第四章 蛋白质的生物合成.

1、DNARNA前体前体成熟成熟mRNAmRNA蛋白质蛋白质转录转录加工加工运输运输翻译翻译细胞核细胞质细胞质细胞核细胞核mRNA5AUCGACCUGAGC3420 ()42=1620 ()43=6420 ()mRNA5AUCGACCUGAGC3mRNA5AUCGACCUGAGC3mRNA5UUUUUUUUUUUU3多肽多肽NPhe-Phe-Phe-PheC 1961年年Crick及其同事提供了确切的证据，证及其同事提供了确切的证据，证明三联体密码子学说是正确的。他们研究了明三联体密码子学说是正确的。他们研究了T4噬噬菌体菌体位点位点A和和B两个顺反子变异的影响，这两两个顺反子变异的影响，这两个基

2、因与个基因与噬菌体能否感染大肠杆菌噬菌体能否感染大肠杆菌K株有关。实株有关。实验结果见后：验结果见后： Crick等的实验结果表明三联体密码是非重叠等的实验结果表明三联体密码是非重叠的，而且连续编码无标点符号隔开。的，而且连续编码无标点符号隔开。 CAT CAT CAT CAT CAT CAT 正常正常 -1 CAT CAC ATC ATC ATC ATC 缺陷缺陷 -1+1 CAT CAC AXT CAT CAT CAT 正常正常 +3 CAX TXC ATX CAT CAT CAT 正常正常 此实验表明密码子是三联体。此实验表明密码子是三联体。 缺少一个碱基缺少一个碱基 X 增加一个碱增加

3、一个碱 基基1961年，美国科学家年，美国科学家M.W.Nirenberg等人等人,在大肠杆菌的在大肠杆菌的无细胞体系中外加无细胞体系中外加poly(U)模板、模板、20种标记的氨基酸，经种标记的氨基酸，经保温后得到了多聚保温后得到了多聚phe-phe-phe，于是推测，于是推测UUU编码编码phe。利用同样的方法得到。利用同样的方法得到CCC编码编码pro，GGG编码编码gly，AAA编码编码lys。 细菌（大肠杆菌）无细胞系统、动物无核细胞系细菌（大肠杆菌）无细胞系统、动物无核细胞系统、网织红细胞裂解系统和麦胚系统等。只要加统、网织红细胞裂解系统和麦胚系统等。只要加入外源入外源mRNAmR

4、NA模板，则可进行体外翻译。模板，则可进行体外翻译。用于蛋白质生物合成研究的体外翻译系统主要有：用于蛋白质生物合成研究的体外翻译系统主要有：mRNA5UUUUUUUUUUUU3多肽多肽NPhe-Phe-Phe-PheC（1）以多聚二核苷酸作模板可合成由以多聚二核苷酸作模板可合成由2个氨基个氨基酸组成的多肽酸组成的多肽 ,如以如以Poly UG 为模板，合成产物为模板，合成产物为为Poly Lys-Val。UGU GUG UGU GUG UGU UGU GUG UGU（2）以多聚三核苷酸作为模板，可得三种氨以多聚三核苷酸作为模板，可得三种氨 基酸组成的多肽。基酸组成的多肽。AAG AAG AAG

5、 AAG AAG AAG AAG (Lys)nA AGA AGA AGA AGA AGA AG (Arg)nAA GAA GAA GAA GAA GAA GAA GAA GAA G (Glu)n 1964年年Nirenberg发现，用人工合成的发现，用人工合成的三核三核苷酸苷酸取代取代mRNA，在没有，在没有GTP时，不能合成蛋白时，不能合成蛋白质，质，但三核苷酸却能与其对应的氨酰但三核苷酸却能与其对应的氨酰tRNA一起一起结合在核糖体上。结合在核糖体上。将此反应混合物通过硝酸纤维将此反应混合物通过硝酸纤维素膜过滤，核糖体和三核苷酸以及特异结合的氨素膜过滤，核糖体和三核苷酸以及特异结合的氨酰酰

6、tRNA形成的复合物能留在膜上。用此方法，形成的复合物能留在膜上。用此方法，可以直接测定三核苷酸与氨基酸的对应关系。可以直接测定三核苷酸与氨基酸的对应关系。目前只发现线粒体和叶绿体内有列外情况，目前只发现线粒体和叶绿体内有列外情况，这也是转基因的前提。但要注意的是不同生物这也是转基因的前提。但要注意的是不同生物往往偏爱某一种密码子。往往偏爱某一种密码子。 akesu583d TGTCCAACAAGGACCCGCGCCTGAACGAGGGAGTTGTCCTGGATGAGGTC3d_18-6_pPIC9 TGTCCAACAAGGACCCACGACTGAACGAGGGAGTTGTCCTGGATGAG

7、GTC脯氨酸脯氨酸精氨酸精氨酸编码一个编码一个肽链的所有密码子是一个接着一个地线形排列，肽链的所有密码子是一个接着一个地线形排列，密码子之间既不重叠也不间隔，从起始密码子到密码子之间既不重叠也不间隔，从起始密码子到终止密码子（不包括终止子）构成一个完整的读终止密码子（不包括终止子）构成一个完整的读码框架，又称码框架，又称开放阅读框架（开放阅读框架（ORF）。如果在阅读框中插入或删除一个碱基就会使其后如果在阅读框中插入或删除一个碱基就会使其后的读码发生移位性错误（称为移码）。的读码发生移位性错误（称为移码）。ATGmRNA5AUUAUUAUCAUCAUAAUA3UAIUAIIleIle5UAIU

8、AIIleIle5UAIUAIIleIle5tRNA33353tRNA 原核原核mRNA多顺反子多顺反子 SD序列序列：在起始密码子：在起始密码子AUG上游的上游的913个核苷酸处有一个核苷酸处有一段可受核糖体结合、保护和富含嘌呤的共同序列，一般为段可受核糖体结合、保护和富含嘌呤的共同序列，一般为AGGA，称，称SD序列。序列。 作用：与核糖体小亚基作用：与核糖体小亚基16S rRNA 3端结合，使端结合，使mRNA与与核糖体结合。（核糖体结合。（ mRNA与与30S亚基结合，并正确定位）亚基结合，并正确定位）翻译起始识别翻译起始识别原核mRNA 5端序列5 3 顺反子顺反子顺反子顺反子顺反子

9、顺反子插入顺序插入顺序插入顺序插入顺序先导区先导区末端顺序末端顺序AGGAGGUSD区区一些细菌和病毒一些细菌和病毒mRNA中中S.D顺序比较顺序比较 真核真核mRNA的的 5端结构端结构 没有没有SD序列序列 mRNA 5m7GpppN，3poly（A）对翻译效率的调节有协同）对翻译效率的调节有协同作用。作用。 5端的二级结构对端的二级结构对mRNA的翻译效率也有影响；的翻译效率也有影响； 原核生物和真核生物mRNA结构的比较 Initiation in prokaryotes and eukaryotes initiation can occur at internal AUG codon

10、s in prokaryotic mRNA initiation in eukaryotes occurs only at the first AUG codon lac operon in E. coli is transcribed as a polycistronic mRNA with multiple AUG codons eukaryotic mRNAlac IPOlac Zlac Ylac AAUGAUGAUGAUGSDAUGSDAUGinitiation codon with Shine-Dalgarno siteinitiation codon with Shine-Dalg

11、arno siteinternal Met codon does not have Shine-Dalgarno site5 5 capAUGinitiation can only occur at first AUG codon downstream of the 5 capAUGinternal (downstream) Met codon cannot serve as an initiation siteAUG 功能功能： 1、专一性识别氨基酸专一性识别氨基酸，形成形成氨基酰氨基酰-tRNA ，运输，运输AA。 2、识别密码子识别密码子,解读解读mRNA的遗传信息的遗传信息 。 tRN

12、A的功能区：的功能区：氨基酸臂：与氨基酸结合氨基酸臂：与氨基酸结合DHU环（环（D环）：与氨酰环）：与氨酰tRNA合合成酶结合成酶结合反密码子环：识别密码子反密码子环：识别密码子TC环：与核蛋白体结合环：与核蛋白体结合tRNA的种类的种类（2）同工）同工tRNA 代表同一种氨基酸的代表同一种氨基酸的tRNA称为同工称为同工tRNA，由于一种氨基酸可能有多个密码子，为了识别也就有多个由于一种氨基酸可能有多个密码子，为了识别也就有多个tRNA，即同工即同工tRNA。同工。同工tRNA既要有不同的反密码子以识别该氨基酸既要有不同的反密码子以识别该氨基酸的各种同义密码，的各种同义密码，又要有某种结构上

13、的共同性，能被又要有某种结构上的共同性，能被AA- tRNA合成酶识别合成酶识别。（3）校正）校正tRNA 无义突变：无义突变：在蛋白质的结构基因中，一个核苷酸的改变可能使在蛋白质的结构基因中，一个核苷酸的改变可能使代表某个氨基酸的密码子变成终止密码子（代表某个氨基酸的密码子变成终止密码子（UAG、UGA、UAA），使蛋白质合成提前终止，合成无功能的或无意义的多肽，），使蛋白质合成提前终止，合成无功能的或无意义的多肽，这种突变就称为无义突变。这种突变就称为无义突变。错义突变：错义突变：由于结构基因中某个核苷酸的变化使一种核苷酸的密由于结构基因中某个核苷酸的变化使一种核苷酸的密码子变成另一种氨基

14、酸的密码。码子变成另一种氨基酸的密码。而无意突变和错义突变的校正而无意突变和错义突变的校正tRNA可通过改变反密码子区校正可通过改变反密码子区校正无意突变和错义突变。无意突变和错义突变。校正校正tRNA分为无义突变及错义突变校正。分为无义突变及错义突变校正。28S rRNA18S rRNA原核生物核糖体的组成：原核生物核糖体的组成： 真核生物核糖体组成真核生物核糖体组成 Ribosome structure AP PPPPPPPP-site peptidyl tRNA siteA-site aminoacyl tRNA sitemRNA5 Small subunitLarge subunitR

15、ibosome with bound tRNAs and mRNA参与蛋白质合成的蛋白因子参与蛋白质合成的蛋白因子 EFTU（ GTPase） （ GTPase） EFT EF1 原原 核核 EFTS 真真 核核 EFG（ 转转 位位 酶酶 ） EF2（ 转转 位位 酶酶 ） 原核生物释放因子：原核生物释放因子：RF-1，RF-2，RF-3 真核生物释放因子：真核生物释放因子：eRF EF-TuEF-TsEF-GIF-3IF-2原核中没有亚基结合因子原核中没有亚基结合因子只有一种只有一种a. 核蛋白体大小亚基分离；核蛋白体大小亚基分离；b. mRNA在小亚基定位结合；在小亚基定位结合；c. 起

16、始氨基酰起始氨基酰-tRNA的结合；的结合； d. 核蛋白体大亚基结合。核蛋白体大亚基结合。多肽链合成的起始多肽链合成的起始（1）原核生物翻译起始复合物形成）原核生物翻译起始复合物形成IF-3IF-1 a. 核蛋白体大、小亚基分离：核蛋白体大、小亚基分离：IF-1和和IF-3与小亚基结合，促进核蛋白体大、小亚与小亚基结合，促进核蛋白体大、小亚基拆离，为新一轮合成作准备。基拆离，为新一轮合成作准备。A U G53IF-3IF-1 b. mRNA在小亚基的精确定位结合在小亚基的精确定位结合 在起始因子在起始因子IF3的促进下，的促进下，30S小亚基通过小亚基通过SD序列与序列与mRNA的起始部位结

17、合；的起始部位结合； IF-2GTPc. 起始氨基酰起始氨基酰tRNA( fMet-tRNAimet )结合到小亚基结合到小亚基IF-3IF-1A U G53 起始起始 fMet-tRNAimet以及以及IF2-GTP一起，识别一起，识别结合小亚基结合小亚基P位，并对应模板位，并对应模板mRNA的起始密码的起始密码AUG。IF-3IF-1IF-2-GTP-GDPPi d. 核蛋白体大亚基结合，起始复合体形成：核蛋白体大亚基结合，起始复合体形成：A U G53 IF2结合的结合的GTP被水解，三种被水解，三种IF脱离，脱离，50S大大亚基与亚基与30S小亚基、模板小亚基、模板mRNA以及起始以及

18、起始fMet-tRNAifMet构成起始复合体。构成起始复合体。IF-3结合到结合到30S亚基上，形成稳定的游离亚基，亚基上，形成稳定的游离亚基， 使使30S亚基特异的结合于亚基特异的结合于mRNA的起始位点的起始位点形成形成IF-2GTP fMet-tRNAfMet 复合物复合物IF-2GTP fMet-tRNAfMet结合到结合到30S亚基上，识别亚基上，识别 AUG，IF-2，3释放，释放，50S亚基结合，形成完整的核糖体亚基结合，形成完整的核糖体合成起始：合成起始：起始因子参与小亚基与大亚基的结合起始因子参与小亚基与大亚基的结合多肽链合成的起始多肽链合成的起始进位进位肽键形成肽键形成脱

19、落和移位脱落和移位生成起始复合物，第一个氨基生成起始复合物，第一个氨基酸（酸（fMet/Met-tRNA）与核糖）与核糖体结合以后，肽链开始延伸。体结合以后，肽链开始延伸。EF-Tu首先与首先与GTP结合，然后再结合，然后再与氨基酰与氨基酰tRNA结合成三元复合结合成三元复合物，这样的三元复合物才能进物，这样的三元复合物才能进入入A位。此时位。此时GTP水解成水解成GDP，EF-Tu和和GDP与结合在与结合在A位上的位上的氨基酰氨基酰tRNA分离（图）。分离（图）。EF-Tu-GDP在延伸因子在延伸因子EF-Ts的的催化下，形成催化下，形成EF-Tu. GTP复合复合物，进入新一轮的循环。物，

20、进入新一轮的循环。EF-Tu首先与首先与GTP结合，然后再结合，然后再与氨基酰与氨基酰tRNA结合成三元复合结合成三元复合物，这样的三元复合物才能进物，这样的三元复合物才能进入入A位。此时位。此时GTP水解成水解成GDP，EF-Tu和和GDP与结合在与结合在A位上的位上的氨基酰氨基酰tRNA分离（图）。分离（图）。EF-Tu-GDP在延伸因子在延伸因子EF-Ts的的催化下，形成催化下，形成EF-Tu. GTP复合复合物，进入新一轮的循环。物，进入新一轮的循环。Ts循环循环 （TuTs 循环）循环） 循环过程：循环过程： EFTuGDPEF-TsEFTuEF-TsGTP 取代取代EFTu-GTP

21、Tu TsGTPGDPA U G53TuTsGTP目目 录录为什么为什么 氨基酰氨基酰tRNA 与与EF-Tu以及以及GTP结合，形成三元复结合，形成三元复合物才能进入合物才能进入A位。而位。而进位进位肽键形成肽键形成脱落和移位脱落和移位肽键的生成肽键的生成氨基酰氨基酰tRNA上氨基上氨基酸的氨基对肽酰酸的氨基对肽酰tRNA上酯键的羰基上酯键的羰基作亲核攻击。作亲核攻击。进位进位肽键形成肽键形成脱落和移位脱落和移位转肽作用发生后，氨基转肽作用发生后，氨基酸都位于酸都位于A位，位，P位上无负荷氨基酸的位上无负荷氨基酸的tRNA就此脱落，核蛋白体沿着就此脱落，核蛋白体沿着mRNA向向3端方向移动一

22、组密码子，使得肽酰端方向移动一组密码子，使得肽酰tRNA从从A位进入位进入P位，而位，而A位空出，可位空出，可以接受下一个新的氨基酰以接受下一个新的氨基酰tRNA进入，进入，移位过程需要移位过程需要EF-G(移位酶移位酶)，GTP和和Mg2+的参加。的参加。 以后，以后，肽链上每增加一个氨基肽链上每增加一个氨基酸残基，即重复上述进位，转肽，酸残基，即重复上述进位，转肽，移位的步骤，移位的步骤，直至所需的长度，实直至所需的长度，实验证明验证明mRNA上的信息阅读是从上的信息阅读是从5端向端向3端进行，而肽链的延伸是从端进行，而肽链的延伸是从氮基端到羧基端。所以多肽链合成氮基端到羧基端。所以多肽链

23、合成的方向是的方向是N端到端到C端。端。肽酰肽酰-tRNA的肽酰基转移到的肽酰基转移到aa-tRNA上形成肽键上形成肽键Tu+Ts Tu Ts Tu GTPGTPaa-tRNA进入核糖体进入核糖体A位点位点Tu GDPEF-G GTP 核糖体沿核糖体沿mRNA向前移动一个密码子，向前移动一个密码子， 使肽酰使肽酰-tRNA由由A位移动到位移动到P位位A位空缺，准备接受下一个位空缺，准备接受下一个aa-RNA肽酰转移酶肽酰转移酶进位进位当当mRNA上终止密码出现后，上终止密码出现后，多肽链合成停止，肽链从肽酰多肽链合成停止，肽链从肽酰-tRNA中释出，中释出，mRNA、核蛋白体、核蛋白体等分离，

24、这些过程称为肽链合成终等分离，这些过程称为肽链合成终止。止。终止相关的蛋白因子称为释放因子终止相关的蛋白因子称为释放因子 (release factor, RF) 一是识别终止密码，如一是识别终止密码，如RF-1特异识别特异识别UAA、UAG；而；而RF-2可识别可识别UAA、UGA。二是诱导转肽酶改变为酯酶活性，相当于催化二是诱导转肽酶改变为酯酶活性，相当于催化肽酰基转移到水分子肽酰基转移到水分子-OH上，使肽链从核蛋上，使肽链从核蛋白体上释放。白体上释放。 释放因子的功能释放因子的功能原核生物释放因子：原核生物释放因子：RF-1，RF-2，RF-3 真核生物释放因子：真核生物释放因子：eR

25、F 多肽链合成的终止过程多肽链合成的终止过程 U A G53RFCOO-进进位位转转位位成肽成肽核蛋白体循环的反应总过程核蛋白体循环的反应总过程在氨基酸的掺人过程中有4个重复的延伸反应 脱落进位转肽移位原核生物的转录翻译同步进行多聚核糖体的电镜照片真核生物蛋白质合成真核生物蛋白质合成 特点：特点： 1. 比原核需要更多的蛋白因子比原核需要更多的蛋白因子; 2. 40S亚基先与起始亚基先与起始tRNA结合结合, 再与再与 mRNA结合结合; 3. mRNA5帽子结构和帽子结构和3端的多聚端的多聚A都参与都参与形成起始复合物形成起始复合物.polyA结合蛋白真核生物蛋白质合成起始的扫描模式真核生物

26、蛋白质合成起始的扫描模式 40S小亚基对小亚基对mRNA上起始密码子上起始密码子AUG的识别的识别4、80S复合物复合物:40S小亚基在移动到起始小亚基在移动到起始密码子密码子AUG后，通过后，通过eIF-5的作用，可使的作用，可使结合结合Met-RNAfmetGTP及及mRNA的的40S小小亚基与亚基与60S大亚基结合，形成大亚基结合，形成80S复合物。复合物。真核蛋白质合成起始模式真核蛋白质合成起始模式三元复合物三元复合物延伸：延伸：aa-tRNA结合于核糖体结合于核糖体A位点位点eEF-1 eEF-2(转位酶转位酶) 核糖体沿核糖体沿mRNA向前移动，向前移动，A位空缺位空缺延长：仅延长

27、因子与原核生物不同 eEF-1：相当于EF-Tu eEF-1： 相当于EF-Ts eEF-2： 相当于EF-G。肽酰转移酶肽酰转移酶肽酰肽酰-tRNA的肽酰基转移到的肽酰基转移到aa-tRNA上形成肽键上形成肽键终止：终止：mRNA上的终止密码子出现于上的终止密码子出现于A位时，位时， 无相应的无相应的aa-tRNA与之结合与之结合eRF识别终止信号，结合于识别终止信号，结合于A位位tRNA与肽链间的酯键水解，多肽释放与肽链间的酯键水解，多肽释放 核糖体从核糖体从mRNA上解离上解离GTP肽酰转移酶肽酰转移酶(变为水解酶变为水解酶)eRF结合核糖体、结合结合核糖体、结合GTP、介导肽酰、介导肽

28、酰-tRNA水解、水解、 GTP水解酶等活性。水解酶等活性。终止：仅一种释放因子 ，可识别3 种密码子（UAA、UAG、UGA），并需GTP。四、蛋白质合成的抑制剂四、蛋白质合成的抑制剂许多抗生素都是以直接抑制细菌细胞内蛋许多抗生素都是以直接抑制细菌细胞内蛋白质合成而对人体副作用最小为目的而设计的，白质合成而对人体副作用最小为目的而设计的，它们可作用于蛋白质合成的各个环节，包括抑它们可作用于蛋白质合成的各个环节，包括抑制起始因子，延长因子及核糖核蛋白体的作用制起始因子，延长因子及核糖核蛋白体的作用等等。这些抑制剂不仅对于研究蛋白质的合成等等。这些抑制剂不仅对于研究蛋白质的合成机制十分重要，也是

29、临床上治疗细菌感染的重机制十分重要，也是临床上治疗细菌感染的重要药物。要药物。1、链霉素、卡那霉素、新霉素等：抑制、链霉素、卡那霉素、新霉素等：抑制70S起始复合物的形成，使氨基酰起始复合物的形成，使氨基酰tRNA从复从复合物中脱落；干扰合物中脱落；干扰fMet-tRNA与核糖体的与核糖体的结合，从而阻止蛋白质合成的正确起始，也会结合，从而阻止蛋白质合成的正确起始，也会导致导致mRNA的错读。的错读。许多新合成的肽链要切除非功能段（如信号肽、C肽）才具有活性。胰岛素、血纤维蛋白、胰蛋白酶等。前胰岛素原的加工前胰岛素原的加工六、蛋白质运转机制六、蛋白质运转机制不论是原核还是真核生物，在细胞浆内合成的蛋白质需定位于细胞特