遗传标记STR基因座的高分辨电泳分型

1、遗传标记STR基因座的高分辨电泳分型姓名 摘要：STR（Short Tandem Repeat，短片段重复序列）广泛存在于人类及哺乳动物的基因组中，一般由26个碱基构成一个核心序列，核心序列串联重复排列。人群中这些重复序列具有多态性，通过对这种多态性的检测可以进行STR分型。本实验首先通过磁珠法提取人类基因组DNA，之后对3个STR基因座进行PCR扩增，然后用聚丙烯酰氨凝胶电泳技术（PAGE）对PCR产物进行分离，最后PCR产物用EB染色后在紫外灯下观察实验结果并对此进行分析。通过此次实验，我们掌握了遗传标记STR基因座的高分辨电泳分型的实验原理、实验操作和实验结果的观察分析，取得了良好的实验

2、效果。关键词：STR、磁珠法、PCR扩增、聚丙烯酰氨凝胶电泳技术（PAGE）1引言DNA指纹技术的发展经历了三代。第一代DNA指纹技术利用了DNA 指纹图谱。1984年英国莱斯特大学的遗传学家Jefferys及其合作者首次将分离的人源小卫星DNA用作基因探针，同人体核DNA的酶切片段杂交，获得了由多个位点上的等位基因组成的长度不等的杂交带图纹，这种图纹极少有两个人完全相同，故称为“DNA指纹”，意思是它同人的指纹一样是每个人所特有的。众多“DNA指纹”组成“DNA指纹图谱”。第二代DNA指纹技术用PCR的方法对STR位点进行PCR扩增可得到不同长度DNA片段，用银染或荧光的方法对扩增后的DNA

3、片段检测得到DNA指纹。第三代DNA指纹技术是用PCR的方法对SNP位点进行PCR扩增。STR（Short Tandem Repeat，短片段重复序列）广泛存在于人类及哺乳动物的基因组中，具有高度多态性。它们一般由26个碱基构成一个核心序列，核心序列串联重复排列，重复次数大多在1060次之间，由核心序列重复数目的变化产生长度多态性。对于一个特定的个体，染色体上某个特定位置的重复序列的重复次数是固定的，而对于不同的个体在同一位置处的重复次数可能不同，这就构成了人群中这些重复序列的多态性。由于人类基因组中这种重复序列非常多，通过对这种多态性的检测，就可以明确区分个体与个体的不同，确定父母子的亲缘关

4、系，这就是STR分型。由于STR具有分布广泛均匀、多态性丰富、信息量大、检测简便等优点，被认为是继限制性片段长度多态性（RFLP）之后的第二代遗传标记，已广泛应用于遗传图谱绘制、基因定位、法医鉴定、遗传病诊断等诸多领域。目前已经有DNA分型图谱。联合应用16个STR位点，其个体识别率可达0.999999999998。联合应用16个STR位点，其父权排除率可达0.99998。本次实验中人类基因组DNA的提取使用磁珠法核酸纯化技术。它采用了纳米级磁珠微珠，这种磁珠微珠的表面标记了一种官能团，能同核酸发生吸附反应。该方法快速简捷，一般可在36分钟内完成。不用多次漂洗磁珠也可确保基因组DNA的高纯度，

5、提取出的基因组DNA OD260/OD280典型的比值达1.71.9，长度可达20kb50kb，可直接用于PCR、Southern-blot和各种酶切反应。聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是体外核酸扩增技术，由变性、退火、延伸三个基本反应步骤构成。它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点，能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍，使肉眼能直接观察和判断。聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺（简称Acr）和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺（简称Bis）在加速剂N,N,N,N-四甲基乙二胺（简称TE

6、MED）和催化剂过硫酸铵（简称AP）或核黄素（C17H20O6N4)的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis，简称PAGE），用于分离蛋白质和寡核苷酸。核酸经过染色才能显示带型，最常用的是溴化乙锭染色法。溴化乙锭（EB）是一种荧光染料，这种扁平分子可以嵌入核酸双链的配对的碱基之间，与核酸形成络合物，在紫外线激发下，发出红色荧光。激发荧光的能量来源于两个方面，一是核酸吸收波长为260nm的紫外线后能将能量传送给溴化乙锭，二是结合在DNA分子中的EB本身，主要吸收波长为300nm和360

7、nm的紫外线的能量，来源于这两方面的能量，最终激发EB发射出波长为590nm的可见光谱红橙区的红色荧光，发射波长为605nm。EB-DNA复合物中的EB发出的荧光，比游离的凝胶中的EB本身发出的荧光强大10倍，因此不需要洗净背景就能清楚地观察到核酸的电泳带型。此次实验首先通过磁珠法提取人类基因组DNA，之后对3个STR基因座进行PCR扩增，然后用聚丙烯酰氨凝胶电泳技术（PAGE）对PCR产物进行分离，最后将PCR产物用EB染色，在紫外灯下观察实验结果并对此进行分析。2材料和方法2.1 材料、试剂和器材实验材料：人类口腔上皮细胞实验试剂：饮用水或自来水、Buffer MACL、Buffer MC

8、L、Proteinase K、Buffer MA、MagicMag Beads、70%乙醇、TE(pH8.0)、碎冰、ddH2O、10×PCR缓冲液（含MgCl2）、2.5mmol/L dNTP、10 mol/L 引物（D1S1677-F、D1S1677-R、D4S2364-F、D4S2364-R、D10S1248-F、D10S1248-R）、1U/lTaq酶溶液、1%琼脂（糖）、10×TBE、30%聚丙烯、APS、TEMED、电极缓冲液、6×loading buffer、20bp DNA Ladder、溴化乙锭（EB）实验仪器：10 mL离心管、1.5 mL离心

9、管、台式高速离心机、微量移液器、蓝枪头、黄枪头、白枪头、恒温水浴锅、磁力架、PCR管、PCR仪、marker笔、贮槽、螺丝销钉、长玻璃板、短玻璃板、“凵”形硅橡胶框、细长头的滴管、电泳仪、紫外灯凝胶成像仪2.2 方法2.2.1磁珠法提取人类基因组DNA（1）漱口。用10mL饮用水或自来水持续用力漱口，之后将其收集于10mL离心管中，2000 rpm离心5 min，将上清液小心用微量移液器吸除，沉淀为收集得到的口腔脱落细胞。（2）裂解。向细胞沉淀中加入400L Buffer MACL，200L Buffer MCL和20L Proteinase K，用微量移液器反复吸打，均匀悬浮起细胞沉淀。然后

10、将其转移至1.5 mL离心管中。65水浴2030min。12000rpm离心510min，小心取出500L上清至新的离心管中。（3）结合。向样品中加入400L Buffer MA和10LMagicMag Beads。剧烈颠倒震荡混匀10s。在加入MagicMag Beads之前，要将MagicMag Beads充分颠倒混匀。务必将MagicMag Beads加至液面以下，并尽量将枪头上残留的MagicMag Beads吸打干净。震荡后如管口沾有少量beads，用微量移液器吸取上清液并将其冲洗至离心管内。（4）磁吸附。将离心管至于磁力架上2 min，待MagicMag Beads全部吸至离心管壁

11、上，用微量移液器吸弃上清，然后从磁力架上取出离心管。吸弃上清时尽量吸净，但要避免吸入Beads。（5）洗涤。加入700L70%乙醇，颠倒震荡混匀10 s。震荡后如管口沾有少量beads，用微量移液器吸取上清液并将其冲洗至离心管内。将离心管置于磁力架上1 min，待MagicMag Beads全部吸至离心管壁上后，用微量移液器吸弃上清，然后从磁力架上取出离心管。吸弃上清时尽量吸净，但要避免吸入Beads。（6）重复步骤（5）一次。（7）干燥。干燥前应尽量吸净上清，若出现液体挂壁现象，可将离心管短暂离心后，再次将其至于磁力架上1 min，待MagicMag Beads全部吸至离心管壁上，用微量移液

12、器吸净上清，然后从磁力架上取出离心管。室温开盖干燥15 min（或者放入37的温箱中，放入时间不得超过5min）。（8）洗脱。加入20L TE(pH8.0)，用枪头吸打混匀，将管壁上所有Beads都悬浮于TE溶液中。65水浴10 min，间或摇匀，使DNA充分洗脱。（9）取出离心管，短暂离心，置于磁力架上1 min，用微量移液器小心吸取上清至新的离心管，即获得基因组DNA。2.2.2 PCR扩增人类的3个STR基因座片段（1）取3个PCR管，冰上操作，按照表一的加样顺序和加样量，构建3个样品反应体系。每个样品反应体系均为25L。表一PCR反应体系的构建加样顺序成分体积（L）1ddH2O1621

13、0×PCR缓冲液（含MgCl2）2.532.5mmol/L dNTP1410 mol/L 引物11510 mol/L 引物2161U/lTaq酶溶液0.57DNA样品3合计25（2）以上成分加好后，盖上PCR管管盖，在管壁和管盖上做好标记。将PCR管稍稍离心集液于管底，之后进行PCR反应。（3）按照表二中所示的PCR反应中各项目所需的温度和时间进行PCR反应。1循环35次表二 PCR各项目所需的温度和时间项目温度时间预变性9411min变性941 min复性59.41min延伸722min终延伸6030min保存102.2.3 用聚丙烯酰氨凝胶电泳技术（PAGE）对3个STR基因座P

14、CR产物进行分离（1）安装夹心式垂直板电泳槽。装上贮槽和固定螺丝销钉，仰放在桌面上。将长、短玻璃板分别插到“凵”形硅橡胶框的凹形槽中，勿用手接触灌胶面的玻璃。将已插好玻璃板的凝胶模平放在上贮槽上，短玻璃板应面对上贮槽。将下贮槽的销孔对准已装好螺丝销钉的上贮槽，双手以对角线的方式旋紧螺丝帽。竖直电泳槽。在长玻璃板下端与硅胶模框交界的缝隙内加入已融化的1%琼脂（糖）。凝固后的琼脂（糖）中应避免有气泡。（2）制胶。配制36mL8%的PAGE凝胶，其标准配方如表三所示。表三8%的PAGE凝胶标准配方成分体积ddH2O22.8mL10×TBE3.6 mL30%聚丙烯9.6mLAPS200

15、81;LTEMED40µL（3）制备1mm凝胶板。将混合后的分离胶溶液，用细长头的滴管加至长、短玻璃板间的窄缝内，距短玻璃上缘0.5 cm处，轻轻加入样品槽模板。约3060 min凝胶完全聚合。加入电极缓冲液，使液面没过短玻璃板约0.5 cm，轻轻取出样品槽模板，即可加样。（4）样品的处理及加样。向PCR后得到的样品中加入5µL 6×loading buffer，混匀后取7µL加入到点样孔中。另外还要向点样孔中加入DNA marker，即20bp DNA Ladder。（5）电泳与DNA分离开启电泳仪电源。选择合适的电压（180V）和时间（90min）。

16、将电泳槽电极与电泳仪连接。电泳槽红色电极为正极，与电泳仪正极相连。电泳槽黑色电极为负极，与电泳仪负极相连。启动电泳，待观察到负极有气泡升起方可离开。电泳结束，关闭电源，取出凝胶。EB染色10min。凝胶成像仪成像，观察电泳结果，摄片，保存，分析。3结果（1）此次实验对人类基因组中3个STR基因座片段进行PCR扩增和分离，用到3组相应的引物。这3个STR基因座片段的相关遗传学参数如表四所示。表四 3个STR基因座片段相关遗传学参数基因座染色体定位核心序列引物名称PCR产物大小（bp）等位基因基因型在中国人群中的杂合性（H0）D1S1677chr 1(GGAA)nD1S1677-FD1S1677-

17、R8111771206609D4S2364chr 4(GAAT)n (GGAT)n(GAAT)nD4S2364-FD4S2364-R678351007478D10S1248chr10(GGAA)nD10S1248-FD10S1248-R8312381607652 本次实验选取这3个STR基因座片段的原因是其在中国人群中的杂合性（H0）较高，即较多人具有这3个STR基因座片段，从而最终得到实验结果的可能性较大。 这3个STR基因座片段分别在人类第1对、第4对、第10对染色体上，即均在常染色体上，与性别无关。这3个STR基因座片段PCR产物大小分别是81117bp、6783bp、83123bp，此

18、次实验中聚丙烯酰氨凝胶电泳（PAGE）可以分离80110bp的DNA片段，基本与这3个STR基因座片段PCR产物大小接近。（2）这3个STR基因座片段聚丙烯酰氨凝胶电泳实验结果如图一所示。123456图一STR基因座片段聚丙烯酰氨凝胶电泳实验结果 本次实验使用的DNA marker是20bp DNA Ladder，该制品是由20bp至200bp间隔为20bp的10条片段和300bp、400bp、500bp共13条双链DNA片段组成。其中100 bp、200 bp、500 bp是指示带，显示亮带，其它片段亮度相同。图一中泳道1、泳道2、泳道6加的样品是20bp DNA Ladder。泳道1中的2

19、0bp DNA Ladder条带不明显，可能原因是加样量较少或者点样时间较长导致20bp DNA Ladder弥散。泳道2和泳道6中的20bp DNA Ladder条带明显。泳道2和泳道6中可以清楚地看到从上到下3条亮带，对应的DNA片段大小分别是500 bp、200 bp和100 bp。另外其他10条DNA片段也能清楚地看到。总之，泳道2和泳道6中的20bp DNA Ladder在此次聚丙烯酰氨凝胶电泳中跑出的条带很好。泳道3加的是我的STR基因座片段D1S1677，图一中可以看到1条很明显的条带，位于20bp DNA Ladder100 bp条带附近（图一中已用“”标出），说明该条带对应的

20、DNA片段大小是100 bp左右。从表四可以看出，D1S1677基因座对应的STR片段PCR产物大小是81117bp，说明该DNA片段符合理论情况。泳道4加的是我的STR基因座片段D4S2364，图一中可以看到2条很明显的条带。一条条带位于20bp DNA Ladder 80bp条带附近（图一中已用“”标出），说明该条带对应的DNA片段大小是80bp左右。从表四可以看出，D1S1677基因座对应的STR片段PCR产物大小是6783 bp，说明该DNA片段符合理论情况。不过，另一条条带位于20bp DNA Ladder 40 bp和60 bp之间并且靠近40 bp（图一中已用“”标出），说明该条

21、带对应的DNA片段大小是40 bp50 bp，没有在D1S1677基因座对应的STR片段理论PCR产物大小的范围内，说明该片段有可能是其他DNA片段。泳道5加的是我的STR基因座片段D10S1248，图一中可以看到从上到下4条较暗的条带。从上到下第1条条带位于20bp DNA Ladder140 bp条带附近（图一中已用“”标出），说明该条带对应的DNA片段大小是140 bp左右。从上到下第2条条带位于20bp DNA Ladder100 bp条带稍靠上处（图一中已用“”标出，该方框中有两条条带），这说明该条带对应的DNA片段大小比100 bp稍大。从上到下第3条条带位于20bp DNA La

22、dder100 bp条带稍靠下处（图一中已用“”标出，该方框中有两条条带），这说明该条带对应的DNA片段大小比100 bp稍小。从上到下第4条条带位于20bp DNA Ladder 40 bp和60 bp中间附近位置处（图一中已用“”标出），这说明该条带对应的DNA片段大小是50 bp左右。从表四可以看出，D10S1248基因座对应的STR片段PCR产物大小是83123bp，因此泳道5中从上到下第2条带和第3条条带对应的DNA片段符合理论情况。泳道5中从上到下第1条带和第4条条带有可能是其他DNA片段。在此次实验中，我分别构建了3个PCR反应体系，分别对D1S1677、D4S2364和D10S

23、1248这3个STR基因座片段进行PCR扩增，分别对应泳道3、泳道4和泳道5中的实验结果。理论上在每个泳道中会出现12条与理论位置对应的条带，出现1条条带说明在细胞染色体中该STR基因座片段有1种，出现2条条带说明在细胞染色体中该STR基因座片段有2种。这样3个泳道共计会出现36条与理论位置对应的条带。但是电泳实验结果表明可能存在其他DNA片段的干扰导致出现理论范围以外的其他条带。4讨论本实验首先通过磁珠法提取人类基因组DNA，之后对3个STR基因座片段（D1S1677、D4S2364和D10S1248）进行PCR扩增，然后用聚丙烯酰氨凝胶电泳技术（PAGE）对PCR产物进行分离，最后PCR产

24、物用EB染色后在紫外灯下观察实验结果并对此进行分析。在此次实验中，我分别构建3个PCR反应体系，分别对D1S1677、D4S2364和D10S1248这3个STR基因座片段进行PCR扩增，然后在3个泳道中分别点样3种样品。理论上在每个泳道中会出现12条与理论位置对应的条带。出现1条条带说明在细胞染色体中该STR基因座片段有1种，即说明在两条常染色体中该基因座片段相同，也就是说来自父母亲的该基因座片段相同。出现2条条带说明在细胞染色体中该STR基因座片段有2种，即说明在两条常染色体中该基因座片段不同，也就是说来自父母亲的该基因座片段不同。这样3个泳道共计会出现36条与理论位置对应的条带。但是电泳

25、实验结果表明可能存在其他DNA片段的干扰导致出现理论范围以外的其他条带。本次实验的关键点是实验原理要搞清楚，这样才会做到心中有数，较好地完成此次实验。对于此次实验中其他需要注意的地方如下所示：（1）此次实验中人类基因组DNA的提取用的是磁珠法。在此方法中，首先裂解液或蛋白酶K可以迅速裂解细胞并灭活细胞内的核酸酶；其次通过一系列快速的漂洗-分离的步骤，去除细胞代谢物、蛋白等杂质；之后基因组DNA可以选择性吸附于磁珠；最后用双蒸水即可将纯净基因组DNA从磁珠上洗脱。整个提取基因组DNA的过程操作简单，省时省力。（2）在“磁珠法提取人类基因组DNA”中，步骤（2）中加入Buffer MACL、Buf

26、fer MCL和Proteinase K的作用是裂解细胞。步骤（3）中加入MagicMag Beads之前，要将MagicMag Beads充分颠倒混匀；另外务必将MagicMag Beads加至液面以下，并尽量将枪头上残留的MagicMag Beads吸打干净。步骤（3）、步骤（5）、步骤（6）中震荡后如管口沾有少量beads，用微量移液器吸取上清液并将其冲洗至离心管内。步骤（3）中加入Buffer MA的作用是协助磁珠吸附DNA。步骤（4）、步骤（5）、步骤（6）中用微量移液器吸弃上清时尽量吸净，但要避免吸入Beads。步骤（7）中干燥前应尽量吸净上清，若出现液体挂壁现象，可将离心管短暂离

27、心后，再次将其至于磁力架上1 min；另外室温开盖干燥15 min也可以选择放入37的温箱，不过放入时间不得超过5min，这一步晾干的目的是使乙醇挥发，因为残留的乙醇会对实验造成影响。步骤（8）中加入TE的作用是溶解DNA。（3）提取出的人类基因组DNA可以在室温放置24h后再进行PCR扩增，这比立即进行PCR扩增的效果好，原因是在室温放置24h后DNA与水分子充分水合，使DNA结构更好，易于进行PCR扩增。（4）PCR标准反应体系中有ddH2O、反应缓冲液、dNTP、引物、耐热聚合酶和DNA模板。DNA模板对PCR扩增的影响有：纯度，蛋白质、多糖、酚类等杂质会抑制PCR反应；完整性，DNA模

28、板降解会导致PCR扩增无产物； 浓度，DNA模板加量过多导致非特异性扩增增加。引物对PCR扩增的影响有：特异性，引物的长度要适当，避免二级结构和二聚体的出现；完整性，引物要避免反复冻融； 浓度，引物的浓度应适当，浓度过高导致非特异性增加，浓度过低则导致扩增产物太少。反应缓冲液在PCR反应过程中起到稳定剂和增强剂的作用，其对PCR扩增的影响有：pH值，盐离子浓度。在反应缓冲液中，Mg2+浓度过高会导致PCR非特异性严重，过低会导致无扩增产物。dNTP Mixture要注意浓度适当和避免反复冻融，ddH2O要注意pH值适当和避免污染。选择最合适的DNA聚合酶要看其特性，包括纯度、稳定性和酶活性。（5）此次实验中建议分别构建3个PCR反应体系，分别对D1S1677、D4S2364和D10S1248这3个STR基因座片段进行PCR扩增，这样更容易得到实验结果。在此次实验的PCR反应体系的构建中，缓冲液要含有Mg2+。PCR反应条件的设定中预变性的条件是94 10min，这是因为人类的基因组较大，需要的变性时间长。如果PCR反应没有扩增出目的DNA片段，首