细胞HCP宿主残留蛋白ELISA试剂盒说明书分析

1、 Vero 细胞 HCP（宿主细胞蛋白） Vero细胞宿主蛋白酶联免疫检测 目录 #F500预期用途 该试剂盒用于检测用Vero 细胞.生产的制品中是否有宿主蛋白残留。仅供研究和工业生产，不能用于人和动物的诊断。总结与说明 病毒疫苗或其他治疗用蛋白在Vero细胞中表达使商业用大量生产药物原料产品的经济简便方法。生产和纯化这些产品的过程中会残留Vero细胞中的一些蛋白质（称为宿主细胞蛋白，HCPs）而造成污染。这种污染可以减少药物的疗效，引发毒副反应和免疫学反应，因此最好在实际生产制品过程中将HCPs降低到最低水平。 一些利用抗体来除HCPs的免疫学方法，如Western Blot 和ELISA

2、被广泛使用。虽然Western blot是一种检测HCPs的有效方法，但它受到了一些限制。因为它过程复杂且技术依赖性强，需要操作者对结果进行分析解释。而且，它在本质上是一种定性检测，不能定量分析。Western blot的敏感性易受被检测样品量的影响，也受目的产品浓度的干扰。因此Western blot可用来检测纯化上游的蛋白质，而对纯化下游或终产品的检测灵敏度与特异性较低。本试剂盒中用到的ELISA方法克服了Western Blot的缺点，将敏感度提高了100倍。ELISA操作简单、客观、可获得半定量的结果，是纯化工艺，过程控制，常规质量检测的最佳选择。这个试剂盒可与纯化过程中残留的可独立污

3、染产品的所有HCPs反应，就这个意义上来说，这个试剂盒是通用的。用Vero细胞轻度裂解物获得抗体并经亲和纯化，得到的最终抗体可以与用于生产各种病毒疫苗和蛋白质产品的四种商用细胞系反应。这一分析表明，绝大多数HCP存在于各种Vero细胞系和纯化过程中。如果你需要一个更为敏感和特异性的方法去检测样品中的HCP量，Cygnus Technologies公司为你推荐一个优于2D Western blot的方法，我们将这个方法称为2D HPLC-ELISA。2D HPLC-ELISA相较于2D Western blot来说敏感性强，特异性高。要想更多了解此方法，请联系我们公司服务部门。 使用特殊的方法制

4、备抗体，以减少低分子量和低免疫原性污染物以及高分子量组分。例如本试剂盒，可以作为一个工艺过程开发的工具来监控去除宿主细胞污染物的最佳条件，以及确保最终产品发布。 这种敏感性高的酶联免疫吸附试剂盒已被用于检测终产品的HCP，通过对来自不同生长状态和纯化过程的4种疫苗产品的中间产品和最终产品的实际检测来得到结果。我们鼓励该试剂盒的的每个使用者进行类似的验证研究以证明它符合他们的分析需求。这个试剂盒能满足你们的样品需求，不用再运用其他的特异性实验，因为那些实验提供的信息对这个通用的试剂盒来说是重复多余的。但是，如果你的验证研究表明此试剂盒中的抗体与你的样品中的HCP不能充分反应，那就需要同时运用一种

5、特异性的ELISA，且需要特异性强的抗血清。或者，如果该试剂盒中使用的多克隆抗体能提供足够的敏感性和广泛的抗原反应性，可用它替代本试剂盒中经共纯化的污染物制作的标准品，从而在特异的HCP检测过程中达到更好的精确性。使用更多的抗原和抗体所做的特异性分析法的应用理论上具有更好的特异性，但因为它过于特异而不能检测出因为操作不规范或过程改变后产生的一些新的或非典型的污染物。由于这个原因，我们建议用具有广泛反应性的“通用”宿主细胞蛋白检测实验分析最终产品纯度，即使可使用过程特异性分析。如果你认为有必要进行过程特异性分析检测， Cygnus Technologies公司将运用其已经验证的方法开发这种抗体并

6、按顾客要求进行检测。检测原理 Vero细胞检测是一个双位点酶联免疫检测。样品中包含的Vero Cell HCPs蛋白与标记有抗-Vero Cell抗体的辣根过氧化酶同时反应，反应在之前涂有一层吸附性抗-Vero Cell蛋白抗体的微量滴定板中进行。免疫反构成为夹层结构：固相抗体-HCP-酶标记抗体。反应结束后清洗微量滴定板，去除未结合反应物。添加TMB作用底物反应。微量滴定板读数器上测定水解物浓度，水解物浓度与Vero Cell HCPs蛋白浓度成正比。试剂&材料（试剂盒提供）成分 产品 #抗-Vero cell:HRP F501羊抗Vero cell亲和纯化抗体，用辣根过氧化酶标记。排列在加

7、有防腐剂的试剂盒中， 1x12mLAnti-Vero cell coated微量滴定板 F502*128孔 装在含有干燥剂的袋子内Vero cell HCP标准液 F503含有Vero cell HCP、牛血清白蛋白与防腐剂。 规格有 0, 2, 8, 25, 75和 200ng/mL . 1 mL/瓶 终止液 F0060.5N硫磺酸 1x12mLTMB F0053,3,5,5-四甲基联苯胺. 1x12mL清洗物（20倍浓缩） F004含防腐剂的Tris缓冲液 1x50ml *除了#F505，所有成分都可单独购买储存&稳定性*为了保持稳定，所有的试剂应储存在2C至8C，直到打印所示的截止日期为

8、止*若作为底物的试剂在450nm吸光度大于0.1，则不要使用*试剂盒所带的复原液在保质期前都是稳定的材料和器材（试剂盒不提供）能在450&650nm对微量滴定板进行读数的分光光度计（如果你微量滴定板不能不提供双波长的分析，你可以读取450nm波长）移液枪 50L 和100L多头或多道移液器 100L微量滴定板旋转器 150 - 200 rpm样品稀释液 推荐用Cat # 1028蒸馏水1L洗涤瓶，用来稀释洗液警告*仅供研究和工业使用*终止液是0.5N硫磺酸，禁止眼睛、皮肤或衣服与之接触。试剂盒的其他试剂均无害*该试剂盒只能由有资格的技术人员操作试剂预处理*将所有试剂放到室温下*用蒸馏水将浓缩的

9、洗液稀释到1L，在试剂盒上贴上标签，写上组别和失效日期，储存在4C注意事项 1.正确洗板，除去过量的未反应试剂对保持实验的重复性和灵敏度是必不可少的。我们强烈建议不要使用自动化或其他手动操作的真空吸尘装置清洗板，因为这样会降低特异性的吸光度，增加非特异的吸光度，使精确度改变。下面介绍的人工清洗程序在一般情况下只造成较低的背景干扰，且特异性的吸光度高，精确度更好。 2.样品中HCP浓度高时可观察到高剂量钩状效应或低水平的线性稀释。高剂量钩效应是由于在纯化上游阶段样品的HCP浓度过高，相对来说抗体较低而引起的。浓度大于1mg/mL 的样品，其吸光度低于200 ng/mL的标准液。当抗体浓度超过HC

10、P浓度时，也会出现钩效应。在这种情况下，未稀释的样品的吸光度可能低于试剂盒最高标准液的吸光度。然而，这些样本不能显示随着稀释度增加，HCP浓度也增加的线性关系。钩状效应最常出现在纯化上游阶段。如果可能出现钩状效应，我们需要对已稀释的样品进行检测。如果未稀释样品中HCP的浓度低于已稀释样品中HCP的浓度，则可能引起钩状效应。这样的样品至少要稀释到用实验中间品和终成品验证了的需要稀释的最低限度（MRDS）。在保证统计学精确度的情况下，一系列能检测出相同HCP值的样品稀释度中，MRD是第一个符合要求的稀释度。据报道，样品的稀释度与HCP值的关联是在已建立的MRD的基础上修正的。所用稀释剂应该准确回收

11、。首选的稀释剂是我们规格为100ml、500ml或1l/瓶的 Cat# I028。本试剂盒的标准液也是由这种稀释液制备的。当样品用1028稀释时，其稀释模型开始接近标准，从而减少用其他稀释液所造成的任何错误。其他要用的稀释液必须测试非特异性的结合，并用它们回收 已稀释的200ng/mL的标准液，方法如下文所述。局限性*在依靠这种检测来检测宿主细胞残留蛋白之前，每一个实验室都应该验证该试剂盒的抗体和检测程序的特异性、准确性和精确度是否符合要求。可以从我们公司的服务部门或网站获得验证试验的方法。*在本实验中使用的标准品包括用常规方法在疫苗产品初次收获液中溶解的Vero细胞HCPs。在该试剂盒中使用

12、的用来分析抗体的1D Western blot可识别经敏感蛋白染色（如银染和胶体金染色）的大多数的PAGE分离的条带。由于Vero 细胞系的大多数HCPS会表现出足够的抗原量，该试剂盒应该有足够的抗体活性与你的细胞系充分反应。但是，我们不能保证该试剂盒能检测出你们生产过程中所有的蛋白质或蛋白质片段。如果你希望用比 western blot 更为灵敏的方法来检测该试剂盒中的抗体与你的HCPs是否充分反应，我们将为你提供经过ELISA后用2D-HPLC分离HCPs的方法。*某些样品基质可能会干扰试验。本试剂盒使用的标准品试图模拟典型的样品与基质矩阵。然而，潜在的产品本身或样品基质中的其他成分可能对

13、本实验产生一些正向或负向干扰。高或低的PH值，去垢剂，尿素，高浓度的盐和有机溶剂是已知的干扰因素。建议对所有样品基质进行测试以排除干扰，用经稀释的200ng/ml标准液，1/4的基质不含或含非常低的HCP。如果要用标准品检测未知样品，则需添加30到50 ng/mL标准品的HCP值。至于如何定量样品基质的值，请咨询公司服务部门。*避免对含有叠氮化钠（NaN3）的样品进行测定，因为它会破坏辣根过氧化酶的连接活性，测得的HCP值偏低。实验方案* 该测定是非常强大的，可通过改变孵育时间、样本大小及它后续反应等实验中的可变因素可提高敏感性，增加分析范围或减少样本基质干扰。在修改我公司推荐的方法之前请联系

14、我们，我们将以最佳方式输入数据以确保达到您期望的目的。*实验指定使用经认证的微量滴定板振动器或旋转器进行免疫学操作。这些设备可以从大多数实验室购买，不需要在公司买。或者你也可以直接在我们公司购买经验证的，预校准的微量滴定板振动器。如果你没有这样的装置，可以直接在板中孵育，不需要震荡，但要将免疫孵育时间延长到一个小时左右来达到使用振荡器所达到的效果。孵育时的前30min不要振荡，否则会造成背景污染或降低精确度。*将所有试剂放到室温下。设置板的分光光度计的测试波长为450nm，650nm处的读数为作为参考。*彻底清洗是保证本实验性能的必不可少的步骤。我们强烈建议不要使用自动化或其他真空吸尘装置清洗

15、板。本实验推荐的手工清洗方法是保证精确性、敏感性和正确性的首选。关于此方法更详细的信息可以从公司的服务部门或网站获得。*所有标准品、对照品和样品至少应做一次重复实验。*实验板孔加入试剂的顺序应一致，以保证所有反应孔的孵育时间一致。*作一个工作记录，以确定检测时标准品、对照品和样品各自的位置。*建议您的实验室对每一个过程的对照品进行测试，以确保所有试剂和程序是正确的。强烈要求你用来自所用的细胞系的样品基质和HCP做一个典型样品矩阵作为对照。这些对照品可分装到单次使用的小瓶中，并保存在0度使其长时间保持稳定。*如果该底物具有明显的蓝颜色，可能是在检测之前已被污染。如果100L底物的吸光度加上以10

16、0L水为空白对照时的吸光度超过0.1，我们就需要更换新的底物，否则实验的敏感性会受影响。*应在加入终止液后的30min内读板，因为蛋白质着色会随着时间的推移而褪色。质量控制*重复样品的精确度用两者的平均百分比计算。在8-200ngmL的样品范围内，变异系数小于10%，而样品8 ng/ml时，变异系数可大于10%。*当以水为底物进行空白对照时，最佳吸光度应 0.1.*建议各实验室检测每个过程中的的质量控制样品，以确保所有试剂和程序是正确的。结果计算标准液可用于制作标准曲线，标准液浓度相当于免疫反应HCP总浓度。根据测定的小孔中标准液吸光值绘制标准曲线。数据分析可以使用计算机选配曲线，例如点到点、

17、三次样本函数或四参数逻辑曲线。不要使用线性回归分析修改样品吸光值，这样会出现显著误差。也可以手工绘图，Y轴标注吸光度，X轴标注浓度。然后根据样品吸光值计算出样品中HCP浓度。 实验步骤1. 分别移取50L标准液、对照物和样品至待测孔2. 移取100l anti-Vero Cell:HRP(#F501)至每孔3. 密封滴定板，摇床室温(24C + 4)温育2小时，180rmp4.直接倾到或用移液管轻轻吸走孔内溶液，并用吸水纸吸干残留液。350 L的清洗缓冲液冲洗四次。擦干微量滴定板外的液体，因为任何残留物都会影响读数。清洗缓冲液不能长时间停留在孔内。加TMB前不能让孔内干燥。5. 加100l T

18、MB 作用物(#F005)6. 室温静置30min,不需摇床7. 加100l反应终止液(#F006)8. 分光光度计450/650nm读数，以空白对照调零。范例孔含量抗体 450nm抗体量1A0标准品0.1121B0标准品0.1090.1111C2ng/mL0.1421D2ng/ml0.1410.1421E8ng/ml0.2051F8ng/ml0.2080.2071G25ng/ml0.4001H25ng/ml0.4210.4112A75ng/ml0.9572B75ng/ml1.0130.9852C200ng/ml2.2992D200ng/ml2.3162.3082E样品A0.2132F样品A0

19、.2090.2118.42G样品B0.9392H样品B0.9820.96172.9性质 Cygnus Technologies用传统方法对试剂盒性能进行了如下验证。如果需要的话，认证报告可从公司网站获得。此验证在本质上是通用的，并且是为了补充而不是替换某些用户和产品应该具有的由每个实验室进行的资格验证。但这些实验室必须对他们自己的样本做一次实验矫正。另外，本试验范围内产生的来源于HCPs的任何样品类型均应进行稀释线性以确保检测的准确性，并确定具有足够的抗体与你的HCPs充分反应。每个实验室和技术人员在要求精确性的检测过程中应该具有如下描述的能力。更多的建议做的验证程序可在公司服务部门或网站获得

20、。敏感度最低检测限（LOD）定义为比空白对照的平均值高两倍的样品浓度。LOD是 0.7 ng/mL.最低定量限（LOQ）被定义为浓度变化系数（CVS）是小于20%时可测到的最低浓度。 LOQ is 2 ng/mL。精确度组内（20个重复）和组间（10个实验）的精确度有3个水平（ 8ngml）、中（ 25ng/ml）、高浓度（ 75ngml）的检测结果决定。CV百分比为三个水平所测的平均值除以标准偏差再乘以100。水平组内CV组间CV低6.9% 4.4%中5.5% 3.7%高3.5% 3.6%特异性/交叉反应对4中商用的商业Vero细胞株进行1D Western blot and ELISA分析

21、 表明，在所有细胞系中大多数的蛋白质是保守的。因此此方法也可用来检测其他Vero细胞株的HCP。1D/2D Western blot与ELISA无关，且不能用银染或胶体金染色技术对非特异的蛋白进行染色。即使如此，银染结果和western blot结果不一致并不一定意味着没有抗那种蛋白的抗体或用 ELISA 不能检测到那种蛋白质。如果你想在检测试剂盒中抗体与 HCPs的反应时用比western blot更为敏感和特异的方法， Cygnus很高兴能够提供的服务和/或基于2D高效液相色谱法的 ELISA分析 HCPs的咨询。这种方法已被证明在检测HCP时具有更高的灵敏度和精确度。同样的用于捕获的抗体和HRP标签可以单独购买 如# VC 807-AF。 没有用这个试剂盒对非HCP成分的交叉反应