病毒学研究方法简介

1、生物安全实验室生物安全实验室 P1实验室实验室研究的病毒危险性较低，试验人员连口罩都不用研究的病毒危险性较低，试验人员连口罩都不用带，穿上白大褂就可以了，试验人员在这里很放松；带，穿上白大褂就可以了，试验人员在这里很放松； P2实验室实验室研究的是中度危险的病原，像研究的是中度危险的病原，像肝炎、流行性感冒肝炎、流行性感冒等等，要求戴防护性较好的口罩；等等，要求戴防护性较好的口罩； P3实验室实验室研究的是高度危险的病毒，传染性很强，而且没研究的是高度危险的病毒，传染性很强，而且没有疫苗，试验人员的保护措施要比有疫苗，试验人员的保护措施要比P1/P2实验室严密得多；实验室严密得多； P4实验室

2、实验室全球级别最高的生物安全实验室，研究的是极度全球级别最高的生物安全实验室，研究的是极度危险的病毒，如令人谈之色变的危险的病毒，如令人谈之色变的埃博拉病毒、马尔堡病毒埃博拉病毒、马尔堡病毒，进入，进入这种实验室的工作人员，处于防护服的严密保护之下，连空气都这种实验室的工作人员，处于防护服的严密保护之下，连空气都不能在实验室内呼吸，红色螺旋状管子，是专门用来向室内输送不能在实验室内呼吸，红色螺旋状管子，是专门用来向室内输送新鲜空气的，试验人员一进入实验室，要先屏住呼吸，马上接上新鲜空气的，试验人员一进入实验室，要先屏住呼吸，马上接上这种管子，然后才能呼吸。这种管子，然后才能呼吸。根据微生物及其

3、毒素的危害程度不同，分为级，根据微生物及其毒素的危害程度不同，分为级，一级最低，四级最高。一级最低，四级最高。病毒学研究的主要方法病毒学研究的主要方法生物学特性测定生物学特性测定:在宿主上的反应在宿主上的反应症状、传播症状、传播等等病毒分离与培养病毒分离与培养：提纯与纯化、二元培养法：提纯与纯化、二元培养法光镜与电镜观察光镜与电镜观察：病毒粒子和病毒与相应抗血病毒粒子和病毒与相应抗血清的特异免疫吸附情况清的特异免疫吸附情况免疫学技术免疫学技术：以血清学和组织免疫化学方法检测以血清学和组织免疫化学方法检测带毒情况、多克隆抗体、单克隆抗体带毒情况、多克隆抗体、单克隆抗体分子生物学技术分子生物学技术

4、：核酸分子杂交、核酸分子杂交、PCR等等一、生物学特性测定一、生物学特性测定 在宿主上的反应在宿主上的反应宿主范围、症状表现、传播方式宿主范围、症状表现、传播方式等等 病毒的理化性质病毒的理化性质病毒粒子的形态、大小、对理化因子的耐受性、病毒粒子的形态、大小、对理化因子的耐受性、体外存活期等体外存活期等 病毒接种方法病毒接种方法注射接种、病毒组织培养技术注射接种、病毒组织培养技术植物病毒植物病毒汁液摩擦接种、昆虫介体接种、嫁汁液摩擦接种、昆虫介体接种、嫁接接种、菟丝子接种法等接接种、菟丝子接种法等巨细胞病毒感染细胞的典型巨细胞病毒感染细胞的典型“猫头鹰眼猫头鹰眼”样核内包涵样核内包涵体体冠状病

5、毒感染冠状病毒感染“非典非典”X线胸部检查可见肺部不同程度的片状阴影，少线胸部检查可见肺部不同程度的片状阴影，少数病人进展迅速，呈大片状阴影，大多数为数病人进展迅速，呈大片状阴影，大多数为双侧改变，阴影吸收消散较慢。双侧改变，阴影吸收消散较慢。TMV transmission by an Apis sp. A severe mosaic symptom on tomato leaf (TMV)腿色斑腿色斑Chloroticspoting黄化黄化Yellowing病毒检测病毒检测二、病毒的分离与鉴定二、病毒的分离与鉴定提纯提纯extraction/纯化纯化purification病毒的分离与鉴定

6、病毒的分离与鉴定动物接种动物接种组织培养组织培养标本采集标本采集标本处理后接种标本处理后接种鸡胚接种鸡胚接种卵黄囊膜卵黄囊膜尿囊液尿囊液羊膜腔液羊膜腔液绒毛尿囊膜绒毛尿囊膜观察囊膜病变观察囊膜病变血凝试验血凝试验血凝抑制试验血凝抑制试验CPEEM包涵体包涵体空斑试验空斑试验红细胞吸附红细胞吸附中和试验中和试验观察发病观察发病抗原检测抗原检测抗体检测抗体检测病理检查病理检查 病毒的提纯是将宿主中的病毒粒子与宿主细胞组分区分开来的过程。 原理是利用病毒的蛋白质和大分子粒体的特性，及其与宿主细胞组分在理化特性上的差异将病毒粒子区分出来，并尽可能保持侵染力。 目的是确切地研究病毒理化、生物学特性、化学

7、组分、组成、增殖过程及机制，还可用于制备高效价的抗血清。 1953年，斯坦利第一次提取并结晶了 TMV，这是病毒学史上一个重要的里程碑。（一）病毒的纯化与提纯（一）病毒的纯化与提纯一般纯化方法一般纯化方法 动物病毒的纯化：动物病毒的纯化：从空斑、病斑分离，用终点稀释法从空斑、病斑分离，用终点稀释法 植物病毒的纯化：植物病毒的纯化： 如确定是一种病毒，且可机械摩擦接种，则如确定是一种病毒，且可机械摩擦接种，则接种到适当寄主上；接种到适当寄主上； 如可能有多种病毒，则要嫁接传染，先将病如可能有多种病毒，则要嫁接传染，先将病毒保存，然后试用虫媒或其他方法分离。毒保存，然后试用虫媒或其他方法分离。二、

8、病毒的分离与培养二、病毒的分离与培养1、差速离心和密度梯度离心、差速离心和密度梯度离心 差速离心：差速离心：交替使用高速和低速离心交替使用高速和低速离心高速离心（高速离心（4000080000g）使病毒沉淀，）使病毒沉淀，取沉淀取沉淀低速离心（约低速离心（约4000g）仅去除大的细胞碎片等杂质，）仅去除大的细胞碎片等杂质，取上清取上清 密度梯度离心：密度梯度离心：部分或完全根据颗粒在一个无对部分或完全根据颗粒在一个无对流介质中的密度而获得分离流介质中的密度而获得分离蔗糖蔗糖10%40%CsCl等等（三）病毒提纯的技术（三）病毒提纯的技术二、病毒的分离与培养二、病毒的分离与培养2、沉淀法、沉淀法

9、简便快速但粗糙易变性简便快速但粗糙易变性盐析法盐析法硫酸铵浓度达硫酸铵浓度达3050%饱和度时多数病毒沉淀饱和度时多数病毒沉淀等电点沉淀等电点沉淀加醋酸或盐酸加醋酸或盐酸丙酮沉淀丙酮沉淀浓度达浓度达4070%聚乙二醇沉淀聚乙二醇沉淀浓度达浓度达48%乙醇沉淀乙醇沉淀浓度达浓度达20%沉淀植物蛋白，上清夜用硫酸沉淀植物蛋白，上清夜用硫酸铵沉淀铵沉淀3、吸附法、吸附法磷酸钙、离子交换树脂、羧甲基纤维素磷酸钙、离子交换树脂、羧甲基纤维素4、酶处理、酶处理许多病毒抗许多病毒抗蛋白酶蛋白酶和和核酸酶核酸酶（三）病毒提纯的技术（三）病毒提纯的技术二、病毒的分离与培养二、病毒的分离与培养5、有机溶剂萃取、有

10、机溶剂萃取有机溶剂可溶掉脂肪、有色杂质或非病毒的变有机溶剂可溶掉脂肪、有色杂质或非病毒的变性蛋白，如脊髓灰质炎病毒提纯中用正丁醇：性蛋白，如脊髓灰质炎病毒提纯中用正丁醇：要考虑病毒对有机溶剂的耐受性要考虑病毒对有机溶剂的耐受性（三）病毒提纯的技术（三）病毒提纯的技术脂肪变性非病毒蛋白病毒水醇二、病毒的分离与培养二、病毒的分离与培养6、电泳法、电泳法普通电泳、密度梯度电泳、等电聚焦电泳等普通电泳、密度梯度电泳、等电聚焦电泳等7、柱层析法、柱层析法吸吸附：用离子交换或吸附法附：用离子交换或吸附法分子筛：琼脂糖或葡聚糖制成凝胶柱分子筛：琼脂糖或葡聚糖制成凝胶柱8、抗血清处理、抗血清处理针对宿主蛋白的

11、血清来沉淀杂蛋白针对宿主蛋白的血清来沉淀杂蛋白加病毒的抗血清形成病毒加病毒的抗血清形成病毒抗体复合物抗体复合物（三）病毒提纯的技术（三）病毒提纯的技术二、病毒的分离与培养二、病毒的分离与培养要证明某种疾病是某一感染因子所引起则必须满要证明某种疾病是某一感染因子所引起则必须满足足Rivers法则：法则：从患病者体内分离出病毒；从患病者体内分离出病毒；在实验动物或寄主细胞中可以培养；在实验动物或寄主细胞中可以培养；证明这种培养物具有滤过性；证明这种培养物具有滤过性；在原始宿主或相关种内能产生同样的病症；在原始宿主或相关种内能产生同样的病症；能重新分离出病毒。能重新分离出病毒。 病毒的分离与鉴定组成

12、了病毒学诊断技术的主体。病毒的分离与鉴定组成了病毒学诊断技术的主体。 病毒分离病毒分离(virusisolation)是诊断病毒感染的是诊断病毒感染的“金标金标准准”(goldstandard)。二、病毒的分离二、病毒的分离病毒的分离病毒的分离 组织培养组织培养 鸡胚培养鸡胚培养 动物接种动物接种组织培养：组织培养：原代细胞：原代细胞：新鲜组织新鲜组织+胰蛋白酶消化，分散胰蛋白酶消化，分散+培养液培养液成成单层细胞单层细胞二倍体细胞株二倍体细胞株：原代细胞传代（原代细胞传代（为二倍体细胞为二倍体细胞）传代细胞系传代细胞系：肿瘤组织或二倍体细胞自发转化肿瘤组织或二倍体细胞自发转化（非整倍体）（非

13、整倍体）二、病毒的分离与培养二、病毒的分离与培养卵黄囊接种：卵黄囊接种：用用58d鸡胚，以细长针由气室端刺入卵黄鸡胚，以细长针由气室端刺入卵黄囊，孵育后收集卵黄囊膜检查。常用于一些嗜神经病毒囊，孵育后收集卵黄囊膜检查。常用于一些嗜神经病毒羊膜腔：羊膜腔：用用1214d鸡胚，将检材注入羊膜腔，孵育后取羊鸡胚，将检材注入羊膜腔，孵育后取羊水检查。常用于流感病毒的初次分离水检查。常用于流感病毒的初次分离尿囊腔：尿囊腔：用用912d鸡胚，将标本接种于尿囊腔，孵育后取鸡胚，将标本接种于尿囊腔，孵育后取尿囊液检查。常用于培养流感病毒和腮腺炎病毒等尿囊液检查。常用于培养流感病毒和腮腺炎病毒等绒毛尿囊膜：绒毛

14、尿囊膜：用用1012d鸡胚，无菌下开一小窗，将材料鸡胚，无菌下开一小窗，将材料滴在绒毛尿囊膜上，孵育后观察膜上有无斑点病滴在绒毛尿囊膜上，孵育后观察膜上有无斑点病变。常用变。常用于培养单纯疱疹病毒，天花病毒和痘病毒于培养单纯疱疹病毒，天花病毒和痘病毒鸡胚接种鸡胚接种绒毛尿囊膜痘病毒特异性损伤绒毛尿囊膜痘病毒特异性损伤3.动物接种动物接种 常用动物常用动物小鼠、大白鼠、豚鼠、家兔、猴等。小鼠、大白鼠、豚鼠、家兔、猴等。不同病毒对动物的敏感性不同，根据病毒种类不同病毒对动物的敏感性不同，根据病毒种类加以选择。加以选择。 接种途径接种途径按病毒侵袭部位选择相应的接种途径按病毒侵袭部位选择相应的接种途

15、径： 乙型脑炎病毒及狂犬病毒乙型脑炎病毒及狂犬病毒小鼠脑内接种小鼠脑内接种 柯萨奇病毒柯萨奇病毒乳鼠腹腔接种乳鼠腹腔接种 乙肝病毒乙肝病毒黑猩猩静脉注射黑猩猩静脉注射 流感病毒流感病毒鼻腔滴种鼻腔滴种 用途用途分离鉴定病毒，制备疫苗，制备抗血清分离鉴定病毒，制备疫苗，制备抗血清标本制备标本制备浓缩标本有以下几种方法：浓缩标本有以下几种方法：超速离心超速离心离心的时间和速度取决于病毒颗粒的大小和离心离心的时间和速度取决于病毒颗粒的大小和离心机转头的半径，一般是机转头的半径，一般是30min到到3h沉淀的样本用灭菌蒸沉淀的样本用灭菌蒸馏水洗后再放到铜网上；馏水洗后再放到铜网上；超过滤法超过滤法用于

16、分子筛的蛋白质相对分子质量为用于分子筛的蛋白质相对分子质量为10000；接种细胞接种细胞接种细胞增殖病毒，然后快速包埋、切片；接种细胞增殖病毒，然后快速包埋、切片；免疫凝集免疫凝集如有特异抗血清，且病毒已知，也可用该法浓缩如有特异抗血清，且病毒已知，也可用该法浓缩病毒病毒1、正染法（超薄切片法、病组织）、正染法（超薄切片法、病组织）将细胞用戊二醛固定，然后脱水、包埋、切片、染色、观察病毒颗粒，将细胞用戊二醛固定，然后脱水、包埋、切片、染色、观察病毒颗粒，通常通常12d完成。完成。操作复杂、费时，但样品可长期保存，可观察病毒粒子形态与发生过操作复杂、费时，但样品可长期保存，可观察病毒粒子形态与发

17、生过程。程。2、负染法、负染法直接将病毒悬液直接将病毒悬液(也可用细胞也可用细胞)滴在铜网上，用重金属滴在铜网上，用重金属(通常用磷钨酸通常用磷钨酸)进行染色，观察病毒颗粒，进行染色，观察病毒颗粒，10-20min可出结果。可出结果。原理：原理：负性染料不渗入病毒颗粒，而是将病毒颗粒包绕，由于负性染负性染料不渗入病毒颗粒，而是将病毒颗粒包绕，由于负性染料含重金属使电子束不能穿透，病毒颗粒具有亮度，在周围暗背景上料含重金属使电子束不能穿透，病毒颗粒具有亮度，在周围暗背景上显示亮区显示亮区较正染法显示的图像清晰，可显示病毒的结构。较正染法显示的图像清晰，可显示病毒的结构。缺点：缺点：敏感性低，要求

18、病毒量在敏感性低，要求病毒量在107mL以上，同科病毒难于鉴别。以上，同科病毒难于鉴别。3、投影技术、投影技术4、胶体金标记技术、与免疫学技术结合、胶体金标记技术、与免疫学技术结合等等采用几种电镜技术观采用几种电镜技术观察病毒粒子的形态察病毒粒子的形态Orfvirus：口疮病毒口疮病毒(接触性脓疱皮炎接触性脓疱皮炎) )Ebolavirus埃博埃博拉病毒（正染技术）拉病毒（正染技术）Vacciniavirus痘苗病毒痘苗病毒（投影技术）（投影技术）负染技术负染技术美国疾病控制和预防中心公布的一张未标明日期的彩美国疾病控制和预防中心公布的一张未标明日期的彩色电子显微照片。它显示出色电子显微照片。它显示出H5N1型禽流感病毒（金型禽流感病毒（金黄色）在黄色）在MDCK细胞（绿色）培养液中的活动状态细胞（绿色）培养液中的活动状态电镜技术的应用电镜技术的应用 研究病毒形态、鉴定研究病毒形态、鉴定 观察病毒的形态及形态发生学过程；亚显微结构；观察病毒的形态及形态发生学过程；亚显微结构；病毒与宿主细胞的关系；病毒感染细胞的超微结构病毒与宿主细胞的关系；病毒感染细胞的超微结构改变；