实验四 电泳技术-LDH-SDS-PAGE及western__ blotting

1、实验四实验四电泳技术电泳技术一、定义一、定义 带电颗粒在电场作用下向着与其电性相反的电极带电颗粒在电场作用下向着与其电性相反的电极移动的现象，称为电泳。移动的现象，称为电泳。 带正电荷的粒子向负极移动，带负电荷的粒子向带正电荷的粒子向负极移动，带负电荷的粒子向正极移动。正极移动。 是生化与分子生物学的重要研究方法之一，可用是生化与分子生物学的重要研究方法之一，可用于于样品分离、物质纯度分析和分子量的测定样品分离、物质纯度分析和分子量的测定等。等。第一节第一节 电泳的基本原理电泳的基本原理+-1.1.许多生物分子带有电荷，在电场中可以发生许多生物分子带有电荷，在电场中可以发生 移动。移动。2.2

2、.每种分子迁移率不同，一定时间内在电场中每种分子迁移率不同，一定时间内在电场中 的迁移距离不同。的迁移距离不同。在一定在一定pH条件下，每一种分子条件下，每一种分子都具有特定的电荷（种类和数都具有特定的电荷（种类和数量）、大小和形状，在一定时量）、大小和形状，在一定时间内它们在相同电场中泳动速间内它们在相同电场中泳动速度不同，各自集中到特定的位度不同，各自集中到特定的位置上而形成紧密的泳动带。这置上而形成紧密的泳动带。这就是带电粒子可以用电泳技术就是带电粒子可以用电泳技术进行分离、分析和鉴定的基本进行分离、分析和鉴定的基本原理原理。原理原理二、电泳迁移率二、电泳迁移率 设一带电粒子在电场中所受

3、的力为设一带电粒子在电场中所受的力为F F，则，则 F = QEF = QE（Q Q为粒子所带电荷，为粒子所带电荷，E E为电场强度）为电场强度） 根据根据StokeStoke定律，一球形分子在溶液中运动定律，一球形分子在溶液中运动 所受的阻力所受的阻力f f为：为： f f = 6 = 6rvrv（v v为分子移动速度；为分子移动速度；r r为分子半径；为分子半径；为介质为介质 黏度）黏度） 当分子达到动态平衡时，当分子达到动态平衡时， F = F = f f 即即 QE= 6QE= 6rvrv 移项得移项得 v/E=Q/ 6rv/E=Q/ 6r v/E:v/E:表示单位电场强度时粒子运动速

4、度，称表示单位电场强度时粒子运动速度，称 为为迁移率迁移率，也称，也称电泳速度电泳速度，以，以 表示表示。 因此上式也可表示为：因此上式也可表示为： = = Q Q / 6/ 6r r 从上式可推知，从上式可推知，带电粒子在电场中的移动与带电粒子在电场中的移动与: : 粒子大小有关，颗粒愈小愈快粒子大小有关，颗粒愈小愈快 粒子的电荷有关，电荷愈多愈快粒子的电荷有关，电荷愈多愈快 粒子的形状有关，愈接近球形愈快粒子的形状有关，愈接近球形愈快三、影响迁移率的因素三、影响迁移率的因素1.1.电场强度（电场强度（E E） 电场强度是指每厘米的电位降。电泳速度与电场电泳速度与电场 强度成正比。强度成正比

5、。电场强度越高电泳速度越快电场强度越高电泳速度越快。 根据电场强度大小，电泳可分为： 常压电泳：210V/cm 高压电泳：20200V/cm2.2.溶液的溶液的pHpH值值 pH值决定带电颗粒的解离程度，决定物质所带净电荷的多少。选择合适pH，使混合物中各成分所带电量差别较大。 pHpIpHpI带负电带负电 pHpIpHpI时从阴极向阳极依次排列为LDH5、LDH4、LDH3、LDH2、LDH1 。 血清LDH同工酶检测的临床意义：血清LDH同工酶的正常值为LDH1 32.7%、LDH2 45.1%、LDH3 18.5%、LDH4 2.9%、LDH5 0.8% 不同组织中LDH同功酶谱不一样，临床上可根据酶谱的变化协助诊断 检测原理 乳酸钠为基质，在辅酶I（NAD+）的存在下，LDH能使乳酸钠脱氢生成丙酮酸，而NAD+还原成NADH+H+，NADH+H+可将氢传递给吩嗪二甲酯硫酸盐