微生物的营养生长与死亡问题

1、主 讲 惠 明 博士现代微生物学第第4 4章章 微生物的营养微生物的营养生长生长 与死亡问题与死亡问题第一节 微生物的营养问题微生物的营养素微生物的营养类型营养物质的输送微生物培养基问题（略）一、 微生物的营养需求 q 微生物活细胞是个新陈代谢动力系统，它要活下去，就必须不断从环境中吸收营养物质，通过物质代谢和能量代谢，以实现生长和繁殖，同时向环境排出“废物”。微生物的这种物质交换对工业发酵至关重要。q 营养素营养素（nutrients）：指微生物在生命活动中从环境中吸取的用以提供能量、调节代谢及合成细胞物质（甚至包括发酵产物）的原材料。这些营养物质必须能直接地或经降解后可以跨膜进入细胞。o

2、营养营养(过程)nutrition：微生物吸收和利用营养物质的过程。 5营养素的分析o 可把营养物质大致分为元素营养和能源营养 元素营养中研究得最透彻的是碳源，能源营养可以是化学物质，也可以是非化学物质如光能。o 一般把为模块分子（building block）生物合成提供碳骨架（carbon skeletons）的基质，通常称为碳源；而为生命活动提供吉布斯自由能（其中只有一部分能被微生物细胞转化成代谢能）和还原力的基质称为能源。o 元素营养和元素代谢在细胞生理的研究中仍具有重要地位。举例：P、Mn、Se（大骨节病）8种常量元素的一些生理功能及生长需求量元素生理功能生长需求量mol/L）CNH

3、OSPKMg细胞有机物质的组成部分，常作能源蛋白质、核酸和辅酶的组成部分组成细胞的有机物质和水组成细胞的有机物质和水，有氧呼吸蛋白质和某些辅酶的组分核酸、磷脂、核苷酸和某些辅酶组分细胞中主要的无机阳离子、某些酶的辅助因子许多酶、叶绿素（光合微生物）的辅助因子，存在于细胞壁和细胞膜10-210-3-10-410-410-310-410-310-410-3这个8种常量元素组成了细菌和真菌干重的98%（平均值）营养元素o 元素营养以C 、O 、H、N 含量最多（占细胞干重的90%95%），这4种元素具有共同的化学性质是：可通过共享电子（共有电子对）而迅速形成共价键。o 单纯由C 和 H 组成的生物分

4、子呈非极性，与水亲和力低，使生物体与水环境之间形成一定的界面，这是生命诞生和存在的必要条件。o O、N、S等的参与引起有机分子电荷分布不均匀，使分子出现极性，能与水分子形成氢键而表现亲水性。N参加主链结构可改善大分子的机械性能，O、S、P等可在有机分子间或分子内形成桥式连接，影响分子的形状和性能。 8元素组成： C、H、O、N、P、S、K、Na、Ca、Mg、Fe、Mn、Cu、Co、Zn、Mo（大体16种）。其中C、H、O、N、P占细胞干重的97%。物质组成: 水：约占细胞湿重的90%。 有机物：蛋白质、碳水化合物、脂类、核酸、维生素以及它们的合成中间体和降解物。 无机盐：参与有机物组成及单独存

5、在于细胞原生质内的无机盐等灰分物质中的元素。微生物细胞的化学组成微生物细胞的化学组成影响微生物细胞化学组成的因素微生物的种类：硫细菌、铁细菌、海洋细菌含有较多的S、Fe、Cl和Na。菌龄：幼龄菌中含氮量较高。培养条件：在氮源丰富的环境中生长的微生物含氮量较高。 （培养富Se酵母、灵芝等）一些微生物细胞的元素组成部分发酵产品的元素组成部分发酵产品的元素组成红霉素头孢霉素二、二、 微生物的营养类型微生物的营养类型 一般根据碳源营养将微生物分为：一般根据碳源营养将微生物分为：异养型微生物和自养型异养型微生物和自养型微生物。微生物。前者从前者从有机化合物有机化合物中获取组成细胞的碳（中获取组成细胞的碳

6、（所有的所有的真菌、多数细菌及原生动物真菌、多数细菌及原生动物），后者从），后者从COCO2 2中中获取碳（获取碳（COCO2 2的固定，的固定，藻类和几种细菌藻类和几种细菌），也有兼养型微生物。），也有兼养型微生物。A A 微生物营养类型的分类（一）分类标准营养类型能 源光能营养型 phototroph化能营养型 chemotroph（无机、有机）氢供体无机营养型 lithotroph有机营养型 organotroph分类标准营养类型碳 源（同化作用）自养型autotroph（碳架物质由细胞自身从CO2还原生成）异养型heterotroph（碳架物质从其它有机物供给） 异化作用需氧型/厌氧型

7、 生长因子原养型(prototroph)/野生型(wild type)营养缺陷型auxotroph 合成氨基酸能力氨基酸自养型amino acid autotroph氨基酸异养型amino acid heterotroph 取食方式渗透营养型osmotroph吞噬营养型phagotroph 取得死或活有机物腐生saproghytism寄生parasitismB B 微生物营养类型的分类（二）C 微生物的营养类型（三）营养类型能源氢供体 基本碳源实例光能无机自养型（PLA）光无机物CO2紫硫细菌、绿硫细菌、藻类光能有机异养型（POH）光有机物CO2及简单有机物红螺细菌化能无机自养型（CLA）无机

8、物无机物CO2硝化细菌、硫化细菌化能有机异养型（COH）有机物有机物有机物绝大多数细菌和全部真核微生物15o 细菌、放线菌、酵母菌、霉菌没有专门的摄食和排泄“器官”，各种化学物质进出细胞主要依赖于细胞质膜细胞质膜的功能。尽管细胞壁对物质进入细胞有一定的障碍。（G+细胞壁能阻止10000Da的葡聚糖，真菌只允许分子质量相对较小的化合物通过细胞壁）o 注意：存在于水相中的化学物质如何跨过疏存在于水相中的化学物质如何跨过疏水的膜？这些化合物如何克服浓度梯度向高水的膜？这些化合物如何克服浓度梯度向高浓度运输？浓度运输？三、营养物质的跨膜输送三、营养物质的跨膜输送微生物是通过细胞膜的渗透和选择吸收作用而

9、从外界吸取营养物质的。被动吸收 简单扩散 （顺浓度梯度） 促进扩散 （借助载体，不耗能）主动吸收 主动运输 （耗能，借助载体） 基团移位 （耗能，借助载体，结构有变化）原生动物膜泡运输营养物质的跨膜输送基本类型营养物质的跨膜输送基本类型17A 简单扩散简单扩散 simple diffusion无载体蛋白参与下，单纯依靠物理扩散方式输送营养物质。特点特点： 输送动力：浓度梯度 输送方向：顺浓度梯度 输送物质：一些非极性小分子如：O2、N2、苯等 一些不带电荷但显极性的小分子如：水、尿素、NH3、甘油、CO2、脂肪酸和某些醇等18B 促进扩散促进扩散 facilitated diffusion在特

10、异性载体蛋白的协助下，不消耗能量的一类扩散性运输方式。普遍存在于真核生物，原核生物中仅有几例。特点： 输送动力：浓度梯度 输送方向：顺浓度梯度 载体蛋白：需要，具有特异性 输送物质：真核微生物对许多糖类的吸收、大肠杆菌对甘油的吸收真核微生物对许多糖类的吸收、大肠杆菌对甘油的吸收及运动发酵单胞菌和牛链球菌对葡萄糖的吸收。及运动发酵单胞菌和牛链球菌对葡萄糖的吸收。 输送机制：被输送的物质与相应的载体之间存在一种亲和力。一些细菌通常有不同的载体蛋白分别来完成AA、糖、维生素和无机盐等物质的运输。思考：载体思考：载体-蛋白质蛋白质-诱变诱变-输送增强或削弱输送增强或削弱涉及物质转运的一些载体多样性o

11、主要促进超家族（major facilitator superfamily）o 核苷和核苷酸转运家族o 革兰氏阴性细菌糖特异孔结构家族22C 主动运输主动运输 active transport 在消耗能量的同时，实现溶质在细胞内的浓缩，而且跨膜前后没有任何化学变化发生的输送机制。特点： 输送动力：代谢能量 输送方向：逆浓度梯度（由低到高） 载体蛋白：需要，具有特异性 输送物质：氨基酸、某些糖、Na、K 等。 输送机制：代谢能量改变底物与载体之间的结合力。2324D 基团移位基团移位 group translocation被输送的基质分子在膜内经受了共价的改变， 以被修饰的形式进入细胞质的输送机

12、制（需要载体、代谢能、酶）。特点： 输送动力：代谢能量, PEP上的高能磷酸键 输送方向：逆浓度梯度 载体蛋白：磷酸转移酶系统 被输送物质在输送前后的存在状态：在细胞膜内被磷酸化o 输送机制：磷酸转移酶系统（PTS） 酶：非特异性，存在于细胞质中 酶：特异性(诱导型)，存在于膜上 因子：特异性，存在于细胞质中 HPr(组氨酸蛋白质/热稳定蛋白质)：非特异性，存在于细胞质中葡萄糖的跨膜输送葡萄糖的跨膜输送26E 膜泡运输膜泡运输 Membrane vesicle transport通过趋化性运动靠近营养物质，将它吸附到膜表面，形成膜泡，并进入细胞质。胞吞作用：颗粒物质胞饮作用：活细胞不靠渗透性而

13、靠膜的凸或凹摄取溶液状态物质的现象。四种物质运输方式的比较四种物质运输方式的比较29F 真核微生物细胞内化学物质的跨膜输送o 不带电的分子包括极性和非极性小分子容易透过线粒体内膜如：水、氧、二氧化碳、氨、甲酸、乙酸、丙酸、丁酸等o 带电的分子或离子需借助载体通过线粒体内膜如：磷酸盐、硫酸盐、ADP、ATP、PYR、TCA环中的有机酸、Glu、Asp、Orn（鸟氨酸）、Cit（瓜氨酸）、酰基肉碱、PEP等o NAD（P）+/NADPH、NADH、CoA和酰基CoA不能跨过线粒体内膜30G 代谢中间产物排出细胞的机制o 氨基酸的释出 微生物细胞内氨基酸库（AA pool)内存在最多的氨基酸是谷氨酸

14、。近年来的研究表明：谷氨酸棒杆菌中Glu、Lys、Ile及Thr的释出以及大肠杆菌中Glu、Thr的释出都是借助载体的输送过程。但即使借助载体输送，膜脂质双层分子结构的组成及分子排列的紧密程度仍会影响到Glu的排出。谷氨酸的吸收是主动运输过程。o 核苷酸的释出借助于细胞形态的改变（Mn+）o 胞外酶的释出是由信号肽决定，分泌蛋白被连接上一段分泌载体（信号肽），将酶定位在膜外。o 如何构建这种“信号肽”载体？有利于某些酶的分泌32如何促进特定物质的输入和输出？（或吸收和分泌）物质输送与工业生产的相关性（营养物质的吸收和发酵产物的合成与分泌） 能量的来源（ATP、膜电位） 主动输送-耗能代谢生长产

15、物合成工业生产思考与讨论 之一 物质输送问题33加入解偶联剂 如：2,4-二硝基苯酚 破坏质膜内外的质子梯度，使一些物质不能输送，能量问题？加入电子传递链抑制剂 如：KCN CN-与Fe+形成络合物破坏细胞色素加入能量转移抑制剂 如：寡酶素 阻塞ATP酶的“质子井”，使能量合成受阻竞争及饱和效应 推测输送过程有载体参与营养物输送前后性质变化-泡囊试验 推测输送过程有酶参与思考与讨论之二营养物质的输送机制探讨34一般的载体是蛋白质，具有蛋白质的一切属性。载体与酶是有区别的（前者不发生共价变化）载体有天然的，由DNA编码，经转录、翻译产生，可用遗传手段修饰。载体是可调控的（可诱导产生、活性可调）载

16、体可人工构建（诸如：洁霉素、短杆菌肽）细胞物质运输及代谢中有哪些载体呢？5 思考与讨论之三 物质输送的载体问题第二节 微生物的生长问题生长：个体体积的增大及细胞原生质总量的增加。繁殖：个体数量的增多。群体生长：包含了个体生长和繁殖休眠与死亡oMicrobial growth curve in a closed system36一、微生物个体细胞的生长A 细菌的生长与繁殖B 丝状菌的生长与繁殖 曲霉菌分生孢子形成的过程二、微生物生长的测定A 直接计数法显微计数法酵母菌、霉菌孢子：血球计数器细菌：Petroff-Hausser或 Helber计数器 B 电子自动计数法 Coulter电子计数器电子

17、计数器可测定细胞数、细胞大小分布。 细胞呼吸熵、活化能、氧化还原电位40C 间接计数法间接计数法薄膜过滤计数法薄膜过滤计数法 微孔滤膜如硝化纤维素薄膜 适用：量大、含菌浓度低的样品平板菌落计数法平板菌落计数法 适用：单细胞或单孢子菌悬液 方法：倾注平板、涂布平板 CFU：colony-forming unit42 MPN( Most probable number) 将样品作10倍系列稀释，接种液体试管，培养后记录出现生长的试管数，查表并计算。例：某一细菌在稀释法中的 生长情况如下 稀释度 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8 重复数 5 5 5 5 5 生长管数 5 5 4 1

18、0 数量指标“541”，查统计分配表 原菌液中的活菌数=1.7106 个/dLD 液体稀释法（或然率法）液体稀释法（或然率法）43E 其他方法测定细胞物质的量测定细胞物质的量测定细胞干重法比浊法测定细胞总含氮量法 霉菌菌丝长度的测定霉菌菌丝长度的测定 菌落直径测定法： U型管测定法：比浊法比浊法45三、微生物群体生长规律三、微生物群体生长规律A 细菌生长曲线growth curve 将少量细菌接种到一恒定容积的新鲜液体培养基中，在适宜条件下培养，定时取样测定细胞密度（CFU），以活细胞数的对数对培养时间所作出的曲线称为生长曲线。细菌群体生长曲线细菌群体生长曲线 471 延迟期（lag phas

19、e 调整期）活细胞数：基本不变细胞生理特点：分裂迟缓、代谢活跃出现的原因：调整代谢，适应新环境影响因素：菌种的遗传性；种龄；接种量； 培养基组分及培养条件缩短措施：扩大接种量，保持培养基成分的一致性482 对数期 log phase/exponential phase活细胞数：呈几何级数增加细胞的生理特点： 细胞生长速率最大； 细胞进行平衡生长； 酶系活跃，代谢旺盛在最适条件下几种微生物的世代时间503 平衡期平衡期 stationary phase活细胞数：动态平衡出现原因：营养物质的消耗 ；有生理毒性代谢产物的积累 ；环境条件（pH, 氧化还原电位）的改变对细胞生长不利 细胞生理特点：分裂

20、速度降低；活细胞数达到最大值；开始积累储藏物质；积累发酵产物；芽孢细菌产生芽孢514 衰亡期衰亡期 decline phase/death phase活细胞数：逐渐下降细胞生理特点： 细胞内颗粒更加明显，出现液泡 细胞出现异常形态 细胞死亡伴随自溶B 真菌的生长曲线真菌的生长曲线酵母菌的生长曲线：与细菌相似丝状真菌的生长曲线 三个时期 各期特征生长停滞期 孢子萌发前的时期迅速生长期 菌丝伸长及分枝衰退期 菌丝体干重下降 伴随自溶葡萄糖和乳糖共存时大肠杆菌的二次生长曲线麦芽糖和蔗糖共存时酿酒酵母的二次生长曲线C 多种碳源及复合培养基存在下多种碳源及复合培养基存在下 的微生物的生长的微生物的生长四

21、四 微生物的培养微生物的培养A 分批培养分批培养 batch culture 将微生物置于一定容积的培养基中，经过培养生长，最后一次收获的培养方法。摇瓶培养发酵罐培养B补料分批培养补料分批培养 适用对象： 底物对菌体生长或产物形成具有抑制作用方法： 阶段式补料 连续补料-流加发酵 56C 连续培养连续培养 continuous culture 当微生物以分批培养的方式培养到对数期后，向培养器中不断补充新鲜营养物质，并以同样速度排出培养物，使微生物的增殖速度及培养基中的总菌量保持不变的培养方法。分批培养与连续培养的关系58连续培养装置连续培养装置59恒浊连续培养恒浊连续培养概念：不断调节流速而使

22、培养液的浊度(菌体密度)保持恒定的连续培养方法反应器：恒浊器（turbidostat）目的：不断提供具有一定生理状态的细胞， 得到以最高生长速率进行生长的培养物。应用：获得大量的菌体 获得与菌体生长相平衡的代谢产物。 60连续发酵的应用 连续发酵的优点 提高设备利用率 便于自动化控制 产品质量较稳定 节省人力、物力，水、电、气负荷均衡连续发酵的缺点 菌种易退化 易污染杂菌 营养物质利用率低于分批发酵61D 同步培养物同步培养物 synchronous culture 在同一时刻，所有的细胞都处于细胞周期中在同一时刻，所有的细胞都处于细胞周期中的同一阶段的培养物叫同步培养物的同一阶段的培养物叫同

23、步培养物。 Synchronous culture is a form of culture on which all the cells path through the same stage of the cell cycle at the same time。 用途：种子液、诱变育种、细胞融合、生理试验62机械法：依据处于不同生长阶段的细胞的大小不同 密度梯度离心分离法 过滤分离法 调整生理条件的同步法诱导法 温度调整法 ：亚适温度 /最适温度 营养条件调整法：营养丰富培养基/无N培养基用最高稳定期细胞接种 诱导芽孢或孢子萌发 抑制DNA合成 抑制蛋白质合成获得同步培养物的方法获得同步培

24、养物的方法63A A 细胞的生长和产物的得率细胞的生长和产物的得率得率系数：表示消耗单位重量的营养物质所形成的细胞量或产物的数量。碳源消耗： 细胞合成、产物合成、细胞维持乙醇发酵： 葡萄糖理论转化率：2mol乙醇/mol葡萄糖 实际转化率：90%95%菌体生长与发酵产物生成64发酵产物的类型及其发酵特点 偶联型、 部分偶联型、非偶联型划分的依据： 发酵产物形成的速度和菌体生长速度之间的关系。 B 营养消耗及产物形成65代谢产物的积累与菌体生长平行 产物生成的速率为： dp/dt = mX/Yp/c 产物生成的比速率： qp= dp/Xdt = m/Yp/c 式中Yp/c：每克细胞的产物克数（g

25、产物/g细胞） 产物 菌体类：酵母、蘑菇菌丝、苏云金杆菌 糖类厌氧发酵：酒精发酵 （1）与生长偶联的产物的生物合成）与生长偶联的产物的生物合成偶联型发酵67发酵特点：菌体生长一段时间后产物才开始合成，合成速率与生长速率有一段平行期，生长速率减低或停止后产物继续较快合成。 产物生成速率为: dp/dt = adX/dt + bX 产物生成的比速率： qp = am + b （2）与生长部分偶联的产物的生物合成）与生长部分偶联的产物的生物合成部分偶联型发酵69发酵特点：菌体生长速度减低或停止后产物较快合成产物生成的速率： dp/dt = bX产物生成的比速率： qp= b 次级代谢产物的合成 大多

26、数抗生素、微生物毒素（3） 不与生长偶联的产物的生物合成不与生长偶联的产物的生物合成非偶联型发酵71四、细胞的衰老与死亡o 细胞增殖能力减弱的现象称为细胞衰老1.1.衰老细胞结构变化 细胞核随分裂次数增加而增大，核膜呈现内折，染色质固缩化。 内质网弥散性分散于核周胞质中，粗面内质网减少。 线粒体减少，体积膨胀。 膜流动性降低，膜内颗粒分布变化。 细胞骨架变化，信号传递系统变化。E. ashbyii T30 的菌丝形态变化的菌丝形态变化2.细胞死亡 细胞坏死：机械损伤、毒物毒害. 质膜、核膜破裂，胞质溢出。 细胞凋亡：主动的、由基因决定的自动结束细胞生命的过程。 生物学意义：根据需要调节细胞数量坏死细胞坏死细胞凋亡细胞凋亡细胞74五、芽孢五、芽孢 endospore/ spore（1）定义）定义 某些细菌在其生长发育后期,在细胞内形成一个圆形或椭圆形，壁厚、含水量极低、抗逆性极强的休眠体休眠体。（2）着生情况）着生情况 菌种菌种 在细胞中的位置在细胞中的位置 形状形状 大小大小 显微镜下芽孢 电镜下的芽孢 （3）特点）特点o组成特点组成特点 含水量低含水量