第二章DNA的复制分子生物学

1、1第二章第二章 DNA DNA的复制的复制2一、一、DNA 复制假说复制假说Watson和和Crick提出的提出的DNA复制方式为半保留复制方式；复制方式为半保留复制方式；全保留复制：亲代全保留复制：亲代DNA分子完整的转移到子代中；分子完整的转移到子代中；散布式复制：亲代散布式复制：亲代DNA片段分散在子代片段分散在子代DNA分子中。分子中。34 MeselsonStahl实验实验 1958年，年， Meselson和和Stahl首先将大首先将大肠杆菌在含肠杆菌在含重同位素重同位素15N的培养基中培养的培养基中培养约十五代，使所有细菌都被约十五代，使所有细菌都被15N标记。然标记。然后移至只

2、含有后移至只含有轻同位素轻同位素14N的培养基中同的培养基中同步培养一代，二代，三代。分别提取步培养一代，二代，三代。分别提取DNA，作，作CsCl密度梯度离心，观察密度梯度离心，观察DNA的位置。的位置。5615N-DNA14N-DNA混合混合1237 对对15NDNA、14NDNA杂交分子经加热杂交分子经加热变性，对于变性前后的变性，对于变性前后的DNA分别进行分别进行CsCl密度梯度离心。密度梯度离心。 结果变性前的杂交分子为一条中间密度带，变性结果变性前的杂交分子为一条中间密度带，变性后则分为两条区带，即后则分为两条区带，即重密度带重密度带（15NDNA）和）和低密度低密度带带（14N

3、DNA）。）。89 1963年年Cairns用放射自显影方法阐明了大肠杆菌用放射自显影方法阐明了大肠杆菌DNA的复制是半保留复制且的复制是半保留复制且DNA是环状分子。是环状分子。 1957年年Taylor用用3H脱氧胸苷的溶液标记蚕豆，证明了真脱氧胸苷的溶液标记蚕豆，证明了真核生物染色体的复制也是以半保留复制方式进行的。核生物染色体的复制也是以半保留复制方式进行的。 DNA分子是以半保留方式进行复制，不管是原核还分子是以半保留方式进行复制，不管是原核还 是真核生物。是真核生物。101112二、半保留复制二、半保留复制 1、定义、定义 DNA在复制时在复制时,以亲代以亲代DNA的的每一股每一股

4、作模作模板，合成板，合成完全相同完全相同的两个双链子代的两个双链子代DNA，每，每个子代个子代DNA中都含有中都含有一股一股亲代亲代DNA链，这种链，这种现象称为现象称为DNA的半保留复制的半保留复制(semi-conservative replication)。13 模板模板 原则原则 特点特点 亲代的亲代的DNA双链，每股链都可作为模板双链，每股链都可作为模板 按按碱基配对碱基配对原则指导新链的合成原则指导新链的合成 合成的两个子代合成的两个子代DNA分子碱基顺序与亲分子碱基顺序与亲代分子完全一样代分子完全一样 一条链来自于亲代的一条链来自于亲代的DNA链，另一条链链，另一条链是新合成的链

5、是新合成的链规律规律14亲代亲代DNA子子代代子子代代新合成新合成 的链的链半保留复制半保留复制15162、DNA半保留复制的类型半保留复制的类型1 1） 线性双链：线性双链： 双向、多重起始双向双向、多重起始双向172） 环状环状DNA：型（双向、单向）、型（双向、单向）、 D型、滚环型、滚环型双向型双向18滚环复制滚环复制19X174RF是一个合是一个合成单链病毒圆环的成单链病毒圆环的模板模板20D型复制型复制213、参与、参与DNA复制的物质复制的物质1 1） 底物：底物：四种脱氧核糖核酸四种脱氧核糖核酸: 即即dATP，dGTP，dCTP，dTTP 2 2） 模板：模板： 亲代亲代DN

6、A链作为模板。链作为模板。3 3） 引物：引物： RNA作为引物作为引物(primer) ； 原核生物原核生物:通常为通常为50100个核苷酸个核苷酸 真核生物真核生物:约为约为10个核苷酸；个核苷酸； 其顺序与其模板其顺序与其模板DNA的碱基顺序相配对的碱基顺序相配对224）DNA聚合酶（聚合酶（DNA Polymerase）：）： 以以dNTP为前体催化合成为前体催化合成DNA 需要模板和引物的存在需要模板和引物的存在 不能起始合成新的不能起始合成新的DNA链链 催化催化dNTP加到生长中的加到生长中的DNA链的链的3-OH末端末端 催化催化DNA合成的方向是合成的方向是5323A 原核生

7、物聚合酶原核生物聚合酶 DNA聚合酶有聚合酶有5种种 具有多种酶活性的多功能酶具有多种酶活性的多功能酶 参与参与DNA复制的主要是复制的主要是pol和和pol。 Kornberg酶（酶（1956年）年） 400个酶分子个酶分子/每个细胞每个细胞 单链多肽（单链多肽（109kD） 大小二个片段（枯草杆菌蛋白酶处理）大小二个片段（枯草杆菌蛋白酶处理） DNA聚合酶聚合酶（DNA Polymerase， Pol）24NC小片段小片段大片段大片段（ klenow片段片段） （常用的工具酶常用的工具酶）34kD76kD2553聚合活性：聚合活性： 模板；模板； 3OH末端引物；末端引物； 方向从方向从5

8、3。26复制方向复制方向DNA聚合酶聚合酶的校对功能的校对功能(3-5 外切酶活性外切酶活性)错配碱基错配碱基5 5 3 3 正确正确核苷酸核苷酸5 5 3 3 3 3 切除错配切除错配核苷酸核苷酸2753外切酶活性：外切酶活性： 从从5-P端依次切除，端依次切除，可连续切除多个核苷酸；可连续切除多个核苷酸； 只切配对的只切配对的5-P末端末端核苷酸；核苷酸； 既可切除脱氧核苷酸既可切除脱氧核苷酸也可切除核苷酸；也可切除核苷酸； 对只有对只有5末端的切口末端的切口也有活性。也有活性。2829 MW为为120KD 100个酶分子个酶分子/每个细胞每个细胞 聚合作用聚合作用:只有只有DNApol的

9、的5% 35外切酶活性外切酶活性 无无53外切酶活性外切酶活性 对作用底物的选择性较强对作用底物的选择性较强 不是复制的主要聚合酶不是复制的主要聚合酶DNA聚合酶聚合酶（DNA Polymerase ， Pol ）30 pol 由十种共由十种共22个亚基组成个亚基组成 亚基具有亚基具有53聚合聚合DNA的酶活性的酶活性 亚基具有亚基具有35外切酶的活性外切酶的活性 亚基具有促进亚基具有促进亚基外切酶的活性亚基外切酶的活性DNA聚合酶聚合酶（DNA Polymerase ， Pol ）31 在复制叉处为一二聚体在复制叉处为一二聚体 核心酶（核心酶（core enzyme）：）：、。 ：聚合作用；

10、：聚合作用； ：35外切；外切；：与亚基结合有关；：与亚基结合有关； 、提高反应速率和持续性；提高反应速率和持续性； ：使：使DNApol能结合在能结合在DNA上。上。亚基结合于亚基结合于DNA时消时消耗耗ATP；如同一个夹子，使；如同一个夹子，使DNApol结合于结合于DNA。 ：使两个：使两个DNApol单体形成二聚体，分别在复制叉的两单体形成二聚体，分别在复制叉的两个链上作用。个链上作用。32DNA Polymerase III HoloenzymeSliding ClampUnknown fxn3 5 exonucleasePol C: polymeraseDimerizing Uni

11、tsthe clamp loader33343536B 真核生物聚合酶真核生物聚合酶五种五种 DNA聚合酶聚合酶 DNA聚合酶聚合酶 DNA聚合酶聚合酶 DNA聚合酶聚合酶、功能：功能： 参与随从链的合成参与随从链的合成 参与前导链的合成参与前导链的合成 参与线粒体参与线粒体DNA的合成的合成 参与参与DNA的修复的修复37 DNA聚合酶聚合酶 蛋白质分子量（蛋白质分子量（KD） 250 36-38 160-300 170 256 细胞定位细胞定位 核核 核核 线粒体线粒体 核核 核核 5 3聚合酶聚合酶 有有 有有 有有 有有 有有 3 5外切酶外切酶 无无 无无 有有 有有 有有 引物酶引

12、物酶 有有 无无 无无 无无 无无 真核细胞几种主要真核细胞几种主要DNA聚合酶的性质聚合酶的性质385 5） 解链酶解链酶（unwinding enzyme/ helicase ） 39406） 引物酶（引物酶（Primase） 本质：依赖本质：依赖DNA的的RNA聚合酶聚合酶 （DDRP） Ecoli：60kD，DnaG 编码编码 引发体引发体(primosome)：引物酶引发前体（蛋白：引物酶引发前体（蛋白 因子因子i、n、n”、dnaC、n、dnaB）415 33 5 primaseDnaCDnaCprimosomeHelicase(DnaB)42 蛋白因子蛋白因子i、n、n”与蛋白与

13、蛋白dnaC跟引物预合成跟引物预合成有关；有关； 蛋白因子蛋白因子n和蛋白和蛋白dnaB与识别复制起始点有与识别复制起始点有关，并具有关，并具有ATPase活性。活性。437）单链结合蛋白单链结合蛋白 single strand binding protein, SSB 能够与单链能够与单链DNA结合的蛋白质因子结合的蛋白质因子 稳定单链稳定单链DNA，不形成发夹结构，不形成发夹结构 保护单链保护单链DNA，不受，不受DNA水解酶作用水解酶作用 可重复使用，在滞后链上不断摆动，可重复使用，在滞后链上不断摆动，冈崎片段合成冈崎片段合成4445468） 拓扑异构酶拓扑异构酶(topoisomera

14、se)： 可使可使DNA拓扑异构体互变的酶。拓扑异构体互变的酶。切割切割DNA双链，此时不需双链，此时不需ATP；尔后；尔后由由ATP供能，使供能，使DNA分子成负超螺旋分子成负超螺旋再连接切口。再连接切口。不需不需ATP，切割双链，切割双链DNA中的一链，中的一链，使使DNA松弛后松弛后, 连接切口。连接切口。 TOPO: TOPO:TOPO酶：切割酶：切割DNA链，使其松弛后再连接。链，使其松弛后再连接。47 功能：与功能：与DNA形成共价结合中间体，使形成共价结合中间体，使DNA磷酸二酯磷酸二酯 键断裂，形成键断裂，形成DNA nick，DNA的一条链进行解的一条链进行解 旋旋转改变旋旋

15、转改变DNA分子的拓扑结构。分子的拓扑结构。 参与复制、转录、重组。参与复制、转录、重组。 效应：可使效应：可使DNA发生：连环化（发生：连环化（catenate）、脱连环化）、脱连环化 （decatenate）、打结（）、打结（knot）、解结（）、解结（unknot）。）。48拓扑异构酶拓扑异构酶：MW100kD，单肽链，含，单肽链，含34个个Zn作用：作用： 每次改变一个连环数；每次改变一个连环数； 结合结合DNA，使该处溶解；，使该处溶解； 形成酶形成酶DNA复合物；复合物； 切割双链中的一股，使切割双链中的一股，使DNA中的一股链穿越切割点；中的一股链穿越切割点； 断裂单链连接断裂单

16、链连接4950作用：作用： 使正超螺旋转化为负超螺旋。每次改变两个连接数。使正超螺旋转化为负超螺旋。每次改变两个连接数。拓扑异构酶拓扑异构酶：又称旋转酶。：又称旋转酶。 广泛存在于各种生物中。广泛存在于各种生物中。515253 型：型：MW95kD，单体蛋白，不需，单体蛋白，不需ATP； 型：型：MW150180kD，均为二聚体，需，均为二聚体，需ATP和和 Mg2+。真核生物拓扑异构酶：真核生物拓扑异构酶： 酵母、两栖类动物、昆虫、哺乳动酵母、两栖类动物、昆虫、哺乳动物和植物的物和植物的拓扑异构酶的特性相似，拓扑异构酶的特性相似，但与原核的酶有明显差异。但与原核的酶有明显差异。549） 连接

17、酶连接酶 DNA连接酶连接酶(DNA ligase)可催化两段可催化两段DNA片段之间片段之间磷酸二酯键的形成，而使两段磷酸二酯键的形成，而使两段DNA连接起来。连接起来。 需需3-OH，5-Pi基基 碱基互补碱基互补 只连只连Nick，不连，不连Gap 需要消耗能量需要消耗能量55DNA连接酶的作用连接酶的作用56 T4Ligase特性：特性： 可连接可连接DNA与与DNA，也可连接，也可连接RNA与与RNA； 可连接可连接DNA中的单链切口，也可连接粘性末端切口和中的单链切口，也可连接粘性末端切口和平砌末端切口；平砌末端切口； T4Ligase可作为重组工具酶。可作为重组工具酶。574、半

18、不连续复制（、半不连续复制（ semidiscontinuous replication ）58 半不连续复制：半不连续复制： 在在DNA复制过程中，亲代复制过程中，亲代DNA分子中以分子中以3 5方向方向的母链作为模板指导新的链以的母链作为模板指导新的链以5 3 方向方向连续连续合成，合成， 另一股以另一股以5 3 为方向的母链则指导新合成的链以为方向的母链则指导新合成的链以 5 3方向合成方向合成10002000个核苷酸长度的许多个核苷酸长度的许多不连续不连续的的片段（岗崎片段），这种复制方式称之为半不连续复片段（岗崎片段），这种复制方式称之为半不连续复制。制。5960 前导链（前导链（l

19、eading strand）：）： DNA复制时，一股以复制时，一股以3 5方向的母链作为模板，方向的母链作为模板，指导新合成的链以指导新合成的链以5 3方向连续合成的链称为方向连续合成的链称为前导链前导链。 （复制方向与解链方向一致）（复制方向与解链方向一致）61 随从链（随从链（lagging strand): DNA复制时，一股以复制时，一股以5 3方向的母链作为模板，方向的母链作为模板，指导新合成的链沿指导新合成的链沿5 3合成，合成，10002000个核苷酸不个核苷酸不连续的小片段的链称为连续的小片段的链称为随从链随从链。 （复制方向与解链方向相反（复制方向与解链方向相反)62 冈崎

20、片段（冈崎片段（Okazaki）：）： DNA复制时，一股以复制时，一股以5 3方向的母链作为模板，方向的母链作为模板，指导新合成的链沿指导新合成的链沿5 3合成合成10002000个核苷酸不连个核苷酸不连续的小片段称之为续的小片段称之为冈崎片段冈崎片段。 冈崎片段由冈崎片段由DNA连接酶连成一条完整的新链。连接酶连成一条完整的新链。635 5、复制的过程、复制的过程 根据反应阶段和所需的不同酶类，根据反应阶段和所需的不同酶类，DNA的复制可被的复制可被分为三个阶段，即复制分为三个阶段，即复制起始起始、延伸延伸和和终止终止。 复制的起始阶段：包括起始点、复制方向和引发体复制的起始阶段：包括起始

21、点、复制方向和引发体 的形成的形成 A 起始点（起始点（Ori） DNA在复制时，需在特定的位点起始，这是一些具在复制时，需在特定的位点起始，这是一些具有特定核苷酸排列顺序的片段，即有特定核苷酸排列顺序的片段，即复制起始点复制起始点。64 大肠杆菌中的复制起始点是大肠杆菌中的复制起始点是OriC，全，全长长245 bp，该序列在所有细菌复制起始位，该序列在所有细菌复制起始位点中都是保守的。点中都是保守的。6566 复制起点在复制过程中呈现叉子的形式，被称为复制起点在复制过程中呈现叉子的形式，被称为复制复制叉（叉（Replication fork） DNA复制从复制从起点起点开始进行直到开始进行

22、直到终点终点为止，每一个这样为止，每一个这样的的DNA单位称为单位称为复制子或复制单元复制子或复制单元(replicon) 一个复制子只含有一个复制起点。一个复制子只含有一个复制起点。 原核生物中只有一个复制起点，一个复制子原核生物中只有一个复制起点，一个复制子 真核生物中可以从许多起始点同时进行，即有多个复真核生物中可以从许多起始点同时进行，即有多个复制子制子6768B 复制方向复制方向 DNA复制时，复制时，以复制起始点为以复制起始点为中心，向两个方中心，向两个方向进行复制。但向进行复制。但在低等生物中，在低等生物中，也可进行单向复也可进行单向复制（如滚环复制（如滚环复制）。这决定于制）。

23、这决定于在起始点形成在起始点形成1或或2个复制叉。个复制叉。69C 引发体的形成引发体的形成7071结合结合Ori区，具区，具ATP酶活性酶活性促进促进DnaB形成起始复合物形成起始复合物 DNA螺旋酶螺旋酶运输运输DnaBDNA引发酶引发酶促进起始促进起始复合物形成复合物形成7273 a. 大约大约20个左右的个左右的DnaA蛋白首先与蛋白首先与OriC中的中的4个个9碱基重碱基重 复区相结合；复区相结合；HU蛋白参与并促进这一过程；蛋白参与并促进这一过程；b. 识别并使识别并使3个个13碱基串联重复区碱基串联重复区DNA形成开环结构；形成开环结构；c. SSB和旋转酶（拓扑异构酶）参入；和

24、旋转酶（拓扑异构酶）参入； d. DnaB蛋白在蛋白在DnaC的帮助下与未解链序列结合。每六个的帮助下与未解链序列结合。每六个 DnaB蛋白形成一组并与一条蛋白形成一组并与一条DNA母链结合，可在不方母链结合，可在不方 向同时起始向同时起始DNA的复制。的复制。 e. DnaG（引物酶）参入成引发体；（引物酶）参入成引发体； f. 引发体合成先导链的引发体合成先导链的RNA引物；引物； g. DNApolmerase 组装和复制叉上二聚体形成；组装和复制叉上二聚体形成； h. 在在RNA引物引物3端端DNA开始聚合开始聚合 74 复制的延伸复制的延伸75 前导链和滞后链由同一前导链和滞后链由同

25、一pol二聚体延伸二聚体延伸 滞后链合成与前导链不同步：滞后链合成与前导链不同步： 位于滞后链的引发体，在合成引物后，位于滞后链的引发体，在合成引物后，DnaG（引物（引物酶）可将模板链提起或成环，使酶）可将模板链提起或成环，使RNA引物引物3端位于端位于DNApol处处767778 DNApol在在RNA引物引物3端延伸端延伸DNA随从链随从链 解链的滞后模板链被解链的滞后模板链被SSB结合，保持模板为单链状态，结合，保持模板为单链状态，并保护其不被核酸酶水解并保护其不被核酸酶水解 随冈崎片段的延伸，随冈崎片段的延伸，SSB被被priA除去，此过程需除去，此过程需ATP功能功能79整个复制过

26、程如下：整个复制过程如下：在复制叉形成复制体在复制叉形成复制体（DnaB,亚基与亚基与DNA结合，引发体形成，结合，引发体形成，2pol 复合体形成）复合体形成）先导链先导链DNApol 核心酶沿模板核心酶沿模板35方向滑动，新链方向滑动，新链以以53延伸，滞后链上延伸，滞后链上亚基结合于亚基结合于 模板上，引发体模板上，引发体（引发酶）合成引物，（引发酶）合成引物，DNApol 合成冈崎片段。合成冈崎片段。引物酶及引发体脱落，冈崎片段合成，引物酶及引发体脱落，冈崎片段合成， 亚基脱下。亚基脱下。随从链上冈崎片段合成后，随从链上冈崎片段合成后， DNApol 核心酶脱落。核心酶脱落。clamp

27、结合在随从链新位点上结合在随从链新位点上80818283 复制的终止复制的终止 当子链延伸达到当子链延伸达到terminus region（ter，带有多，带有多个个20bp序列）时，序列）时，DNA复制就终止了。复制就终止了。Ter有点像有点像一个陷井（一个陷井（trap），使复制叉只能进入，不能出来。），使复制叉只能进入，不能出来。Ter的功能主要是由的功能主要是由Ter-Tus复合物（复合物（ter utilization substance）来完成的。）来完成的。84 EcoliDNA的复制终止终点 AATTAGTATGTTGTAACTAAAGT TTAATCATCCAACATTGAT

28、TTCA 复制叉可被tus蛋白识别，并结合于其上85868788 终止的调节：在终止点终止的调节：在终止点Forksmeet两侧各有几个短序列，两侧各有几个短序列，如：如：terE. D. A. terC. B。当一侧复制叉前进的快，而。当一侧复制叉前进的快，而另一侧前进的慢时，快侧复制酶则会在另一侧前进的慢时，快侧复制酶则会在ter位点停止，位点停止，等待直到慢侧跟上时。似乎构成一个等待直到慢侧跟上时。似乎构成一个“replication fork trap”。 二个复制叉相距约二个复制叉相距约100kb时速度放慢，通过时速度放慢，通过ter来协调来协调两复制叉到达终点的时间。两复制叉到达终点的时间。89906 6、复制的保真性、复制的保真性 长期进化过程中，使生物体长期进化过程中，使生物体DNA复制过程形成了一系列保真机制，复制过程形成了一系列保真机制，保证复制准确，遗传稳定。保证复制准确，遗传稳定。 DNApol和和 的的35活性活性 DNApol有两个结构域：有两个结构域： 大结构域含一个荷正电，直径大结构域含一个荷正电，直径2nm的裂缝，是的裂缝，是DNA结合部分。结合部分。DNA 一旦结合，裂缝即被关闭