荧光分光光度法测定多维葡萄糖粉中维生素B2的含量

1、仪器分析实验报告张林41207056陕西师范大学仪器分析实验报告姓名：张林学号：41207056专业：化学实验日期：2014.9.28 室温：23班级：化二荧光分光光度法测定多维葡萄糖粉中维生素B2的含量指导教师：李保新一 实验目的1. 学习荧光分光光度法测定多维葡萄糖粉中维生素B2的分析原理。2. 掌握荧光分光光度计的操作技术和测定多维葡萄糖粉中维生素B2 的方法。二实验原理荧光分析法：常温下，处于基态的分子吸收一定的紫外可见光的辐射能成为激发态分子，激发态分子通过无辐射跃迁至第一激发态的最低振动能级，再以辐射跃迁的形式回到基态，发出比吸收光波长长的光而产生荧光。在稀溶液中，荧光强度IF与物

2、质的浓度c有以下的关系：当实验条件一定时，荧光强度与荧光物质的浓度成线性关系：这是荧光光谱法定量分析的理论依据。荧光光谱：激发光谱：固定测量波长(选最大发射波长)，化合物发射的荧光强度与照射光波长的关系曲线。激发光谱曲线的最高处，处于激发态的分子最多，荧光强度最大。发射光谱：固定激发光波长(选最大激发波长), 化合物发射的荧光强度与发射光波长关系曲线。固定发射光波长进行激发光波长扫描，找出最大激发光波长，然后固定激发光波长进行荧光发射波长扫描，找出最大荧光发射波长。激发光波长和发射荧光波长的选择是本实验的关键。荧光分析法的特点：a. 与紫外-可见分光度法比较，荧光分析法具有更高的灵敏度。b.

3、选择性好。荧光法既能依据发射光谱，又能依据吸收光谱来鉴定物质。c. 所需试样量少、操作方法简便。荧光分析仪器常用的荧光分析仪器由激发光源、单色器、液槽、检测器和显示记录器五部分构成，如下图所示：维生素B2（又叫核黄素，VB2）是橘黄色无臭的针状结晶，其结构式为：维生素B2易溶于水而不溶于乙醚等有机溶剂，在中性或酸性溶液中稳定，光照易分解，对热稳定。1.维生素B2溶液在430440 nm蓝光的照射下，发出绿色荧光，其峰值波长为525 nm。VB2的荧光在pH=67时最强，在pH=11时消失。维生素B2在碱性溶液中经光线照射会发生分解而转化为光黄素，光黄素的荧光比核黄素的荧光强的多，故测VB2的荧

4、光时溶液要控制在酸性范围内，且在避光条件下进行。2.多维葡萄糖中含有维生素B1、B2、C、D2及葡萄糖，其中维生素C和葡萄糖在水溶液中不发荧光，维生素B1本身无荧光，在碱性溶液中用铁氰化钾氧化后才产生荧光，维生素D2用二氯乙酸处理后才有荧光，他们都不干扰维生素B2的测定。三 实验仪器与试剂仪器：日立R-7000荧光仪、5 mL吸量管1只、2 mL吸量管1只、 50 mL容量瓶7只。试剂：10.0g·mL-1VB2标准溶液（置阴暗处保存）、冰乙酸（AR）、多维葡萄糖粉试样。四 实验步骤1. 打开氙灯，再打开主机，然后打开计算机启动工作站并初始化仪器，预热30min。2. 仪器初始化完毕

5、后，在工作界面上选择测量项目，设置适当的仪器参数：设置激发波长为440nm，发射波长为540 nm，灵敏度2，入射缝宽和出射缝宽均为10nm。3、点击“测本底值”，测得本底值为1.41。4. 样品测定1）标准系列溶液的配制及标准溶液荧光强度的测定：    在6个干净的50 ml容量瓶中，分别吸取0.50、1.00、1.50，2.00，2.50和3.00维生素B2标准溶液，各加入2.00 ml冰乙酸，稀释至刻度，摇匀。得到不同浓度的溶液分别是：0.1，0.2，0.3，0.5，0.6ug/ml的维生素B2溶液，从稀到浓测量系列标准溶液的荧光强度。2）未知试样的测定：称

6、取0.1786g多维葡萄糖粉试样,用少量水溶解后转入100 ml容量瓶中，加2.00 ml冰乙酸，稀释至刻度，摇匀。用测定标准系列时相同的条件，平行测量其荧光强度3次。5、退出主程序，关闭计算机，先关主机，最后关氙灯五数据记录与处理1. 用标准系列溶液的荧光强度绘制标准工作曲线浓度(g/ml)荧光强度(I)123平均0.143.46 43.14 42.96 43.190.274.8974.2875.2374.800.3104.4104.4104.8104.530.4137.2138.0137.9137.700.5174.6174.1175.2174.630.6206.6205.9205.420

7、5.972、未知样品浓度的测定                 根据待测液的荧光强度，从标准工作曲线上求得其浓度，计算出试样中含量。（Y = 8.814 + 327.58857 * X）编号123平均值I77.3376.4376.7676.84C/ug.ml-10.2090.2060.2070.2077维生素B2百分含量= (0.2077×50×10-6)/0.1786×100=0.0058六注意事项1.使用970CRT时，要按照仪器使用规定使用，不可随意操作。2.使用石英比色皿时，要注意勿用手直接触摸比色皿表面，因握住恻棱。3.每次测量要多测几次，以保证实验误差不会太大，一般要看平行测定的三组数据相差不大，才保留该组数据为实验数据。七问题1. 试解释荧光光度法较吸收光度法灵敏度高的原因？答：荧光强度与激发光强度成正比，提高激发光强度，可成倍提高荧光强度。同时，提高仪器灵敏度，也可提高荧光光度法的灵敏度。而对于吸收光度法，无论是提高激发光强度提高仪器灵敏度还是提高仪器灵敏度，入射光和出射光同时增大，其灵敏度不变。因此，荧光光度法较