第九章 蛋白质和氨基酸的测定

1、食品分析食品分析2一、概述二、凯氏定氮法三、蛋白质的快速测定法四、氨基酸总量的测定五、氨基酸的分离与测定3（一）食品中的蛋白质含量各种不同食品的蛋白质含量各不相同，一般动物性食品的蛋白质含量高于植物性食品。 4（一）食品中的蛋白质含量食品中的蛋白质含量(g/100g)牛肉 猪肉 兔肉 鸡肉 20 9.5 21 20大豆 米 面粉 菠菜 苹果 40 8.5 10 2.4 0.45（二）蛋白质的生理功用及在食品中的作用构成人体的重要成分；构成体内多种具有重要生理功能的物质；参与调节和维持体内的酸碱平衡及胶体渗透压；参与神经冲动的传导、思维活动和遗传信息的传递； 提供能量；食品的重要营养指标。6是人

2、类及所有动物赖以生存的营养要素。当饮食中蛋白质不足时，可引起儿童生长发育迟缓或体重减轻、肌肉萎缩；成人容易产生疲劳、贫血、创伤不易愈合、对传染病抵抗力下降和病后恢复缓慢等症状。多种食物蛋白质混合食用时，其所含的氨基酸之间可取长补短，相互补充，从而提高了食物蛋白质的营养价值。两种以上非优质蛋白质混合食用，或在非优质蛋白质的食品中加入少量完全蛋白质，其营养价值也可提高。各种氨基酸必须同时摄取，才能达到最高利用率。（二）蛋白质的生理功用及在食品中的作用7（三）蛋白质系数 蛋白质是复杂的含氮有机化合物，一般蛋白质含氮量为16，即一份氮素相当于6.25份蛋白质，此数值（6.25）称为蛋白质系数，不同种类

3、食品的蛋白质系数有所不同。8（三）蛋白质系数样品样品蛋白质系数蛋白质系数样品样品蛋白质系数蛋白质系数小麦粉及其制品5.70畜禽肉及其制品6.25全麦5.83芝麻5.30大米5.95乳类6.38花生5.46黄豆5.719蛋白质测定方法凯氏定氮法蛋白质快速测定法10（一）凯氏定氮法（GB/T 5009.5-2003) 凯氏定氮法是通过测出样品中的总含氮量再乘以相应的蛋白质系数而求出蛋白质的含量，由于样品中含有少量非蛋白质，用凯氏定氮法通过测总氮量来确定蛋白质含量，包含了核酸、生物碱、含氮类脂、卟啉、以及含氮色素等非氮蛋白质含氮化合物，所以这样的测定结果称为粗蛋白。11（一）凯氏定氮法（GB/T 5

4、009.5-2003)The Kjeldahl Procedure凯氏法的程序凯氏法的程序 1. Digestion step 消化消化2. Distillation step 蒸馏蒸馏3. Titration step 滴定滴定12（一）凯氏定氮法（GB/T 5009.5-2003)原 理2NH2(CH2)2COOH+13H2SO4(NH4)2SO4+6CO2+12SO2+16H2O 消化 (NH4)2SO4+2NaOH2NH3+Na2SO4+2H2O 蒸馏 4225)(5)(423342742427424333BOHClNHHClOHOBNHOHOBNHBOHNH滴定浓硫酸具有脱水性，使有

5、机物脱水后被炭化为碳、氢、氮。浓硫酸又具有氧化性，将有机物炭化后的碳化为二氧化碳，硫酸则被还原成二氧化硫。 2H2SO4 C 2SO2 2H2O CO213（一）凯氏定氮法（GB/T 5009.5-2003)仪 器凯氏烧瓶、可调式电炉、蒸汽蒸馏装置14（一）凯氏定氮法（GB/T 5009.5-2003)试 剂（1）硫酸铜（CuSO45H2O）；（2）硫酸钾；（3）浓硫酸:密度为1.8419 g/L（4）氢氧化钠溶液:400g/L（5）硼酸溶液:20g/L（6） 0.05 molL盐酸标准滴定溶液 （7）95%乙醇。（8）混合指示液：1份甲基红乙醇溶液(1 g/L)与5份溴甲酚绿乙醇溶液(1 g

6、/L)临用时混合。也可用2份甲基红乙醇溶液(1 g/L)与1份亚甲基蓝乙醇溶液(1 g/L)临用时混合。甲基红-溴甲酚绿 pH 5.0 以下为暗红色，pH 5.1 为灰绿色， pH 5.2 以上为绿色。 甲基红-亚甲基蓝混合指示液： 变色点pH=5.4，5.2（红紫）5.4（灰蓝）5.6（绿）， 15（一）凯氏定氮法（GB/T 5009.5-2003)操作方法（1）样品消化样品+0.2g硫酸铜+6g硫酸钾+20ml浓硫酸+玻珠数粒先小火炭化，无泡沫后，加大火力，液体变蓝绿透明，继续加热微沸30分钟45度角消化终点瓶口不能对着人盖上小漏斗样品消化蒸馏滴定16（一）凯氏定氮法（GB/T 5009.

7、5-2003)操作方法（2）蒸馏按下图连接好蒸馏装置图加水至2/3体积处，加数滴甲基橙指示剂和硫酸几毫升，使水呈酸性夹紧螺旋夹加热蒸汽发生瓶中的水，检查整套装置是否有漏气现象，不能漏气。水蒸气与生成的氨气共沸，不断移除氨气，使反应继续。17（一）凯氏定氮法（GB/T 5009.5-2003)操作方法（2）蒸馏将消化液全部转移到100ml容量瓶中加10ml硼酸溶液和混合指示剂23d加入NaOH溶液后颜色为深蓝色或褐色通入蒸汽开始蒸馏冷凝管下口浸入硼酸溶液中取10ml消化稀释液沿小玻璃杯移入反应室，少量蒸馏水冲洗，塞紧棒状玻璃塞，向小玻璃杯内加入10ml40%NaOH,提起玻璃塞，使NaOH缓慢流

8、入反应室，立即塞紧玻璃塞，并在小玻璃杯中加水使之密封。18（一）凯氏定氮法（GB/T 5009.5-2003)操作方法（2）蒸馏吸收液变蓝色后继续蒸馏5分钟，将冷凝管尖端提离液面再蒸馏1min，用蒸馏水冲洗冷凝管尖端，取下接收瓶，关闭电源19（一）凯氏定氮法（GB/T 5009.5-2003)操作方法（3）滴定取下接收瓶，用0.1000mol/L的盐酸或硫酸标准溶液滴定至灰色或蓝紫色为终点。滴定前滴定终点同时做一试剂空白实验，记录空白滴定消耗盐酸的体积。20（一）凯氏定氮法（GB/T 5009.5-2003)0.014表示1.0盐酸标准滴定溶液相当氮的含量F表示蛋白质系数计算结果保留三位有效数

9、字计 算10010010014. 0)(=%2-1FmVVc）蛋白质（21（一）凯氏定氮法（GB/T 5009.5-2003)（1）试剂溶液应用无氨蒸馏水配制（2）消化时不要用强火，应保持缓和沸腾，消化中不时转动凯氏烧瓶，以便冷凝酸液洗下附在瓶壁上的固体残渣，促进其消化完全。（3）为加速消化，常加入 硫酸钾：可提高消化体系溶液温度 硫酸铜：催化剂、消化终点指示剂、蒸馏时碱性反应指示剂说明及注意事项22（一）凯氏定氮法（GB/T 5009.5-2003)说明及注意事项 加入硫酸钾可以提高溶液的沸点而加快有机物的分解，它与硫酸作用生成硫酸氢钾可提高反应温度其反应式如下： K2SO4+H2SO4=2

10、KHSO4 2KHSO4=K2SO4+H2O+SO3一般纯硫酸的沸点在340摄氏度左右，而添加硫酸钾后，可使温度提高到4000C以上，原因主要在于随着消化过程中硫酸不断地被分解，水分不断逸出而使硫酸钾浓度增大 ，故沸点升高。但硫酸钾加入量不能太大，否则消化体系温度过高，又会引起已生成的铵盐发生热分解而造成损失： （NH4）2SO4=NH3+(NH4)HSO4 2(NH4)HSO4=2NH3+2SO3+2H2O硫酸钾的作用23（一）凯氏定氮法（GB/T 5009.5-2003)说明及注意事项硫酸铜的作用 催化剂 2CuSO4=CuSO4+SO2+O2 CO2+2CuSO4=Cu2SO4+SO2+

11、O2 Cu2SO4+2H2SO4=2CuSO4+2H2O+SO2 此反应不断进行，待有机物被消化完后，不再有硫酸亚铜（褐色）生成，溶液呈现清澈的蓝绿色。 可以指示消化终点的到达 下一步蒸馏时作为碱性反应的指示剂。24（一）凯氏定氮法（GB/T 5009.5-2003)（4）样品中若含较多脂肪或糖，在开始消化时应用小火加热，并时时摇动；或者加入少量辛醇或液体石蜡或硅油消泡剂，并同时注意控制热源强度。（5）当样品消化液不易澄清透明时，可将凯氏烧瓶冷却，加入30%过氧化氢23ml后再继续加热消化。（6）若取样量较大，如干试样超过5g，可按每克试样5ml的比例增加硫酸用量。（7）一般消化至呈透明后，继

12、续消化30分钟即可，一般消化时间约4小时，时间延长可能引起氨的损失。有机物如分解完全，消化液呈蓝色或浅绿色，但含铁量多时，呈较深绿色。说明及注意事项25（一）凯氏定氮法（GB/T 5009.5-2003)（8）蒸馏装置不能漏气（9）蒸馏前若加碱量不足，消化液呈蓝色不生成氢氧化铜沉淀，需再增加氢氧化钠用量（10）硼酸吸收液的温度不应超过40，否则对氨的吸收作用减弱，置于冷水浴中使用。（11）蒸馏完毕后，应先将冷凝管下端提离液面,清洗管口，再蒸1分钟后关掉热源，否则可能造成吸收液倒吸。说明及注意事项26（一）凯氏定氮法（GB/T 5009.5-2003)自动凯氏定氮仪法 在凯氏定氮法的基础上发展起

13、来的自动凯氏定氮仪法，具有安全、高效、准确的优点。消化炉自动蒸馏装置27（一）凯氏定氮法（GB/T 5009.5-2003)自动凯氏定氮仪法FOSS 产品线化学分析仪器化学分析类仪器：Kjeltec系列定氮仪28（一）凯氏定氮法（GB/T 5009.5-2003)自动凯氏定氮仪法FOSS 产品线化学分析仪器化学分析类仪器：Tecator系列消化器29（一）凯氏定氮法（GB/T 5009.5-2003)自动凯氏定氮仪法Digestion Blocks 消化炉Auto 20 and Auto 8250/400ml. 和100ml. Basic 20 and Basic 8250/400ml和100

14、mlpAuto 40n100ml30（一）凯氏定氮法（GB/T 5009.5-2003)自动凯氏定氮仪法Lift, Exhaust Manifold and Scrubber消化炉、升降装置、排废罩和涤气装置31（一）凯氏定氮法（GB/T 5009.5-2003)自动凯氏定氮仪法New generation of Kjeltec Systems新一代凯氏定氮仪-前所未有的智能化系统！32（一）凯氏定氮法（GB/T 5009.5-2003)自动凯氏定氮仪法KjeltecTM 8100 凯氏定氮仪自动添加稀释液和碱，自动进行蒸馏和结束蒸馏，自动进行消化管排空，操作简便。专利的SAfE*技术保证在消

15、化管中有酸/盐结晶时的安全蒸馏。 内置的安全系统保证操作者的安全。馏出液的温度控制系统保证分析结果准确可靠。 风箱泵精确添加试剂，保证准确性。33（一）凯氏定氮法（GB/T 5009.5-2003)自动凯氏定氮仪法KjeltecTM 8200 凯氏定氮仪包含KjeltecTM 8100 所有的特征，另加：自动添加接收液自动安全门可增加模块升级到全自动凯氏定氮仪34（一）凯氏定氮法（GB/T 5009.5-2003)自动凯氏定氮仪法KjeltecTM 8400 凯氏定氮仪包括 KjeltecTM 8200的所有特征，外加： 滴定、计算和报告。可升级和20或60位自动进样器连用，进行无人值守的全自

16、动化操作。局域网连接方式能够和打印机及天平进行无障碍连接。彩色触摸屏。通过可选计算机数据管理软件Compass实现完全由计算机控制样品注册和报告。35（一）凯氏定氮法（GB/T 5009.5-2003)自动凯氏定氮仪法KjeltecTM 8420 自动进样器20位自动进样器，可容纳一个20位消化管架250ml和400ml消化管都可用于系统将消化管架直接装入进样器，不需要转移消化管或消化好的样品36（一）凯氏定氮法（GB/T 5009.5-2003)自动凯氏定氮仪法KjeltecTM 8460 自动进样器60位自动进样器，可容纳3个20位消化管架250ml和400ml消化管都可用于系统将消化管架

17、直接装入进样器，不需要转移消化管或消化好的样品37（二）蛋白质快速测定法双缩脲法紫外分光光度法染料结合法水杨酸比色法 38（二）蛋白质快速测定法1、双缩脲法原 理 当脲被小心地加热至150160时，可由两个分子间脱去一个氨分子而生成二缩脲（也叫双缩脲），反应如下：150 160222223H NCONH +H-N(H)-CONHH NCONHCONH +NH C39（二）蛋白质快速测定法1、双缩脲法原 理 双缩脲与碱及少量硫酸铜溶液作用生成紫红色的配合物，此反应称为双缩脲反应： 由于蛋白质分子中含有肽键（-CO-NH-），与双缩脲结构相似，故也能呈现此反应而生成紫红色配合物，在一定条件下其颜色

18、深浅与蛋白质含量成正比，据此可用吸收光度法来测定蛋白质含量，该配合物的最大吸收波长为560nm； 本法灵敏度较低，但操作简单快速，故在生物化学领域中测定蛋白质含量时常用此法； 本法亦适用于豆类、油料、米谷等作物种子及肉类等样品测定。40（二）蛋白质快速测定法1、双缩脲法方法特点及应用范围41（二）蛋白质快速测定法1、双缩脲法操作方法标准曲线的制作按蛋白质含量40mg、50mg、60mg、70mg、80mg、90mg、100mg、110mg 分别称取混合均匀的标准蛋白质8 支50mL 纳氏比色管中各加入1mL 四氯化碳用碱性硫酸铜溶液准确稀释至50mL振摇10min静置1h取上层清液离心5min

19、取离心分离后的透明液于比色皿中以蒸馏水作参比液调节仪器零点并测定各溶液的吸光度A560nm 波长蛋白质的含量为横坐标，吸光度A 为纵坐标绘制标准曲线。以采用凯氏定氮法测出蛋白质含以采用凯氏定氮法测出蛋白质含量的样品作为标准蛋白质样量的样品作为标准蛋白质样 准确称取样品适量（即使得蛋白质含量在40110mg 之间）于50mL纳氏比色管中，加1mL 四氯化碳，按上述步骤显色后，在相同条件下测其吸光度A。用测得的A 值在标准曲线上即可查得蛋白质毫克数，进而由此求得样品中的蛋白质含量。42（二）蛋白质快速测定法1、双缩脲法操作方法样品的测定式中 c由标准曲线上查得的蛋白质质量，mg； m样品质量，g。

20、43（二）蛋白质快速测定法1、双缩脲法结果计算100/100 )cmggm蛋白质（ 蛋白质的种类不同，对发色程度影响不大。 标准曲线制作完整后，无需每次再作标准曲线。 含脂肪高的样品应预先用醚抽出弃去。 样品中有不溶性成分存在时，会给比色测定带来困难，此时可预先将蛋白质抽出后再进行测定。 当肽链中含有脯氨酸时，若有多量糖类共存，则显色不好，会使测定值偏低。 碱性硫酸铜溶液由0.1mol氢氧化钾、5g 酒石酸钾钠、1.6g 硫酸铜溶于水后加水至1000mL配成。44（二）蛋白质快速测定法1、双缩脲法说明及注意事项 蛋白质(或多肽)分子中含有酪氨酸或色氨酸，能与Folin-酚试剂起氧化还原反应，生

21、成蓝色化合物，蓝色的深浅与蛋白质浓度成正比，可用比色法测定蛋白质浓度。是检测可溶性蛋白质含量最灵敏的经典方法之一。45（二）蛋白质快速测定法2、福林-酚比色法原 理 吸取一定量的样品稀释液，加入试剂甲，置于25中水浴保温10min，再加入试剂乙，立即混匀，保温30min，以介质溶液调零，测定A750nm 值，与蛋白质标准液作对照，求出样品的蛋白质的含量。 本法在060mg/L 蛋白质范围呈良好线性关系。46（二）蛋白质快速测定法2、福林-酚比色法测 定 考马斯亮蓝G250 是一种蛋白质染料，与蛋白质通过范德华引力结合，使蛋白质染色，在620nm 处有最大吸收值，可用于蛋白质的定量测定。此法简单

22、而快速，适合大量样品的测定，灵敏度与福林酚法相似，但不受酚类、游离氨基酸和小分子的影响。47（二）蛋白质快速测定法3、考马斯亮蓝染料比色法原 理 吸取样品稀释液2mL，加染料试剂2mL，混匀，以介质溶液调零，测定A620nm，与蛋白质标准溶液对照，求出样品蛋白质含量。 本法在0100mg/L 蛋白质范围内呈良好的线性关系。48（二）蛋白质快速测定法3、考马斯亮蓝染料比色法测 定49氨基酸态氮的测定双指示剂甲醛滴定法：原理、试剂、测定方法、结果计算、说明电位滴定法：原理、试剂、仪器、测定方法、结果计算50（一）双指示剂甲醛滴定法原 理 氨基酸具有酸性的-COOH基和碱性的-NH2基。它们相互作用

23、而使氨基酸成为中性的内盐。当加入甲醛溶液时，-NH2基与甲醛结合，从而使其碱性消失。这样就可以用强碱标准溶液来滴定-COOH基，并用间接的方法测定氨基酸的总量。51（一）双指示剂甲醛滴定法适用范围 适用于发酵工业，如发酵液中含氮量，其发酵过程中氮量减少情况及食品中游离氨基酸的测定等。试 剂 40%中性甲醛溶液：以百里酚酞作指示剂，用氢氧化钠将40%甲醛中和至蓝色。 0.1%百里酚酞乙醇溶液， 0.1%中性红50%乙醇溶液， 0.1 mol/L 氢氧化钠标准溶液。52（一）双指示剂甲醛滴定法操作方法 移取含氨基酸约2030mg的样品溶液2份，分别置于250ml锥形瓶中，各加50ml 蒸馏水，其中

24、1份加入3滴中性红指示剂，用0.1mol/L氢氧化钠标准溶液滴定至由红变为 琥珀 色为终点；另1份加入3滴百里酚酞指示剂及中性甲醛20ml，摇匀，静置1分钟，用0.1ml/L氢氧化钠标准溶液滴定至淡蓝色为终点。分别纪录两次所消耗的碱液ml数。53（一）双指示剂甲醛滴定法结果计算 氨基酸态氮（%）100014. 0)(12mcVV式中c 氢氧化钠标准溶液的浓度，mol/L;V1用中性红作指示剂滴定时消耗氢氧化钠标准溶液的体积，mL;V2用百里酚酞作指示剂滴定时消耗氢氧化钠标准溶液的体积，mL;m测定用样品溶液相当于样品的质量，g0.014氮的毫摩尔质量，g/m mol54（二）电位滴定法原 理

25、根据氨基酸的两性作用，加入甲醛以固定氨基的碱性，使羧基显示出酸性，将酸度计的玻璃电极及甘汞电极同时插入被测液中构成电池，用氢氧化钠标准溶液滴定，依据酸度计指示的pH值判断和控制滴定终点。55试验步骤 吸取含氨基酸约20mg的样品溶液，置于100mL容量瓶中，加水至刻度，混匀后吸取20.0mL烧杯中，加60mL水，开动磁力搅拌器，用0.05mol/L氢氧化钠标准溶液滴定至酸度计指示pH8.2（记下消耗0.05mol/L氢氧化钠标准溶液的毫升数，可计算总酸含量）。 加入0.1mL甲醛溶液，混匀。再用0.05mol/L氢氧化钠标准的溶液继续滴定至pH9.2，记下消耗0.05mol/L氢氧化钠标准溶液

26、的毫升数。 同时取80mL水，先用0.05mol/L氢氧化钠溶液调节至pH为8.2，再加入10.0mL甲醛溶液，用0.05mol/L氢氧化钠标准溶液滴定至pH9.2，做试剂空白试验。（二）电位滴定法56试验步骤 吸取含氨基酸约20mg的样品溶液，置于100mL容量瓶中，加水至刻度，混匀后吸取20.0mL烧杯中，加60mL水，开动磁力搅拌器，用0.05mol/L氢氧化钠标准溶液滴定至酸度计指示pH8.2（记下消耗0.05mol/L氢氧化钠标准溶液的毫升数，可计算总酸含量）。 加入0.1mL甲醛溶液，混匀。再用0.05mol/L氢氧化钠标准的溶液继续滴定至pH9.2，记下消耗0.05mol/L氢氧

27、化钠标准溶液的毫升数。 同时取80mL水，先用0.05mol/L氢氧化钠溶液调节至pH为8.2，再加入10.0mL甲醛溶液，用0.05mol/L氢氧化钠标准溶液滴定至pH9.2，做试剂空白试验。（二）电位滴定法57原 理 氨基酸在一定条件下与茚三酮起反应，生成蓝紫色化合物，可比色定量。（三）茚三酮的比色法581、薄层色谱法2、氨基酸自动分析仪法3、气相色谱法4、高效液相色谱法（三）氨基酸的分离与测定591、薄层色谱法（三）氨基酸的分离与测定简 介 近年来发展起来的一种微量而快速的层析方法，它把吸附剂或支持剂均匀的铺在玻璃板上成一薄层，把样品点在薄层上，然后用合适的溶剂展开，从而达到分离、鉴定和

28、定量的目的。因为层析在薄层上进行，所以称为薄层层析。 应用范围比纸上层析更广泛，常用来分析氨基酸、农药残留量、黄曲霉毒素等。601、薄层色谱法（三）氨基酸的分离与测定原 理 取一定量经水解的样品溶液，滴在制好的薄层板上，在溶剂系统中进行双向上行法展开，样品各组分在薄层板上经过多次的被吸附、解吸、交换等作用，同一物质具有相同的Rf值，不同成分则有不同的Rf值，因而各种混合物可达到彼此被分离的目的。然后用茚三酮显色，与标准氨基酸进行对比，鉴别各种氨基酸种类，从显色斑点颜色的深浅可以大致确定其含量。611、薄层色谱法（三）氨基酸的分离与测定原 理ab样点溶剂前沿点样原点Rf = a / b621、薄

29、层色谱法（三）氨基酸的分离与测定原 理 取一定量经水解的样品溶液，滴在制好的薄层板上，在溶剂系统中进行双向上行法展开，样品各组分在薄层板上经过多次的被吸附、解吸、交换等作用，同一物质具有相同的Rf值，不同成分则有不同的Rf值，因而各种混合物可达到彼此被分离的目的。然后用茚三酮显色，与标准氨基酸进行对比，鉴别各种氨基酸种类，从显色斑点颜色的深浅可以大致确定其含量。631、薄层色谱法（三）氨基酸的分离与测定特 点 优点： 展开时间短，一般在2030分钟，展开距离通常只需10 cm，且分离效果好。 层析后得到的斑点小而清晰。 能够使用多种显色剂。 点样量少，灵敏度高。（比纸层析高10100倍） 精确到0.01ug。 也可用于大量分离500 mg，作为样品制备层析。 缺点：Rf值重现性比纸上层析差。 分类：按层析的原理可分为：吸附、分配、离子交换、凝胶等。641、薄层色谱法（三）氨基酸的分离与测定操作方法 薄层板制备 样品液制备 点样：距薄板底端2cm处，用针画一标记作为原点。可点几个点同时展开，点与点之间间隔12cm。可用毛细玻璃管、微量吸管或微量注射器。注意：等一个点干了再点另一个点。651、薄层色谱法（三）氨基酸的分离与测定操作方法 展开：点样完了，放入密闭容器中（展开槽），倾斜一