荧光定量PCR技术的临床应用

1、西安天隆科技西安天隆科技PCR的概念的概念PCRPCR只是一个概念，所发生的奇迹是：只是一个概念，所发生的奇迹是：PCRPCR概念变成概念变成了可操作的实验系统，变成了一项成熟的技术，后了可操作的实验系统，变成了一项成熟的技术，后者又上升成为新的概念。者又上升成为新的概念。 它最大的特点就是能不断推出新形式。它最大的特点就是能不断推出新形式。 摘自摘自Making PCR: A Story of Biotechnology by Paul Rabinow什么是什么是PCR? 我不认为PCR能够用两种“革命”(政治革命和科学革命)加以说明。它的发明并没有改变基因操作的本质。有了PCR，我们能在更

2、广的范围内更快、更容易地进行基因操作，学术界也完全不用等到某人死去或退休后才能接受PCR。它只不过是一它只不过是一种新工具。种新工具。 凯利穆利斯（Kary Mullis)PCR?PCRPCR只是一个简单的不起眼玩艺只是一个简单的不起眼玩艺 凯利穆利斯（Kary Mullis)Kary MullisPCR及有关技术的发展历史及有关技术的发展历史 1983年12月16日Cetus公司的 K. Mullis（第一次成功实验）发明了PCR。 1985年关于PCR 的文章首次由Cetus公司Saiki等人在 Science 上 发 表 (R. Saiki, S. Scharf, F. Faloona,

3、 K. Mullis, G. Horn, H. Erlich and N. Arnheim 19871987年年7 7月月CetusCetus公司在美国获得公司在美国获得PCRPCR基本技术专利批准。基本技术专利批准。 成立于成立于19851985年底的年底的Perkin-Elmer CetusPerkin-Elmer Cetus仪器公司于同年的仪器公司于同年的1111月推出了第一月推出了第一 个个PCRPCR试剂产品及第一台热循环仪。试剂产品及第一台热循环仪。 19891989年年Science Science 报道了耐热性报道了耐热性DNADNA多聚酶多聚酶TaqTaq酶的发现酶的发现,

4、,预示着预示着分子时代的到来。分子时代的到来。1212月月ScienceScience杂志将杂志将PCRPCR和它所使用的和它所使用的聚合酶命名为第一个聚合酶命名为第一个“年度分子年度分子”。 19921992年年3 3月月CetusCetus公司获得公司获得TaqTaq酶、热循环酶、热循环扩增仪等专利；扩增仪等专利； 19931993年年Kary Mullis Kary Mullis 因因PCRPCR的发明获得诺的发明获得诺贝尔化学奖。贝尔化学奖。应用现状应用现状19851985年年19881988年年19921992年年19921992年年-1997-1997年年 19981998年年20

5、022002年年PCR反应原理反应原理PCRPCR技术的基本原理类似于技术的基本原理类似于DNADNA的天然复制过程，其特异性的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCRPCR由变性由变性-退退火火-延伸三个基本反应步骤构成延伸三个基本反应步骤构成 PCR反应体系的组成反应体系的组成:引物引物酶酶dNTPdNTP模板模板MgMg2+2+探针探针引物：引物： 引物是引物是PCRPCR特异性特异性反应的关键，反应的关键，PCR PCR 产物的特异性取决引物与模板产物的特异性取决引物与模板DNADNA互补的程度互补的程度 PCRPCR引物

6、的要求：引物的要求： 引物长度：引物长度：15-30bp15-30bp，常用为，常用为20bp20bp左右。左右。 引物跨度：引物跨度：以以200-500bp200-500bp为宜为宜 。 G+CG+C含量：含量： 以以40-60%40-60%为宜，为宜，G+CG+C太少扩增效果不佳，太少扩增效果不佳，G+CG+C过多易出现非特异条带。过多易出现非特异条带。 引物结构：引物结构：避免出现二级结构、引物间互补、形成二聚体，产生非特异扩增。避免出现二级结构、引物间互补、形成二聚体，产生非特异扩增。 特异性：特异性： 引物与数据库的其它序列无明显同源性。引物与数据库的其它序列无明显同源性。 引物量：

7、引物量： 每条引物的浓度每条引物的浓度1umol1umol或或1010100pmol100pmol，以最低引物量产生所需要的，以最低引物量产生所需要的 结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之 间形成二聚体的机会。间形成二聚体的机会。酶及其浓度：酶及其浓度：两种两种Taq DNATaq DNA聚合酶聚合酶 一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶 一种为大肠菌合成的基因工程酶。一种为大肠菌合成的基因工程酶。 浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低

8、则合成产物量减少成产物量减少dNTPdNTP：(ACGT)(ACGT) dNTP dNTP的质量与浓度和的质量与浓度和PCRPCR扩增效率有密切关系。扩增效率有密切关系。 dNTPdNTP粉呈颗粒状，如保存不当易变性失活，多粉呈颗粒状，如保存不当易变性失活，多次冻融会使次冻融会使dNTPdNTP降解。降解。 在在PCRPCR反应中，反应中，dNTPdNTP应为应为5050200 mol/L200 mol/L，浓度，浓度过低又会降低过低又会降低PCRPCR产物的产量太少产物的产量太少。 模板核酸：模板核酸：模板核酸提取质量是模板核酸提取质量是PCRPCR成败与否的关键环节之一成败与否的关键环节之

9、一 纯度纯度 蛋白、多糖、酚类等抑制PCR反应 完整性完整性 模板降解会导致PCR扩增无产物 浓度浓度 浓度适当DNA提取提取方法：方法：1 SDS裂解酚、氯仿 乙醇或异丙醇沉淀法2 蛋白酶K裂解酚、氯仿 乙醇或异丙醇沉淀法3 异硫氰酸胍裂解酚氯仿 乙醇或异丙醇沉淀法4 碱变性快速提取法RNARNA模板：模板：RNARNA模板提取一般采用：模板提取一般采用： 异硫氰酸胍异硫氰酸胍- -氯仿氯仿- -酚抽提法酚抽提法 蛋白酶蛋白酶K K法法- -氯仿氯仿- -酚抽提法酚抽提法要防止要防止RNaseRNase降解降解RNARNA： 干烤或干烤或DEPCDEPC（焦碳酸二乙酯）处理（焦碳酸二乙酯）处

10、理MgMg2+2+浓度：浓度： MgMg2+2+浓度为浓度为2.0 mmol/L2.0 mmol/L为宜，为宜，Mg Mg 2+2+对对PCRPCR扩增扩增的特异性和产量有显著的影响。的特异性和产量有显著的影响。 MgMg2+2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增。增。 MgMg2+2+浓度过低会降低浓度过低会降低Taq DNATaq DNA聚合酶的活性，使聚合酶的活性，使反应产物减少。反应产物减少。三温度法：三温度法：90 95变性变性 60s40 60退火退火 60s70 75延伸延伸 90s二温度点法二温度点法 94变性变性60左右退火与延伸左

11、右退火与延伸PCRPCR反应温度与时间反应温度与时间PCR反应条件的选择反应条件的选择循环次数：循环次数： 一般的循环次数选在一般的循环次数选在30304040次之间次之间 循环次数越多，非特异性产物的量亦随之循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多增多PCRPCR产物检测：产物检测： PCR扩增产物的电泳分析扩增产物的电泳分析琼脂糖电泳琼脂糖电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳 1. 凝胶与电泳缓冲液配制凝胶与电泳缓冲液配制2.2.核酸电泳的指示剂与染色剂核酸电泳的指示剂与染色剂 溴酚兰溴酚兰 溴化乙锭染色法溴化乙锭染色法 3. 3. 电泳：电泳：4. 4.

12、结果观察：结果观察： 紫外仪上观察电泳带及其位置，并紫外仪上观察电泳带及其位置，并与核酸分子量标准比较被扩增产物的大小与核酸分子量标准比较被扩增产物的大小 琼脂糖凝胶的浓度与琼脂糖凝胶的浓度与DNA分离范围分离范围 琼脂糖浓度(%)线型DNA分子的分离范围(Kb)0.35600.61200.70.8100.90.57.01.20.96.01.50.23.012.00.12.0聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶的制备电泳：电压为1-8V/cm观察： 浸入含的溴化乙锭溶液中， 1530min后取出水洗紫外仪下观察结果 丙烯酰胺丙烯酰胺(%)(%) 有效分离范围有效分离范围(bp)

13、(bp)溴酚兰溴酚兰* * 二甲苯青二甲苯青* * 3.53.5 100 10020002000 100 100 460 460 5.0 5.0 80 80500500 65 65 260 260 8.0 8.0 60 60400400 45 45 160 160 12.0 12.0 40 40200200 30 30 70 70 15.0 15.0 25 25150150 15 15 60 60 20.0 20.0 10 10100100 12 12 45 45 *表中给出的数字为与指示剂迁移率相等的双链DNA分子所含碱基对数目(bp) 结果判定方式结果判定方式根据电泳条带判定根据电泳条带判

14、定 有：阳性有：阳性 无：阴性无：阴性常规常规PCRPCR存在的问题存在的问题1 1 假阴性、假阳性假阴性、假阳性2 2 易产生非特异性扩增带易产生非特异性扩增带3 3 出现片状拖带或涂抹带出现片状拖带或涂抹带4 4 产物凝胶分析，易造成污染产物凝胶分析，易造成污染5 5 不能准确定量不能准确定量6 6 应用局限应用局限荧光定量荧光定量PCRPCR技术技术FQ-PCR Fluorescence quantitative PCRFQ-PCR Fluorescence quantitative PCR 荧光定量荧光定量PCR的产生的产生常规常规PCRPCR的局限性的局限性医学研究和临床诊断的需要医

15、学研究和临床诊断的需要分子生物学技术的发展分子生物学技术的发展荧光标记方法的完善和渗入荧光标记方法的完善和渗入荧光能量传递技术的应用荧光能量传递技术的应用 于于19961996年由美国年由美国ABIABI公司推出公司推出实时荧光实时荧光 定量定量PCRPCR原理原理所谓实时荧光定量所谓实时荧光定量PCRPCR技术，是指在技术，是指在PCRPCR反应体反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个测整个PCRPCR进程，最后通过标准曲线对未知模进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。板进行定量分析的方法。常规常规PCRPCR技术：技术：

16、对对PCRPCR扩增反应的终产物进行定量及扩增反应的终产物进行定量及 定性分析定性分析定量定量PCRPCR技术：技术： 对对PCRPCR扩增反应的每一个循环的扩增扩增反应的每一个循环的扩增 产物进行定量及定性分析产物进行定量及定性分析1 1 灵敏度高：具有引物和探针的双重特异性灵敏度高：具有引物和探针的双重特异性2 2 特异性强：线性范围很宽，特异性强：线性范围很宽，0-100-101111拷贝拷贝/ml/ml3 3 全封闭全封闭PCRPCR过程，无需后处理过程，无需后处理4 4 采用采用dUTPdUTPUNGUNG酶的防污染系统，有效降低污染机会酶的防污染系统，有效降低污染机会5 5 即时反

17、映扩增过程，摒弃终点数据，更适用于定量即时反映扩增过程，摒弃终点数据，更适用于定量6 6 定量范围宽，可达到定量范围宽，可达到1010个数量级，无须稀释样品个数量级，无须稀释样品7 7 可实现一管多检可实现一管多检8 8 仪器自动分析，更快获得结果仪器自动分析，更快获得结果探针设计的一般原则探针设计的一般原则1 1 扩增片段的长度不应太大扩增片段的长度不应太大, ,一般小于一般小于300bp300bp2 2 探针不能和任一引物互补探针不能和任一引物互补3 3 探针保证特异性的前提下尽可能的短，长度不超探针保证特异性的前提下尽可能的短，长度不超 过过30bp30bp4 4 探针的探针的TmTm值

18、至少比引物的值至少比引物的TmTm值高值高5 5度度5 5 探针应尽可能的靠近引物探针应尽可能的靠近引物6 6 如用于检测多态位点如用于检测多态位点, ,多态位点应尽可能的靠近探多态位点应尽可能的靠近探 针中部针中部7 7 探针探针5 5端不能是端不能是G G，G G有淬灭作用有淬灭作用为什么要进行荧光定量为什么要进行荧光定量PCRPCR检测？检测？ 1 1 针对病毒性肝炎危害群众健康的迫切性，针对病毒性肝炎危害群众健康的迫切性，2 2 治疗病毒性肝炎尤其是乙、丙肝炎作为重要性治疗病毒性肝炎尤其是乙、丙肝炎作为重要性3 3 以控制住病毒在人体内的复制为目的以控制住病毒在人体内的复制为目的4 4

19、 评价抗病毒药物是否治疗有效评价抗病毒药物是否治疗有效5 5 通过在治疗过程中进行病毒通过在治疗过程中进行病毒DNA/RNADNA/RNA定量检测跟踪定量检测跟踪6 DNA/RNA6 DNA/RNA在治疗前后是否发生量上的减少或消失以及其持续在治疗前后是否发生量上的减少或消失以及其持续 性来进行评价。性来进行评价。7 7 病毒病毒DNA/RNADNA/RNA含量的定量测定和动态变化可在临床上对用药含量的定量测定和动态变化可在临床上对用药 的剂量、用药时间以及联合用药等提供指导参考的剂量、用药时间以及联合用药等提供指导参考8 8 荧光定量荧光定量PCRPCR检测可为临床上的预后判断等提供依据。检

20、测可为临床上的预后判断等提供依据。定量测定的结果报告定量测定的结果报告 定量测定测定的是量的“多”或“少”；定性测定则是测定某种物质的“有”或“无”，用于未知病人的确认诊断。 定量测定结果报告：定量测定结果报告：根据所使用的测定方法的测定范围报告结果，如样本测定结果高出此范围，则可报告多少，也可对样本稀释后再检测；如低于此范围，则报告多少，如103拷贝数/ml，而不能报告为0拷贝数/ml或阴性。如何看荧光定量如何看荧光定量PCRPCR检验报告单？检验报告单？ 荧光定量荧光定量PCRPCR检测是反映被检标本中病毒检测是反映被检标本中病毒DNA/RNADNA/RNA存在的多少，结果存在的多少，结果

21、通常用数字表示（即通常用数字表示（即X X1010n n copies/ml copies/ml），定量检测结果主要是对），定量检测结果主要是对抗病毒治疗疗效提供检测和参考。抗病毒治疗疗效提供检测和参考。 HBV DNAHBV DNA、HCV RNAHCV RNA的定量单位在报告单上通常用的定量单位在报告单上通常用“copies/mlcopies/ml”表示每毫升的血清或血浆中病毒基因组的个数，该数据越大，表明表示每毫升的血清或血浆中病毒基因组的个数，该数据越大，表明病毒在人体内的复制越活跃。例如病毒在人体内的复制越活跃。例如“HBV DNA=4.3HBV DNA=4.310103 3 cop

22、ies/mlcopies/ml”代表每毫升血清中有代表每毫升血清中有43004300个乙肝病毒。判断血清或血浆中病毒含量个乙肝病毒。判断血清或血浆中病毒含量主要看上式中的主要看上式中的“1010n n”，n n越大，表示含量越高。治疗过程中，越大，表示含量越高。治疗过程中，n n变变小说明病毒的复制得到控制，治疗有效。通常如果病毒含量下降至小说明病毒的复制得到控制，治疗有效。通常如果病毒含量下降至n3n98%98% 小三阳小三阳 20-45%20-45% e e抗原阳性抗原阳性 97%97% e e抗体阳性抗体阳性 37%37%传染性强传染性强注意隔离注意隔离HBVHBV感染程度判断感染程度判

23、断HBV-DNA水平 复制水平 传染程度101-105拷贝/ml 低 弱大于105拷贝/ml 高 强干扰素治疗选择干扰素治疗选择HBV-DNAHBV-DNA拷贝数小于拷贝数小于10105 5时，治疗效果好时，治疗效果好HBV-DNAHBV-DNA拷贝数大于拷贝数大于10105 5时，治疗效果差时，治疗效果差拉米夫定治疗效果评价拉米夫定治疗效果评价HBV-DNA拷贝数降低，说明治疗有效HBV-DNA拷贝数升高，说明治疗无效耐药株28周HBV-DNAHBV-DNA可升高可升高3 3个指数以上个指数以上转氨酶升高转氨酶升高胆红素升高胆红素升高HBVDNA突变检测的临床意义动态监测：动态监测： 服用拉

24、米夫定3个月开始,每月检测1次提前发现：提前发现： 可在耐药临床表现发生前14个月检测 出突变株及时调整：及时调整： 适时调整用药方案，防止病毒对拉米夫 定耐药而导致病情恶化YMDD变异检测 n采用双探针PCR技术，应用ABI系列，MJ-型等具有FAM和VIC检测通道的荧光PCR仪，做一管反应液便可同时测出HBV DNA载量及YMDD变异情况，减少临床监测的复杂度，加快患者的取报告过程。满足当前临床对抗HBV核苷类药物的合理选择和抗病毒效果的及时监测。 HBV耐药突变耐药突变-YMDD变异变异该的项目是临床目前急需开展项目,对指导临床用药意义重大nYMDD变异分析是目前临床核苷类药物抗HBV选

25、择的重要依据。n目前乙型肝炎治疗药物比较多，但是功效明确针对乙肝病毒的药物主要是两大类。n核苷类似物n拉米夫定（已在国内上市）n阿德夫韦（已在国内上市）n恩替卡韦（正在审批过程中）n干扰素n干扰素（已在国内上市）n长效干扰素（正在审批过程中）n拉米夫定（拉米夫定（lamivudine, 3-TC)lamivudine, 3-TC)n 1999 1999年获得年获得SFDASFDA批文，是目前国内用量最大的治疗批文，是目前国内用量最大的治疗HBHB的药物。的药物。抑制抑制HBV HBV 复制作用显著。复制作用显著。肝功能正常化作用显著。肝功能正常化作用显著。肝脏组织病理学改善作用显著。肝脏组织病

26、理学改善作用显著。基本无副作用（副作用小）。基本无副作用（副作用小）。口服用药（口服用药（100mg/100mg/天），方便。天），方便。使用过程会出现较高比例的耐药。使用过程会出现较高比例的耐药。耐药出现时间较早，而且会随服药时间增加，耐药耐药出现时间较早，而且会随服药时间增加，耐药人群比例显著增加。人群比例显著增加。随着耐药性产生，随着耐药性产生， HBV HBV 复制、肝功能以及肝脏组复制、肝功能以及肝脏组织病理学等相关指标出现反跳。织病理学等相关指标出现反跳。PCR技术在优生优育中的应用技术在优生优育中的应用n常见的易致胎儿畸型的感染性疾病原体主要有单疱病毒（HSV）、风疹病毒（RV）

27、、人巨细胞病毒（HCMV）、弓形体（TOX）及沙眼衣原体（CT）。以往这些病原体感染诊断比较困难，主要靠培养法进行确诊，而培养法费时，代价昂贵，而且受到采样、样要保存及用药等因素的影响，基本不能在临床中推广。PCR基因扩增法因其高敏感性、高特异性非常适合这些疾病诊断及疗效跟踪，是最值得推荐的检验方法。 丙肝病毒定量丙肝病毒定量 HCVHCV是引起输血后肝炎的主要致病因子，是引起输血后肝炎的主要致病因子，因其在血中的含量极低，仅为因其在血中的含量极低，仅为HBVHBV的的1%1%，其免疫学标志只有抗其免疫学标志只有抗-HCV-HCV一项，且至今一项，且至今病毒分离尚未成功，所以病毒分离尚未成功，

28、所以HCVHCV的检测较的检测较HBVHBV困难的多，因此，困难的多，因此，PCRPCR技术在技术在HCVHCV的的检测出显得格外重要，其意义主要表现检测出显得格外重要，其意义主要表现在：在： 提高丙肝病毒的检出率提高丙肝病毒的检出率 发病天数 ELISA FQ-PCR 6-30 67% 96% 30-60 45% 83%在在“窗口期窗口期”没有抗没有抗-HCV-HCV产生，但可检测产生，但可检测RNARNAHCV-RNAHCV-RNA持续维持高水平状态可能预后不佳。持续维持高水平状态可能预后不佳。抗抗-HCV-HCV阳性并不能代表现症感染，丙型肝炎的阳性并不能代表现症感染，丙型肝炎的 诊断标

29、准是诊断标准是HCV-RNA(+) HCV-RNA(+) HCV-RNAHCV-RNA定量可指导用药定量可指导用药血清血清HCVHCV拷贝高于拷贝高于10105 5/ml/ml对干扰素不敏感对干扰素不敏感血清血清HCVHCV拷贝小于拷贝小于10105 5/ml/ml对干扰素敏感对干扰素敏感转阴效果观察转阴效果观察HCV-RNA10HCV-RNA10HCV- RNA105 5拷贝拷贝/ml/ml，约，约4%4%转阴转阴性病病原体定量性病病原体定量 性病是当今世界范围流行最广泛的一组传染病,它的概念已从过去经典的5 种性病演变为包括艾滋病在内的与性行为接触密切相关的20 余种传染病,统称性传播疾病

30、(STD )。目前STD 在我国的发病率呈不断上升的趋势,卫生部列出淋病、非淋菌性尿道炎等为重点防治的对象。 种类及意义种类及意义巨细胞病毒病毒单纯疱疹病毒人乳头瘤病毒淋球菌沙眼衣原体解脲支原体确定病原体的数量确定病原体的数量明确感染程度明确感染程度掌握用药时机掌握用药时机药物疗效观察药物疗效观察特异性和敏感性特异性和敏感性 NG CT UU方法 特异性% 敏感性% 特异性% 敏感性% 特异性% 敏感性%FQ-PCR 常规PCR 83.8 86.2 80.0 89.6 83.1 86.6 HIV诊断诊断1 HIV1 HIV是一种慢性病毒，在细胞内的繁殖水平较低，是一种慢性病毒，在细胞内的繁殖水

31、平较低，感染后潜伏期较长，病毒难以培养而且时间较长，感染后潜伏期较长，病毒难以培养而且时间较长，在抗原在抗原/ /抗体检测结果难以判断时，抗体检测结果难以判断时，PCRPCR可作为确可作为确诊手段。诊手段。2 2 目前临床上一般只检测目前临床上一般只检测HIV-AbHIV-Ab，感染，感染HIVHIV的患者的患者血清血清HIV-P24AgHIV-P24Ag出现早于出现早于HIV-Ab10HIV-Ab10天左右。发现天左右。发现HIV-P24AgHIV-P24Ag（+ +）者，）者，HIV-PCRHIV-PCR（+ +），但），但HIVPCRHIVPCR（+ +）者，）者，HIV-P24AgHI

32、V-P24Ag可呈现（可呈现（- -），此时患者具），此时患者具有传染性，有传染性，PCRPCR可用于可用于HIVHIV的早期诊断。的早期诊断。3 3 定量定量PCRPCR还可用于还可用于HIVHIV疗效观察的有效手段。疗效观察的有效手段。呼吸道病源体定量呼吸道病源体定量 呼吸道是病原体最易侵袭的门户，病原体种类繁多，感染后发病迅速，症状复杂等。现有的实验室诊断方法均为抗原/抗体检测的免疫学方法，由于各种病原体感染存在“窗口期”不能及时反映感染程度。荧光定量PCR即可解决这些问题。 种类和意义种类和意义结核杆菌结核杆菌流感病毒流感病毒肺炎支原体肺炎支原体肺炎衣原体肺炎衣原体嗜肺军团菌嗜肺军团菌

33、SARSSARS确定病原体的数量确定病原体的数量明确感染程度明确感染程度掌握用药时机掌握用药时机药物疗效观察药物疗效观察结核杆菌用于结核病的早期诊断提高结核杆菌的检出率 方法 检出率 敏感性 特异性涂片法 培养法 SARS病毒定量病毒定量 原理：针对冠状病毒的基因组序列设计出特异性引物，对样本的核原理：针对冠状病毒的基因组序列设计出特异性引物，对样本的核 酸提取物进行扩增，通过对扩增产物的分析判断是否被冠状酸提取物进行扩增，通过对扩增产物的分析判断是否被冠状 病毒感染病毒感染特点：由于其速度快、应用范围广的还是目前进行冠状病毒感染诊特点：由于其速度快、应用范围广的还是目前进行冠状病毒感染诊 断

34、最为可行的方法断最为可行的方法缺陷：存在假阴性、假阳性等缺陷：存在假阴性、假阳性等检测对象：对血液、粪便、呼吸道分泌物、痰液、唾液和漱口液等检测对象：对血液、粪便、呼吸道分泌物、痰液、唾液和漱口液等 临床样本的核酸提取物进行体外的扩增后，进行定性与临床样本的核酸提取物进行体外的扩增后，进行定性与 定量定量分析分析 PCR引物的选择引物的选择 世界卫生组织公布世界卫生组织公布7 7对用于对用于SARS-PCRSARS-PCR诊断的引物诊断的引物序列，检测中的阳性对照序列，检测中的阳性对照RNARNA可以从可以从Bernhard-Bernhard-Nocht Institute in Hambur

35、g, GermanyNocht Institute in Hamburg, Germany免费获免费获得。检测样品包括血液、粪便、呼吸道分泌物。得。检测样品包括血液、粪便、呼吸道分泌物。PCRPCR结果可以辅助临床诊断评价，但是不能肯定结果可以辅助临床诊断评价，但是不能肯定或排除疾病的可能。其原因：或排除疾病的可能。其原因：冠状病毒的变异冠状病毒的变异难于选择高度保守的引物序列难于选择高度保守的引物序列达不到达不到100%100%检出检出SARS-CoV RNA阳性判断标准阳性判断标准 应用应用PCRPCR方法符合下列三项之一者可方法符合下列三项之一者可判断为检测结果阳性。判断为检测结果阳性。

36、至少需要两个不同部位的临床标本检测阳至少需要两个不同部位的临床标本检测阳性性( (例：鼻咽分泌物和粪便例：鼻咽分泌物和粪便) )。收集至少间隔收集至少间隔2 2天的同一种临床标本送检检天的同一种临床标本送检检测阳性测阳性( (例：例：2 2份或多份鼻咽分泌物份或多份鼻咽分泌物) )。在每一个特定检测中对原临床标本使用两在每一个特定检测中对原临床标本使用两种不同的方法，或重复种不同的方法，或重复PCRPCR方法检测阳性。方法检测阳性。 PCR检测结果的确认检测结果的确认使用原始标本重复使用原始标本重复PCRPCR试验试验, ,至少三次至少三次在第二个实验室检测同一份标本。在第二个实验室检测同一份

37、标本。临床意义临床意义-1 当当SARSSARS病毒感染后，在感染者的体液中最先会病毒感染后，在感染者的体液中最先会检出病毒颗粒的存在；而血液中的特异性抗体的检出病毒颗粒的存在；而血液中的特异性抗体的出现要晚的多，为此出现要晚的多，为此RT-PCRRT-PCR方法可用于病毒感染方法可用于病毒感染的早期诊断及疑似感染者的诊断的早期诊断及疑似感染者的诊断 在痰液、鼻咽拭子等分泌物标本中检出率较高，在痰液、鼻咽拭子等分泌物标本中检出率较高，在血液标本中检测效果不太理想。在血液标本中检测效果不太理想。 目前国内外已有多种成品的目前国内外已有多种成品的RT-PCRRT-PCR试剂盒应用试剂盒应用于临床诊

38、断，以其方法的性能有待于进一步评价。于临床诊断，以其方法的性能有待于进一步评价。 临床意义临床意义-2 RT-PCRRT-PCR检测检测SARSSARS病毒阳性时，有助于病毒阳性时，有助于SARSSARS的排查。的排查。 RT-PCRRT-PCR方法出现阴性结果时，并不能说明没有方法出现阴性结果时，并不能说明没有SARSSARS病毒的感染，也不能排除病人携带病毒的可能性。病毒的感染，也不能排除病人携带病毒的可能性。 根据目前对根据目前对SARSSARS实验室诊断研究和实验室诊断研究和PCRPCR技术应用的特技术应用的特点，我们认为应用点，我们认为应用RT-PCRRT-PCR方法用于方法用于SA

39、RSSARS诊断时，应在诊断时，应在出现症状出现症状3 3天后连续天后连续3 35 5次检测，如果连续监测阳性结次检测，如果连续监测阳性结果，有助于排查诊断。该方法是目前用于果，有助于排查诊断。该方法是目前用于SARSSARS实验诊实验诊断的较为有效的早期快速诊断方法。断的较为有效的早期快速诊断方法。 病毒、细菌载量病毒、细菌载量 某些病毒、细菌可以在普通人体内存在，所以检测这些病毒、细菌最好用定量PCR，数量要达到一定程度才考虑有临床意义。 在严格的试验条件下，一些标本细菌培养结果和DNA结果不一致目前尚难以解释，但对有临床症状患着的标本某些细菌培养结果是阴性，mRNA的检测结果呈阳性，应考

40、虑体内细菌致病。通过荧光定量通过荧光定量PCRPCR技术可较准确的了解病人体内病原微技术可较准确的了解病人体内病原微生物的含量，但是含量与病情之间的关系如何并不确生物的含量，但是含量与病情之间的关系如何并不确定，这方面的研究需要将病原微生物定量结果与医生定，这方面的研究需要将病原微生物定量结果与医生的临床观察相对应，经过长期对成百上千例病人的结的临床观察相对应，经过长期对成百上千例病人的结果分析与总结来了解病原微生物含量与病情之间的关果分析与总结来了解病原微生物含量与病情之间的关系这方面的资料积累越多则准确性越高。系这方面的资料积累越多则准确性越高。病源微生物含量与病情之间的关系病源微生物含量

41、与病情之间的关系通过荧光定量通过荧光定量PCRPCR技术可以检测出技术可以检测出ELISAELISA技术的窗口期感技术的窗口期感染，这样就引出一个新的课题，即人体内病原微生物的染，这样就引出一个新的课题，即人体内病原微生物的含量达到一个什么样的数值表明这个人得了病，需要进含量达到一个什么样的数值表明这个人得了病，需要进行药物或其他治疗，也可以说，病原微生物的含量达到行药物或其他治疗，也可以说，病原微生物的含量达到什么样的数值后，人体不能自行控制病源体的进一步发什么样的数值后，人体不能自行控制病源体的进一步发展。展。建立新的病原体分子诊断标准建立新的病原体分子诊断标准超早期感染治疗用药及疗法的研

42、究超早期感染治疗用药及疗法的研究在确定了新的病原体分子诊断标准之后，如何治疗在确定了新的病原体分子诊断标准之后，如何治疗这些超早期感染的病人又是一个新的问题。以前所这些超早期感染的病人又是一个新的问题。以前所用的药物及疗法都是在病人感染程度相对较高时所用的药物及疗法都是在病人感染程度相对较高时所用的，对于感染很低的病人，很明显不能沿用以前用的，对于感染很低的病人，很明显不能沿用以前的疗法或简单地降低用药量，因为降低用药量容易的疗法或简单地降低用药量，因为降低用药量容易引物耐药性。这方面的研究需要药物开发人员与医引物耐药性。这方面的研究需要药物开发人员与医疗人员的密切合作。疗人员的密切合作。 不

43、同感染程度的病人需要不同药物、不同不同感染程度的病人需要不同药物、不同的剂量等来治疗，以节约用药及降低用药的剂量等来治疗，以节约用药及降低用药时间，这方面的研究也需要药物开发人员时间，这方面的研究也需要药物开发人员与医疗人员的密切合作。与医疗人员的密切合作。 病原微生物含量与用药之间的关系病原微生物含量与用药之间的关系如何通过病原微生物的含量确定病人是否病愈，即如何通过病原微生物的含量确定病人是否病愈，即病愈的指标也是一个需要研究的，现在很多的疾病病愈的指标也是一个需要研究的，现在很多的疾病的病愈指标并不明确，有一些原以为已经治愈的疾的病愈指标并不明确，有一些原以为已经治愈的疾病又会复发，或是

44、在以为治愈后还有吃上一周甚至病又会复发，或是在以为治愈后还有吃上一周甚至半年的药。如果能有一个较明确的愈后指标，则可半年的药。如果能有一个较明确的愈后指标，则可以减少用药时间，从而降低病人的费用以及药物对以减少用药时间，从而降低病人的费用以及药物对病人的副作用。病人的副作用。 新的愈后指标的研究新的愈后指标的研究传染病在大规模流行之前一定有一个潜伏期，在这传染病在大规模流行之前一定有一个潜伏期，在这一期间，病情并没有表现出来，由于荧光定量技术一期间，病情并没有表现出来，由于荧光定量技术可以测定较低感染水平，因此可以通过选取一定数可以测定较低感染水平，因此可以通过选取一定数量的人群进行测定，根据

45、带病原微生物的人数及病量的人群进行测定，根据带病原微生物的人数及病原微生物的含量来推测是否会发生疫情，从而监控、原微生物的含量来推测是否会发生疫情，从而监控、预测和预防传染病的流行，这一研究的社会效益和预测和预防传染病的流行，这一研究的社会效益和经济效益都是巨大的。经济效益都是巨大的。 传染病的发病监控、预测与预防传染病的发病监控、预测与预防肿瘤相关的因子已有上千种，通过研究这肿瘤相关的因子已有上千种，通过研究这些肿瘤相关因子的些肿瘤相关因子的mRNAmRNA水平的变化与某一水平的变化与某一特定肿瘤之间的相关性，可以为肿瘤的早特定肿瘤之间的相关性，可以为肿瘤的早期诊断与治疗提供有力的证据，从而

46、大大期诊断与治疗提供有力的证据，从而大大降低肿瘤的死亡率以及肿瘤治疗的时间与降低肿瘤的死亡率以及肿瘤治疗的时间与费用。费用。 mRNAmRNA的表达水平与是否肿瘤及其进展的关系的表达水平与是否肿瘤及其进展的关系很多的遗传病都是由于基因突变或是很多的遗传病都是由于基因突变或是mRNAmRNA水水平变异造成的，对于这些遗传病的诊断，应平变异造成的，对于这些遗传病的诊断，应用荧光定量技术来测定这些突变是相当准确用荧光定量技术来测定这些突变是相当准确和方便的。这样的测定与和方便的。这样的测定与DNADNA序列测定相比费序列测定相比费用低、速度快。用低、速度快。 等位基因与遗传病之间的关等位基因与遗传病

47、之间的关系系一些有遗传性的疾病并不是由于基因突变造成的，一些有遗传性的疾病并不是由于基因突变造成的，而是与人的体质相关，如结核病、高血压及心脏病而是与人的体质相关，如结核病、高血压及心脏病等。与这些疾病相关的体质特征可以通过多点的等。与这些疾病相关的体质特征可以通过多点的SNPSNP分析进行区分，从而预测什么样体质人易于发病，分析进行区分，从而预测什么样体质人易于发病，为体质相关疾病的预防提供依据。为体质相关疾病的预防提供依据。 SNPSNP与体质遗传病之间的关系与体质遗传病之间的关系个性化药物及疗法是药物治疗最高理想，个性化药物及疗法是药物治疗最高理想，即针对每一个特定的人提供疗法。这方面即

48、针对每一个特定的人提供疗法。这方面的研究需要大量的数据积累，有漫长的路的研究需要大量的数据积累，有漫长的路需要走。需要走。 SNPSNP与药物疗效之间的关系与药物疗效之间的关系人类基因组计划中，用定量人类基因组计划中，用定量PCRPCR可同可同时检测多种基因，比单独检测每一时检测多种基因，比单独检测每一个基因提供更多有效的信息个基因提供更多有效的信息 基因组研究基因组研究研究各种处理对细胞研究各种处理对细胞mRNAmRNA含量变化的影响含量变化的影响比较染病组织与正常组织中各种比较染病组织与正常组织中各种mRNAmRNA含量含量的差异的差异DNADNA或或RNARNA的转染量与实验结果关系的研究的转染量与实验结果关系的研究基因整合拷贝数的研究基因整合拷贝数的研究分子生物学研究分子生物学研究转基因植物中基因拷贝数与性状的关系转基因植物中基因拷贝数与性状的关系监测转基因植物中基因拷贝数的变化监测转基因植物中基因拷贝数的变化转基因植物株的早期筛查转基因植物株的早期筛查转基因成分的转移转基因成分的转移植物学方面植物学方面动物疫情的监测动物疫情的监测新的防止疫情发生及控制药物及方法研究新的防止疫情发生及控制药物及方法研究转基因动物中目的基因拷贝数与品质关系研究转