酶工程蛋白复习基础和重点

1、第一章 绪论1、酶工程： 从应用目的出发研究酶，在一定的生物反应装置中利用酶的催化性质，将相应 原料转化成有用的物质。是酶学和工程学相互渗透结合形成的一门新的技术科学， 是酶学、 微生物学的基 本原理与化学工程有机结合而产生的边缘科学。2、生物催化（ Biocatalysis） ：利用酶或有机体（细胞或细胞器等）作为催化剂实现化学转化 的过程。3、酶的命名有两种方法：系统名、惯用名。系统名：包括所有底物的名称和反应类型。（如：乳酸：NAD+氧化还原酶）惯用名 ：只取一个较重要的底物名称和反应类型。 （如：乳酸脱氢酶）4、酶可分为以下六大类：（ 1）氧化还原酶氧化 -还原酶催化氧化 -还原反应。

2、主要包括脱氢酶（dehydrogenase）和氧化酶（Oxidase）。 如乳酸（Lactate）脱氢酶催化乳酸的脱氢反应。（ 2 ）转移酶转移酶催化基团转移反应，即将一个底物分子的基团或原子转移到另一个底物的分 子上。例如， 谷丙转氨酶催化的氨基转移反应。（ 3 ）水解酶水解酶催化底物的加水分解反应。 主要包括淀粉酶、蛋白酶、核酸酶及脂酶等。 例如，脂肪酶（Lipase）催化的脂的水解反应：（ 4 ）裂合酶 裂合酶催化从底物分子中移去一个基团或原子形成双键的反应及其逆反应。 主要包括醛缩酶、水化酶及脱氨酶等。 例如， 延胡索酸水合酶催化的反应。（ 5 ）异构酶 异构酶催化各种同分异构体的相互

3、转化，即底物分子内基团或原子的重排过程。 例如， 6-磷酸葡萄糖异构酶催化的反应。（ 6 ）合成酶合成酶，又称为连接酶，能够催化C-C、C-O、C-N 以及 C-S 键的形成反应。这类反应必须与ATP分解反应相互偶联。A + B + ATP + H-O-H =A? B + ADP +Pi 例如，丙酮酸羧化酶催化的反应。丙酮酸 + CO2 草酰乙酸 （ 7 ）核酸酶核酸酶是唯一的非蛋白酶。它是一类特殊的RNA，能够催化RNA分子中的磷酸酯键的水解及其逆反应。5、酶的组成7 |鲂甘酶| （命酶）=JR酗TiWlK口结 C得比较松的小分子有対1物“GJ!奂饭门纪"紧僭的小分 广仃机物。狂展

4、激活和盒局肉 j- <1 -为 WIUjIk f .酶的催化专一性主要决定于蛋白部分。辅因子通常是作为电子、原子或某些化学基团的载体。6、活性部位和必需基团必需基团：这些基团若经化学修饰使其改变，则酶的活性丧失。活性部位：酶分子中直接与底物结合，并和酶催化作用直接有关的部位。夕山n- j.mn- 砂化斗与【才I*# pv址 fl<j 至 ruj m +jj7、酶的催化特点（1）高效催化能力：有酶加入比无酶参加反应速度一般要高107-1013（3） 专一性：包括结构专一性（族（基团）专一性和绝对专一性）和立体异构专一性（3）调节性：酶浓度的调节、激素调节、共价修饰调节、限制性蛋白水解

5、作用与酶活力调控、抑制剂的调节 、反馈调节、金属离子和其他小分子化合物的调节8、影响酶活力的因素：酶的催化作用受到底物浓度、酶浓度、温度、 pH值、激活剂浓度、 抑制剂浓度等诸多因素的影响。酶活力单位：在特定条件下（温度可采用 25C或其它选用的温度，pH等条件均采用最适条 件），每1 min催化1 （1 mol的底物转化为产物的酶量定义为 1个酶活力单位。这个单位 称为国际单位。（1） 酶浓度对酶促反应速度的影响条件：底物浓度足够大反应速度与酶浓度成正比（2） 底物浓度对酶促反应速度的影响Vm SKm +S米氏方程当【S很小时, 当【S很大时,V=Vm【S /Km，一级反应V=VmS/S=V

6、 , 0 级反应Km值等于酶促反应速度为最大反应速度一半时的底物浓度，单位是mol/L。(3)温度对酶促反应速度的影响：最适温度(4)PH对酶促反应速度的影响:最适pH时的酶活力最大(5)抑制剂对酶促反应速度的影响(1)不可逆抑制作用抑制剂与酶活性中心必需基团共价结合，不能用透析、超滤等物理方法将其除去常见抑制剂：巯基酶抑制剂、丝氨酸酶抑制剂（2） 可逆抑制作用概念：抑制剂与酶非共价结合，可用透析、超滤等方法除去类型：竞争性抑制作用非竞争性抑制作用反竞争性抑制作用a. 竞争性抑制：抑制剂结构与底物结构相似，互相竞争酶的活性中心，从而抑制酶的活性特点：1. i与S结构相似；2. i与S互相竞争与

7、酶结合；3. 抑制程度取决于S和i的相对比例；4. f S,可以减少或去除抑制作用。（Kmf, Vm不变）b. 非竞争性抑制作用：抑制剂和底物结构不相似，两者互不干扰，同时与酶结合，从而抑制酶活性。特点：1. i与S结构不相似；2. i与S互不干扰同时与 酶 结合；3. 抑制程度只取决于i的浓度；4. f S,不能去除抑制作用。（Km不变，Vm J）c. 反竞争性抑制作用：抑制剂仅与酶-底物复合物（ES结合，使酶失去催化活性Km、Vmax都变小三种可逆性抑制作用的比较竞争性抑制 反竞争性抑制非竞争性抑制与抑制剂结 合的繭形式 底物与抑制 作用的关系表观Km值最大速度Vm游离酶£S复合

8、物游离酶、ES复合物Sl叫减轻 或解除抑制ES复合物是 抑制剂作用 的先决条件抑制作用 与S无关增大减小不变不变降低降低第二章 酶的分离纯化1第二章 酶的分离纯化1. 酶的提取、分离纯化技术路线发酵液动物、植物或微生物细胞>细胞破碎 > 酶提取 > 酶分离纯化 > 酶浓缩 >酶贮存酶分离纯化可采用离心分离、过滤分离、沉淀分离、层析分离、电泳分离、萃取分离2、，酶分离纯化不同阶段酶的纯化过程，约可分为三个阶段：（1）粗蛋白质（crude protein）:采样 宀 均质打破细胞 宀 抽出全蛋白，多使用 盐析沉淀法; 可以粗略去除蛋白质以外的物质。部分纯化（parti

9、ally purified）:初步的纯化，使用各钟柱层析法。均质酶（homogeneous）:目标酶的进一步精制纯化，可用制备式电泳 或HPLG3、 细胞破碎：机械破碎（捣碎法，研磨法，匀浆法）、物理破碎（温度差破碎发，压力差破 碎发，超声波破碎法）、化学破碎（甲苯，丙酮，丁醇，氯仿，Trit on. Tween ）、酶解破碎（自 溶法，外加酶制剂法）4、酶的提取：酶的提取是指在一定的条件下，用适当的溶剂或溶液处理含酶原料，使酶充 分溶解到溶剂或溶液中的过程。也称为酶的抽提。提高温度，降低溶液粘度、增加扩散面积、縮短扩散距离，增大浓度差等都有利于提高酶分 子的扩散速度，从而增大提取效果。提取方

10、法使用的溶剂或溶液提取对象盐溶液提取0.020.5mol/L的盐溶液用于提取在低浓度盐溶液中溶解度 较大的酶酸溶液提取PH26的水溶液用于提取在稀酸溶液中溶解度大，且稳定性较好的酶碱溶液提取PH812的水溶液用于提取在稀碱溶液中溶解度大且 稳定性较好的酶有机溶剂提取可与水混溶的有机溶剂用于提取那些与脂质结合牢固或含 有较多非极性基团的酶大多数蛋白类酶都溶于水， 而且在低浓度的盐存在的条件下，酶的溶解度随盐浓度的升高而增加，这称为盐溶现象。5、酶的分离方法（1）沉淀分离：沉淀分离是通过改变某些条件或添加某种物质，使酶的溶解度降低，而从 溶液中沉淀析出，与其它溶质分离的技术过程。沉淀分离方法分离原

11、理盐析沉淀法利用不同蛋白质在不同的盐浓度条件下溶解度不同的特性， 通过在酶液中添加一定浓度的中性盐，使酶或杂质从溶液中 析出沉淀，从而使酶与杂质分离等电点沉淀法利用两性电解质在等电点时溶解度最低，以及不冋的两性电 解质有不同的等电点这一特性，通过调节溶液的pH值，使酶或杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分离有机溶剂沉淀法利用酶与其它杂质在有机溶剂中的溶解度不冋，通过添加一 定量的某种有机溶剂，使酶或杂质沉淀析出，从而使酶与杂 质分离复合沉淀法在酶液中加入某些物质，使它与酶形成复合物而沉淀下来， 从而使酶与杂质分离选择性变性沉淀法选择一定的条件使酶液中存在的某些杂质变性沉淀，而不影 响所需的酶，从而使

12、酶与杂质分离在盐浓度达到某一界限后，酶的溶解度随盐浓度升高而降低，这称为盐析现象。（2 ）离心分离采用不同的离心速度和离心时间，使沉降速度不同的颗粒分批分离的方法。 特点：用于分离大小和密度差异较大的颗粒。优点：操作简单 。缺点：1)分离效果较差，不能一次得到纯颗粒。2) 壁效应严重。3) 沉降的颗粒受到挤压。2) .密度梯度离心(density gradient centrifugation )样品在密度梯度介质中进行离心，使沉降系数比较接近的组分得以分离的一种区带分 离方法。常用的密度梯度溶液是蔗糖溶液。特点：? 区带内的液相介质密度小于样品物质颗粒的密度。? 适宜分离密度相近而大小不同的

13、固相物质。3) .等密度梯度离心 又称沉降平衡离心(sedimentation equilibrium centrifugation )。根据颗粒的密度不同而进行分离。离心时，在离心介质的密度梯度范围内，不同密度的物质颗粒或向下沉降，或向上漂浮,达到与其相同的密度时不再移动，形成区带。常用氯化铯(CsC)作为梯度介质。特点：? 介质的密度梯度范围包括所有待分离物质的密度。? 适于分离沉降系数相近，但密度不同的物质。总结：? 等密度梯度离心是一种测定颗粒浮力密度的静力学方法，关键在于选择氯化铯浓度，使之包括待分离物的密度范围。? 差速离心是一种动力学方法，关键在于选择适合于各分离物的离心力。?

14、密度梯度离心兼有以上两种方法的特点，关键在于制备优质的密度梯度溶液。(3) 过滤与膜分离 过滤是借助于过滤介质将不同大小、不同形状的物质分离的技术过程。过滤的分类及其特性类别截留颗粒大小截留的主要物质过滤介质粗滤> 2卩m酵母、霉菌、动物细胞、植物 细胞、固形物等滤纸、滤布、纤维多孔 陶瓷、烧结金属等微滤0.22卩m细菌、灰尘等微滤膜、微孔陶瓷超滤20?0.2m病毒、生物大分子等超滤膜反渗透< 20?生物小分子、盐、离子反渗透膜加压膜分离二膜分离.电场膜分离扩散膜分离微滤超滤反渗透电渗析离子交换膜电渗析透析微滤（Microfiltration , MF）一种静态过滤，随过滤时间延长

15、，膜面上截流沉积不溶物，引起水流阻力增大，透水速率下降，直至微孔全被堵塞；超滤（ultrafiltration , UF ）一种动态过程，由泵提供推动力，在膜表面产生两个分力：一个是垂直于膜面的法向分力，使水分子透过膜面，另一个是于膜面平行的切向力，把膜面截流物冲掉。反渗透（Reverse osmosis， RO）利用反渗透膜选择性地只能透过溶剂（通常是水）的性质，对溶液施加压力，使溶剂通过反渗透膜而从溶液中分离出来的过程。3）电场膜分离电渗析：在半透膜的两侧分别装上正、负电极。（4 ）层析技术层析技术，亦称色谱技术，是一种物理的分离方法。它是利用混合物中各组分的物理化学性质的差别，使各组分以

16、不同程度分布在两个相中，其中一个相为固定的（称为固定相），另一个相则流过此固定相（称为流动相）并使各组分以不同速度移动，从而达到分离。1）吸附层析原理：禾U用固定相的固体吸附剂表面对不同组分吸附力的大小及洗脱液对它的溶解作用（解吸作用）的差异进行分离。吸附剂：活性炭：常用的吸附介质。硅胶：常用的极性吸附介质。羟基磷灰石（HA） Ca1O（PO4）6.（OH）2洗脱剂：粘度小，纯度高，稳定性好，完全洗脱下所要分离的成分，易与目标分子分离2）分配层析：分配层析是利用各组分在两相中的分配系数不同，而使各组分分离的方法。分配系数是指一种溶质在两种互不相溶的溶剂中溶解达到平衡时，该溶质在两项溶剂中的浓度

17、的比值。在层析条件确定后，层析系数是一常数。3）离子交换层析是利用离子交换剂上的可解离基团（活性基团）对各种离子的亲和力不同 而达到分离目的的一种层析分离方法。包括阳离子交换剂和阴离子交换剂利用不同的蛋白质分子在溶液中所带电荷不同，因而与离子交换剂有不同吸附力而分离。4）凝胶层析又称为凝胶过滤，分子排阻层析，分子筛层析是指以各种多孔凝胶为固定相，利用流动相中所含各种组分的相对分子质量不同而达到物质 分离的一种层析技术。5）亲和层析是利用生物分子与配基之间所具有的专一而又可逆的亲和力，而使生物分子分离纯化的技术。6）疏水层析7）反相层析衔接层析技术时注意事项小量样品 一 GF 样品稀释，缓冲液不

18、变低离子强度IEX高离子强度或pH改变高离子强度HIC低离子强度特异性结合 一 AC-特异性洗脱（5 ）电泳分离电泳（electrophoresis, EP）:指带电粒子在电场中向着与其所带电荷性质相反的电极方向移动的过程。原理：在一定pH条件下（用buffer），不同大小、形状及带电颗粒在电场中的移动速度不同（用迁移率表示），各自集中到特定的位置上而形成紧密的泳动带。按支持介质种类的不同，区带电泳可分为： 纸电泳：用滤纸作为支持介质，多用于核苷酸的定性定量分析。 醋酸纤维素薄膜电泳：医学上，常用于分析血清蛋白、胎盘球蛋白，优点是简便迅速，便于保存照相，比纸电泳分辨率高。 琼脂糖凝胶电泳：一般

19、用于核酸的分离分析。琼脂糖凝胶孔径度较大，对大部分蛋白质只有很小的分子筛效应。 聚丙烯酰胺凝胶电泳：可用于核酸和蛋白质的分离、纯化及检测。分辨率较高。原理：聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体（ acrylamide，简称Acr）和交联剂 N，N'-甲叉双丙烯酰胺（methylane bisacrylamide，简称Bis）在催化剂和加速剂作用下聚合的。凝胶的机械强度、弹性和透明度粘着度取决于凝胶总浓度（T）和交联度（C）。凝胶浓度越大（小），孔径越小（大），可分离分子量较小（大）的颗粒。PAGE根据其有无浓缩效应，分为：连续电泳（continuous electrophoresis ）:采

20、用相同孔径的凝胶和相同的缓冲系统不连续电泳（discontinuous electrophoresis ）:采用不同孔径的凝胶和不同缓冲体系1 ）电荷效应：分离胶中，蛋白质表面净电荷不同，迁移率不同。2） 分子筛效应：大小和形状不同的样品分子通过一定孔径的分离胶时，受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率。3）浓缩效应：使样品在浓缩胶中被浓缩成一条窄带，然后再进入分离胶进行分离。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳原理：SDS是 一种阴离子去污剂，带有大量负电荷，与蛋白质结合后使蛋白质所带负电荷大大超过了天然蛋白质原有的负电荷，因而消除或掩盖了不同种类蛋白质间原有电荷的差异。SDS破坏蛋白质氢键、疏水键，巯

21、基乙醇使二硫键打开，引起蛋白质构象改变，使蛋白质SDS复合物形状近似椭圆形，短轴相同（1.8nm ），长轴与蛋白质分子量成正比。因此，蛋白质 一SDS复合物（SDS-denatured protein）在凝胶中的迁移率不受蛋白质原有电 荷和形状的影响，只与椭圆棒长度（蛋白质分子量）有关。等电聚焦电泳 （Isoelectric Focusing Electrophoresis ， IEFE） 原理：一种利用具有 pH 梯度的支持介质分离等点电不同的蛋白质的电泳技术。 各种蛋白质各自都有一个等电点,在一特殊的 pH 环境中 ,蛋白质分子呈电中性 , 在电场中不会迁移。等电聚焦就是在电泳介质中放入载

22、体两性电解质， 当通以直流电时， 两性电解质即形成 一个由阳极到阴极逐步增加的 pH 梯度，在此体系中，不同的蛋白质即移动到或聚焦于其相 当的等电点位置上， 也就是说被聚焦于一个狭的区带中， 电泳技术中的等电点聚焦也称为聚 焦电泳。（6）萃取分离 利用溶质在互不相容的两相之间分配系数的不同而使溶质得到纯化或浓缩的方法。料液： 供提取的溶液。溶质： 料液中欲提取的物质 。萃取剂 ： 用来进行萃取的溶剂，通常是有机溶剂 。萃取液 ： 经接触分离后，溶质转移到萃取剂中与萃取剂形成的溶液 。萃余液： 被萃取出溶质后的料液 。反萃取（ back extraction ）： 完成萃取操作后，将产物从有机相

23、转入水相的萃取操作。 双水相萃取技术： 又称水溶液两相分配技术（ partion of two aqueous phase system ） 用两种不相溶的亲水性高分子聚合物水溶液，如聚乙二醇（PEG和葡聚糖（Dextran）进行萃取。由于形成的两相均有很高的含水量（达 70%? 90%），故称 “双水相 ”系统 超临界流体萃取 兼有蒸馏和溶液萃取的特征，与常规溶剂萃取的区别：将超临界流体作为萃取剂。超临界流体（supercritical fluid，SCF :超过气液共存时的最高压力和最高温度下物质特有的 点临界点后的流体。常用超临界液态 C02作为萃取剂，因为：1）液体CO2无毒2）临界温

24、度（304.06K）接近常温3）临界压力（7.38MPa）较低4 ）操作安全 反胶团萃取 反胶团：又称反胶束（ Reversed Micelles） 指表面活性剂（由亲水的极性基团和疏水的非极性基团两部分组成）分散在连续有机溶剂中自发形成的一种稳定的纳米级的聚集体6、酶的浓缩（一）蒸发浓缩（二）超滤浓缩超滤 （ultrafiltration） ：浓缩以压力差为动力，将待浓缩溶液通过超滤膜，酶分子较大被滞留， 水分子和小分子选择性透过，达到浓缩目的 。（三）吸水剂1. 胶过滤浓缩：利用葡聚糖凝胶 Sephadex G-25或G-50等的吸水特性。2. 聚乙二醇浓缩 ： 聚乙二醇（ polyeth

25、ylene glycol ），简称 PEG（四）反复冻融浓缩：利用酶溶液相对于纯水冰点较低的原理使酶分子与小分子物质分离。（五）沉淀法：盐析法，有机溶剂法7、酶的干燥 酶的干燥多采用冷冻干燥法。将酶溶液在较低温度下（-10C -50C）冻结成固态，然后在高度真空条件下，将其中固态水分直接升华为气态而除去，也称酶的升华干燥。真空干燥 冷冻干燥 喷雾干燥 气流干燥 吸附干燥8、酶的结晶结晶（ Crystallization ）是指物质以晶体的状态从蒸汽或溶液中析出的过程。 常用的结晶方法：透析平衡结晶法， 将酶液装进透析袋， 对一定浓度的盐溶液进行透析，使 酶液逐步达到过饱和状态而析出结晶的过程。

26、第三章 酶与细胞的固定化固定化生物技术： 通过化学或物理的手段将酶或游离细胞定位于限定的空间区域内， 使其保 持活性并可反复利用 。固定化酶的制备原则（1）必须注意维持酶的构象，特别是活性中心的构象。（2）酶与载体必须有一定的结合程度。酶的固定化既不影响酶的原有构象，又能使固定化 酶能有效回收贮藏，利于反复使用。（3）固定化应有利于自动化、机械化操作。这要求用于固定化的载体必须有一定的机械强 度，才能使之在制备过程中不易破坏或受损。（4）固定化酶应有最小的空间位阻。（5）固定化酶应有最大的稳定性。在应用过程中，所选载体应不和底物、产物或反应液发 生化学反应。（6）固定化酶的成本适中。固定化酶

27、（immobilized enzyme） ： 固定在载体上并在一定空间范围内进行催化反应的酶。 固定化细胞（ immobilized cell）： 固定在载体上并在一定空间范围内进行生命活动（生长、 繁殖、新陈代谢）的细胞。酶固定法方法：（1）吸附法： 通过载体表面和酶分子表面间的次级键相互作用而达到固定目的的方法，是 固定化中最简单的方法。常用的固体吸附剂有活性炭、氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、硅胶、羟基磷 灰石等。物理吸附法： 通过非特异性物理吸附作用将酶直接吸附在水不溶性载体表面上而使酶固定化 的方法。包括范德华力、疏水相互作用、氢键离子吸附法 （ion adsorption） 是

28、 通过离子键使酶与含有离子交换基团的水不溶性载体相结合 的固定化方法。（2）共价偶联法： 借助共价键将酶的活性非必需侧链基团和载体的功能基团进行偶联。 载体：亲水载体优于疏水载体 酶蛋白上可供载体结合的功能基团：芳香氨基，羧基，羧甲基等。常用的偶联反应有：重氮化法： 将酶蛋白与水不溶性载体的重氮基团通过共价键相连接而固定化的方法， 是共价 键法中使用最多的一种。叠氮法：即载体活化生成叠氮化合物，再与酶分子上的相应基团 （氨基、羟基、巯基） 偶联 成固定化酶。溴化氰法：即用溴化氰将含有羟基的载体，如纤维素、葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶等，活化生 成亚氨基碳酸酯衍生物，然后再与酶分子上的氨基偶联，制成固

29、定化酶。烷基化法： 以卤素为功能团的载体可与酶蛋白分子上的氨基、巯基、 酚基等发生烷基化或芳 基化反应而使酶固定化。（3）交联法 借助双功能试剂使酶分子之间发生交联的固定化方法。双功能试剂：常用的是戊二醛（4）包埋法（ entrapment ） 将酶用物理的方法包埋在各种载体（高聚物）内。分为： 网格型：将酶包埋在高分子凝胶细微网格中。微囊型：将酶包埋在高分子半透膜中。细胞固定方法：1） 直接固定法 ：不使用载体，借助物理（如加热、冰冻） 、化学方法（如柠檬酸、各种絮 凝剂）将细胞直接固定。一般只用于单酶或少数几种酶催化的反应。2）吸附法3）包埋法 固定化酶的性质（一）固定化酶的酶活力 固定化

30、酶的活力在多数情况下比天然酶的活力低，其原因可能是： 酶活性中心的重要氨基酸残基被载体结合； 高级结构和空间构象的改变； 空间位阻的影响； 内扩散阻力； 半透膜的隔离。个别情况下，酶经固定化后其活力升高。（二）固定化酶的稳定性 操作稳定性：体内半衰期 贮藏稳定性：低温放置 热稳定性：耐热性提高 对蛋白酶的稳定性：空间位阻其他：对有机溶剂、pH、酶抑制剂等的稳定性均有提高。（三）酶的最适温度 最适温度与酶稳定性有关。 多数酶固定化后热稳定性上升，最适温度也上升（有例外） 。（四）酶的最适 pH带负电荷载体 ；带正电荷载体产物为酸性； 产物为碱性（五）酶的动力学特征 固定化酶的表观米氏常数 Km

31、受下列因素影响：载体的带电性能； 载体的疏水性强弱；溶液离子强度。（六）酶的作用专一性 与自然酶基本相同。但大分子底物难于接近酶分子，导致酶的专一性发生改变。第四章 化学酶工程从而改变酶的某些特性和功能的酶分子修饰： 通过各种方法使酶分子的结构发生某些改变， 技术过程称为酶分子修饰。即：在体外将酶分子通过人工的方法与一些化学基团(物质) 特别是具有生物相容性的物质，进行共价连接，从而改变酶的结构和性质。酶分子的修饰方法(1) 酶的金属离子置换修饰 把酶分子中的金属离子换成另一种金属离子， 使酶的特性和功能发生改变的修饰方法称为金 属离子置换修饰。(2) 酶的大分子修饰非共价修饰： 使用一些能与

32、酶非共价地相互作用而又能有效地保护酶的一些添加物， 如聚乙 二醇、 右旋糖苷等， 它们既能通过氢键固定在酶分子表面， 也能通过氢键有效地与外部水相 连，从而保护酶的活力。共价修饰：用可溶性大分子，如聚乙二醇、右旋糖苷、肝素等，通过共价键连接于酶分子的 表面，形成一层覆盖层。(3) 酶分子的侧链基团修饰采用一定的方法 (一般为化学法) 使酶蛋白的侧链基团发生改变， 从而改变酶分子的特性和 功能的修饰方法。酶蛋白的侧链基团是指组成蛋白质的氨基酸残基上的功能团。主要包括氨基、羧基、巯基、 胍基、酚基等。(4) 酶蛋白主链修饰 (肽链有限水解修饰 )利用酶分子主链的切断和连接， 使酶分子的化学结构及其

33、空间结构发生某些改变， 从而改变 酶的特性和功能的方法。酶蛋白主链修饰主要是靠酶切 / 酶原激活法。(5) 氨基酸置换修饰 氨基酸或核苷酸的置换修饰可以采用化学修饰方法 现在常用的氨基酸置换修饰的方法是定点突变技术。(6) 酶分子的物理修饰 通过物理修饰，可以了解不同物理条件下，特别是在极端条件下(高温、高压、高盐、极端 pH 值等)由于酶分子空间构象的改变而引起酶的特性和功能的变化情况。酶修饰后的性质变化 热稳定性：一般来说，热稳定性有较大的提高。抗原性：比较公认的是 PEG和人血清白蛋白在消除酶的抗原性上效果比较明显。 各类失活因子的抵抗力：修饰酶对蛋白酶、抑制剂均有一定的抵抗能力，从而提

34、高 其稳定性。半衰期：一般在体内的半衰期得到有效延长。由于酶分子经修饰后，增强对热、蛋 白酶、抑制剂等的稳定性，从而延长了在体内的半衰期。最适pH:大部分酶经化学修饰后，酶的最适 pH发生了变化，这种变化在应用研究 上有时具有重要意义。修饰酶最适 pH 更接近于生理环境，在临床应用上有较大意 义。Km 的变化：大多数酶经修饰后， Vm 没有明显变化，但有些酶经修饰后， Km 值变 大。模拟酶 ：模拟酶的研究就是吸收酶中那些起主导作用的因素， 利用有机化学、 生物化学等方 法设计和合成一些较天然酶简单的非蛋白质分子或蛋白质分子，以这些分子作为模型来模拟酶对其作用底物的结合和催化过程模拟酶的分类

35、： 单纯酶模型：化学方法通过天然酶活性的模拟来重建和改造酶活性机理酶模型： 通过对酶作用机制诸如识别、 结合和过渡态稳定化的认识， 来指导酶模型的设 计和合成单纯合成的酶样化合物：化学合成的具有酶样催化活性的简单分子 根据模拟酶的属性，模拟酶可分为 主-客体酶模型、胶束酶模型、肽酶、抗体酶、分子印迹酶模型、半合成酶、 杂化酶和进化酶抗体酶 ：又称催化抗体是一类以过渡态类似物为半抗原通过诱导免疫系统产生的具有类似天 然酶催化活性的免疫球蛋白(抗体) 。分子印迹( molecular imprinting )是指制备对特定分子(烙印分子)具有 特异选择性 的聚合 物( molecular impr

36、inting polymer, MTP) 的过程。第五章 有机溶剂中的酶催化作用有机介质中的酶催化 ：酶在含有一定量水的有机溶剂中进行的催化反应。 适用于底物、 产物 两者或其中之一为疏水性物质的酶催化作用。气相介质中的酶催化： 适用于底物是气体或者能够转化为气体的物质的酶催化反应。 超临界流体介质中的酶催化： 超临界流体 ( Supercritical Fluid ,SCF) ：温度和压力超过某物质 超临界点的流体。离子液介质中的酶催化： 离子液： 由有机阳离子与有机 (无机) 阴离子构成的 在室温条件 下呈液态的低熔点盐类，挥发性好、稳定性好。有机介质反应体系1. 微水介质( microaqueous media )体系2. 与水溶性有机溶剂组成的均一体系3. 与水不溶性有机溶剂组成的两相或多相体系 催化反应通常在两相的界面进行。 一般适用于底物和产物两者或其中一种是属于疏水化合物 的催化反应。4. 正胶束体系在大量水溶液中含有少量