中采用Mn2+，Fe2+，Co2+，Ni2+，Cu2+，Rh3+，Cd2+，Pd2+等离子取代。等离子取代。 Co2+取代的羧肽酶取代的羧肽酶A对肽键的水解具有很强的对肽键的水解具有很强的活性。活性。 Co2+羧肽酶羧肽酶A的吸收光谱与经典的四面体配位的吸收光谱与经典的四面体配位的钴配合物很不同，而且摩尔消光系数很大，的钴配合物很不同，而且摩尔消光系数很大，这是由于金属处在畸变四面体配位引起的；这是由于金属处在畸变四面体配位引起的；圆二色谱、磁圆二色谱和低温圆二色谱、磁圆二色谱和低温EPR谱的结果谱的结果证实这一点

9、。证实这一点。 证明锌酶中的证明锌酶中的Zn2+处于畸变四面体配位状态。处于畸变四面体配位状态。 碳酸酐酶研究中，钴酶活性是锌酶活性的碳酸酐酶研究中，钴酶活性是锌酶活性的50%，而，而Ni2+，Mn2+，Fe2+酶仅稍具活性，酶仅稍具活性，其它惰性。其它惰性。 Co2+取代酶大都能在不同程度上保持酶的取代酶大都能在不同程度上保持酶的催化活性。催化活性。 电子结构、离子半径、配位几何构型。电子结构、离子半径、配位几何构型。 Co2+配合物有多种几何构型，高自旋配合物有多种几何构型，高自旋Co(II)配合物优先采取四面体结构。配合物优先采取四面体结构。 四面体场中，高自旋四面体场中，高自旋Co2+

10、的电子组态为的电子组态为e4t23，相当于，相当于Zn2+的的d10组态的球对称结构。组态的球对称结构。 采用采用Co2+作为探针，就能提供锌酶的金属作为探针，就能提供锌酶的金属结合部位结构的有用信息。结合部位结构的有用信息。第二节第二节 羧肽酶羧肽酶 羧肽酶是催化肽链的羧肽酶是催化肽链的C-末端氨基酸残基水解的末端氨基酸残基水解的酶。酶。 第一个被发现的锌酶第一个被发现的锌酶 第一个被发现的金属酶第一个被发现的金属酶 动力学、结构、光谱最清楚的水解酶动力学、结构、光谱最清楚的水解酶 羧肽酶分类：羧肽酶分类： 金属酶，存在于胰液中，细胞外酶，帮助蛋白金属酶，存在于胰液中，细胞外酶，帮助蛋白质消

11、化，中性或弱碱性显示极大的活性质消化，中性或弱碱性显示极大的活性 非金属酶（酵母羧肽酶非金属酶（酵母羧肽酶C），细胞内酶，在酸），细胞内酶，在酸性条件下具有很大活性。性条件下具有很大活性。一、羧肽酶一、羧肽酶A1.组成、结构与功能组成、结构与功能（1）组成：）组成：存在哺乳动物胰脏中，相对分存在哺乳动物胰脏中，相对分子质量子质量3460034600， Zn2+作为辅基，单一多肽作为辅基，单一多肽链，约链，约300个氨基酸残基。个氨基酸残基。研究比较多的是牛的羧肽酶研究比较多的是牛的羧肽酶A。 羧肽酶原羧肽酶原A A在胰蛋白酶作用下，一个肽键断在胰蛋白酶作用下，一个肽键断裂，释放出大约裂，释放出

12、大约6060个氨基酸残基的个氨基酸残基的N-N-末端末端裂解物。在不同条件下，可以产生裂解物。在不同条件下，可以产生4 4种不同种不同羧肽酶羧肽酶A A：307; 305; 300;300307; 305; 300;300动物体内羧肽酶原A二聚体或三聚体，无活性胰蛋白酶激活60个氨基酸残基-N末端裂解物肽键断裂不同条件下,四种不同的羧肽酶307，305，300，300通常说的羧肽酶通常说的羧肽酶A就是羧肽酶就是羧肽酶A (2)结构：椭球形，羧肽酶结构：椭球形，羧肽酶A() 大约一半的氨大约一半的氨基酸形成基酸形成-螺旋结构或螺旋结构或-折叠结构。折叠结构。 其余其余氨基酸氨基酸无确定模式，相对

13、容易变形，与无确定模式，相对容易变形，与底物结合相联系的构象变化主要在这些容易底物结合相联系的构象变化主要在这些容易变形的部分发生。变形的部分发生。 酶分子中部一狭长的空腔，底物结合位置。酶分子中部一狭长的空腔，底物结合位置。 底物的底物的C C末端沿这条沟槽伸入到酶分子内末端沿这条沟槽伸入到酶分子内的活性部位，空腔中还有一定数量的水分子，的活性部位，空腔中还有一定数量的水分子， Zn2+就处于这条空腔的内表面，它是维持就处于这条空腔的内表面，它是维持羧羧肽酶肽酶A活性所必须的组分。活性所必须的组分。 Zn2+与多肽链的两个组氨酸（与多肽链的两个组氨酸（69,196）的咪唑）的咪唑基氮原子，以

14、及谷氨酸（基氮原子，以及谷氨酸（72）的羧基氧原子以）的羧基氧原子以配位键结合，配位键结合，Zn2+第配位为水。第配位为水。Zn2+处于畸变四面体配位处于畸变四面体配位状态中。状态中。 3功能：功能： 催化蛋白质或多肽的羧基末端肽键的水解反应。催化蛋白质或多肽的羧基末端肽键的水解反应。除了脯氨酸之外，羧肽酶能不同程度的催化具有除了脯氨酸之外，羧肽酶能不同程度的催化具有各种各种C-末端氨基酸的肽链水解。末端氨基酸的肽链水解。 底物的底物的C-末端侧链为芳基或分支较大的脂基羧肽末端侧链为芳基或分支较大的脂基羧肽酶显示出很强的活性。酶显示出很强的活性。 NHCHCONHCHCOO- + H2O |

15、| R2 R1 NHCHCOOH + NH2CHCOO- | | R2 R12.肽水解的催化机理肽水解的催化机理 （1）活性部位）活性部位 早期的蛋白链化学修饰法已经确定羧肽酶的早期的蛋白链化学修饰法已经确定羧肽酶的活性部位。活性部位。 Zn2+除与组氨酸（除与组氨酸（His-69)、-196，以及，以及Glu-72形成直接参与催化作用的活性部位外，形成直接参与催化作用的活性部位外，还包括还包括Arg-145，Tyr-248和和Glu-270，它们，它们的侧联基团也是直接与底物结合的部位。的侧联基团也是直接与底物结合的部位。 当上述氨基酸与其他物质作用而被化学修饰当上述氨基酸与其他物质作用而被

16、化学修饰时，酶失去活性时，酶失去活性 （2）锌）锌-羰基机理羰基机理 主要特征：底物的主要特征：底物的C-末末端肽键的羰基通过锌的配位作用而极化，端肽键的羰基通过锌的配位作用而极化，极化羰基的碳原子由于亲核反应发生水解极化羰基的碳原子由于亲核反应发生水解作用。作用。 第一步：第一步：Arg-145的胍基和底物的带负电荷的胍基和底物的带负电荷的的C-末端羧基相互吸引。末端羧基相互吸引。 第二步：底物酪氨酸残基的芳基侧链进入第二步：底物酪氨酸残基的芳基侧链进入酶的非极性口袋形空腔中挤走酶的非极性口袋形空腔中挤走4H2O。 第三步第三步:底物敏感肽键的底物敏感肽键的-NH-基上的氮原子基上的氮原子与

17、酶的与酶的Tyr-248的的-OH以氢键连结。以氢键连结。 第四步：底物肽键上的羰基挤走了水分子第四步：底物肽键上的羰基挤走了水分子而与锌配位，锌使羰基极化以致碳原子容而与锌配位，锌使羰基极化以致碳原子容易接受亲核进攻。易接受亲核进攻。 第五步：底物末端的羰基碳原子通过一个第五步：底物末端的羰基碳原子通过一个插入的水分子与酶的谷氨酸插入的水分子与酶的谷氨酸Glu-270的侧链的侧链以氢键连结。但最后这一步不一定发生。以氢键连结。但最后这一步不一定发生。 羧肽酶与甘氨酰胺结合的过程，必须通过羧肽酶与甘氨酰胺结合的过程，必须通过活性中心的重排，特别是酶分子的构象的活性中心的重排，特别是酶分子的构象

18、的重大改变才能实现。重大改变才能实现。 Arg-145 和和 Glu-270移动移动0.2nm，Arg的位的位移带动了肽链的扭转，使移带动了肽链的扭转，使Tyr-248移动了移动了1.2nm。 诱导诱导喫喫合状态合状态：酶分子构象改变，配位键、：酶分子构象改变，配位键、范德华力、静电吸引力和氢键等作用力，使范德华力、静电吸引力和氢键等作用力，使酶分子与底物在空间和电荷上都很匹配，因酶分子与底物在空间和电荷上都很匹配，因而处于而处于喫喫合状态。合状态。 羧肽酶与甘氨酰胺结合正是酶的羧肽酶与甘氨酰胺结合正是酶的诱导诱导喫喫合状合状态的范例。态的范例。 酶分子构象改变和各种相互作用力使底物肽酶分子构

19、象改变和各种相互作用力使底物肽键处于张力状体下，因此，反应活化能大大键处于张力状体下，因此，反应活化能大大降低。降低。 酶与底物结合后进一步反应的步骤有两种不酶与底物结合后进一步反应的步骤有两种不同的观点。同的观点。 第一种：第一种：Glu-270激活了水分子，提高了水激活了水分子，提高了水分子的氧的亲核能力，向底物肽健羰基的碳分子的氧的亲核能力，向底物肽健羰基的碳原子进攻，原子进攻，Glu-270羰基质子化，羰基质子化，Tyr-248也也提供一个质子，肽键断裂，底物分解。提供一个质子，肽键断裂，底物分解。第二种：第二种： 锌的作用：锌的作用： 在锌在锌-羰基机理中起了使肽键产生张力的作羰基机

20、理中起了使肽键产生张力的作 用，从而促进了底物的水解。由于用，从而促进了底物的水解。由于Zn2+的的作用，底物肽键的羰基碳原子的电子云密作用，底物肽键的羰基碳原子的电子云密度降低而呈正电性，因此羰基碳原子更容度降低而呈正电性，因此羰基碳原子更容易接受亲核进攻。易接受亲核进攻。 底物末端羧基与底物末端羧基与Arg-145带正电的胍基连带正电的胍基连结，触发了结，触发了Tyr-248大幅度位移，酶显示活大幅度位移，酶显示活性。由此可见：酶与底物的诱导性。由此可见：酶与底物的诱导喫喫合是一合是一个互相识别的动态过程。这个过程发生活个互相识别的动态过程。这个过程发生活性中心重排，使底物有可能被酶的功能

21、基性中心重排，使底物有可能被酶的功能基包围而发生催化。包围而发生催化。第三节：碳酸酐酶第三节：碳酸酐酶 广泛存在动物、植物和某些微生物体内。广泛存在动物、植物和某些微生物体内。 可逆催化二氧化碳的水合作用，还能催化可逆催化二氧化碳的水合作用，还能催化醛类水合作用和某些脂的水解。醛类水合作用和某些脂的水解。 碳酸酐酶分含碳酸酐酶分含ZnZn2+2+酶和不含酶和不含ZnZn2+2+酶。酶。 锌酶锌酶，红细胞中仅次于血红蛋白。，红细胞中仅次于血红蛋白。一、组成、结构、功能一、组成、结构、功能 相对分子量约相对分子量约30000，单一肽链，每个分子，单一肽链，每个分子含一个含一个Zn2+，260个氨基酸残基，脯氨酸含个氨基酸残基，脯氨酸含量较高，没有二硫键。量较高，没有二硫键。 通常碳酸酐酶指碳酸酐酶通常碳酸酐酶指碳酸酐酶B。 椭球形，