生物化学第9章酶促反应动力学 ppt课件

1、第9章 酶促反响动力学一、化学动力学根底一、化学动力学根底二、底物浓度对酶反响速率的影响二、底物浓度对酶反响速率的影响三、酶的抑制造用三、酶的抑制造用四、温度对酶反响的影响四、温度对酶反响的影响五、五、pH对酶反响的影响对酶反响的影响六、激活剂对酶反响的影响六、激活剂对酶反响的影响(kinetics of enzyme-catalyzed reaction) 研讨酶促反响动力学的意义 酶促反响动力学是研讨酶促反响的速率以及影酶促反响动力学是研讨酶促反响的速率以及影响此速率的各种要素的科学。在研讨酶的构造与功响此速率的各种要素的科学。在研讨酶的构造与功能的关系以及酶的作用机制时，需求动力学提供实

2、能的关系以及酶的作用机制时，需求动力学提供实验证据；为发扬酶催化反响的高效率，寻觅最有利验证据；为发扬酶催化反响的高效率，寻觅最有利的反响条件；为了解酶在代谢中的作用和某些药物的反响条件；为了解酶在代谢中的作用和某些药物的作用机制等，都需求掌握酶促反响速率的规律。的作用机制等，都需求掌握酶促反响速率的规律。 二、底物浓度对酶反响速率的影响酶反响速率对底物浓度作图中间复合物学说 为了解释这个景象，为了解释这个景象，HenriHenri和和WurtzWurtz提出了提出了酶底物复合物学说。该学说以为，当酶催化酶底物复合物学说。该学说以为，当酶催化反响时，酶首先与底物结合，生成酶底物复反响时，酶首先

3、与底物结合，生成酶底物复合物，然后生成产物，并释放出酶。反响用下合物，然后生成产物，并释放出酶。反响用下式表示：式表示： S + E S + E ES P + E ES P + E 酶底物中间复合物存在的证据电子显微镜和电子显微镜和X X光衍射直接察看到酶与底物的复光衍射直接察看到酶与底物的复合物。合物。酶与底物结合后光谱发生变化。酶与底物结合后光谱发生变化。溶解度或热稳定性在参与底物后发生变化。溶解度或热稳定性在参与底物后发生变化。分别到了酶底物复合物。分别到了酶底物复合物。超离心沉降过程中，可察看到酶和底物共沉降的超离心沉降过程中，可察看到酶和底物共沉降的景象。景象。平衡透析时，察看究竟物

4、在半透膜两侧浓度不一平衡透析时，察看究竟物在半透膜两侧浓度不一样样( (半透膜的一侧有酶，另一侧无酶，有酶一侧底半透膜的一侧有酶，另一侧无酶，有酶一侧底物浓度高于无酶一侧物浓度高于无酶一侧) )。 1平衡学说Henri，Michaelis和和Menten方程方程 1902 1902年年HenriHenri和和BrownBrown提出了酶催化的反响提出了酶催化的反响机理机理 19131913年年MichaelisMichaelis和和MentenMenten完善了这个实完善了这个实际，他们以为酶反响的第一步是快速可逆的平际，他们以为酶反响的第一步是快速可逆的平衡，第二步慢，为限速反响。衡，第二步

5、慢，为限速反响。平衡学说推导反响速度方程的假设前提 在推导动力学方程时，有几点假设：在推导动力学方程时，有几点假设： 第一步迅速平衡，第二步慢，即第一步迅速平衡，第二步慢，即 k3 k k3 E S E，S ESS ES。 酶以酶以E E和和ESES两种形状存在。两种形状存在。 根据平衡学说推导速度方程设设Vf 为为E与与S结合的速度，结合的速度，Vr 为为ES解离的速度，解离的速度，那么那么Vfk 1 ( E0ES )( SES ) Vrk 2 ES 平衡时平衡时VfVr k 1 ( E0ES )( SES ) k 2 ES又又 S ES SESS根据平衡学说推导速度方程 k1 ( E0ES

6、 ) S k 2 ES 解出解出 ES 得得 ) (012ESSESEkk120SkkSEES 令令 ， 那么那么 12kkKs0SKSEESS根据平衡学说推导速度方程 由于由于V = k 3 ESV = k 3 ES，代入前式，代入前式得得 由于当一切的由于当一切的E E都成为都成为ESES时，可达最大反响时，可达最大反响速度，即速度，即Vm = k 3 E0 Vm = k 3 E0 ，所以，所以 这就是米氏方程。这就是米氏方程。 03SKSEkVSSKSVVSm0SKSEESS米氏方程SKSVVsm 米氏方程是一个双曲线方程，假设以米氏方程是一个双曲线方程，假设以SS为自为自变量，变量，V

7、 V为因变量，可以作出双曲线，与实验测得为因变量，可以作出双曲线，与实验测得的结果相符。的结果相符。 2稳态实际 1925 1925年，年，BriggsBriggs和和HaldaneHaldane提出了稳态提出了稳态steady steady statestate实际，对米氏方程做了一项很重要的修正：实际，对米氏方程做了一项很重要的修正： 在在 反响式中，反响式中，k3k3值不小，后一步骤不是限速步骤。值不小，后一步骤不是限速步骤。 所谓稳态是指反响进展一段时间后，系统中的所谓稳态是指反响进展一段时间后，系统中的酶底物复合物浓度由零逐渐添加到一定数值，然酶底物复合物浓度由零逐渐添加到一定数值，

8、然后坚持不变，即处于稳态程度，此时后坚持不变，即处于稳态程度，此时ESES的解离和分的解离和分解速率之和等于解速率之和等于ESES的构成速率，的构成速率，根据稳态学说推导速度方程产生产生ES的速率的速率耗费耗费ES的速率的速率 稳态时稳态时所以所以32ESkESkdtESd0dtESd)(01SESEkdtESd)(3201ESkESkSESEk根据稳态学说推导速度方程 移项得移项得1320)(kkkESSESE)(3201ESkESkSESEk令令 ，代入上式得，代入上式得 132kkkKmmKESSESE)(0将上式中的将上式中的ESES解出得解出得 0SKSEESm此此ESES即为稳态时

9、的复合物浓度。即为稳态时的复合物浓度。 根据稳态学说推导速度方程由于酶反响速率与由于酶反响速率与ESES成正比，即成正比，即 所以所以 3ESkV 03SKSEkVm0SKSEESm又由于当一切的酶都与底物结合构成复合物时，又由于当一切的酶都与底物结合构成复合物时，反响速率到达最大，即反响速率到达最大，即 ，代入上式得，代入上式得 03EkVmSKSVVmmSKSVVsm稳态法稳态法快速平衡法快速平衡法两个米氏方程的区别 这两个方程的区别就在于快速平衡法推导这两个方程的区别就在于快速平衡法推导的方程中米氏常数是的方程中米氏常数是KsKs，而稳态法推导的米氏，而稳态法推导的米氏方程中米氏常数是方

10、程中米氏常数是KmKm。 12kkKs 132kkkKmKs是是ES的解离平衡常数的解离平衡常数米氏方程的几个特点从米氏方程中可以看出：从米氏方程中可以看出：当当S Km时，时， ，反响速率到达最，反响速率到达最大，并与底物浓度无关，属零级反响；大，并与底物浓度无关，属零级反响；当当S = Km时，时， ，所以，所以，Km的意义的意义是使反响速率到达最大反响速率一半时的底物是使反响速率到达最大反响速率一半时的底物浓度。浓度。mmKSVVmmVSSVV2 2mmVSSVV米氏方程曲线米氏常数的意义 Km是酶的特征性常数，其单位是浓度单位。在一是酶的特征性常数，其单位是浓度单位。在一定的反响条件下

11、，对于一定的底物，定的反响条件下，对于一定的底物，Km是定值。是定值。 Km可以判别酶的天然底物。有些酶可以作用于几可以判别酶的天然底物。有些酶可以作用于几个底物，其中个底物，其中Km最小的底物是天然底物。最小的底物是天然底物。 当当k3 KmSKm时，时，V = Vm = k3E0V = Vm = k3E0，此时对底物，此时对底物来说是零级反响，对酶来说是一级反响，来说是零级反响，对酶来说是一级反响，k3k3是一是一级反响速率常数，级反响速率常数，k3k3表示当酶被底物饱和时每秒表示当酶被底物饱和时每秒钟每个酶分子转换底物的分子数又称为转换钟每个酶分子转换底物的分子数又称为转换数，这时的数，

12、这时的k3k3又可以写成又可以写成 kcatkcat，kcat kcat 越大，越大，阐明酶的催化效率越高。阐明酶的催化效率越高。 kcat /Km的意义的意义 Kcat /Km Kcat /Km表示酶的催化效率，表示酶的催化效率，Kcat /KmKcat /Km越越大，催化效率越高。大，催化效率越高。 ，其最大值极，其最大值极限是限是k1k1，而，而k1k1是酶与底物结合的速率常数，此是酶与底物结合的速率常数，此常数遭究竟物在溶液中分散速度的影响。常数遭究竟物在溶液中分散速度的影响。 32313kkkkKkm作图法求Km和Vm值 Lineweaver-Burk双倒数作图法 将米氏方程两边取倒

13、数得将米氏方程两边取倒数得 在一系列在一系列SS下测出相应的反响速率下测出相应的反响速率v v，以，以 对对 作图，可得出作图，可得出KmKm和和VmVm值。值。 mmmVSVKV1111SV1米氏方程的双倒数图多底物的酶促反响动力学 酶促反响按底物分子数的分类酶促反响按底物分子数的分类底物数酶分类催化反应酶种类占总酶百分数单底物单底物单向单底物单向单底物假单底物假单底物异构酶异构酶裂合酶裂合酶水解酶水解酶A BA B + CA-B + H2O AOH + BH5%12%26%双底物双底物氧化还氧化还原酶原酶转移酶转移酶AH2 B A + BH2A2+ + B3+ A3+ + B2+A + B

14、X AX + B27%24%三底物三底物连接酶连接酶A + B + ATP AB + ADP + Pi A + B + ATP AB + AMP + PPi6%多底物反响按动力学机制分类序列反响 底物的结合和产物的释放有一定的顺序：底物的结合和产物的释放有一定的顺序：E+A+BEABEPQE+P+QE+A+BEABEPQE+P+Q 产物不能在两种底物都结合之前释放。这产物不能在两种底物都结合之前释放。这类反响又可以分为两种类型。类反响又可以分为两种类型。有序反响ordered reaction 其中其中P P是是B B转变的产物，转变的产物，Q Q是是A A转变的产物。转变的产物。如脱氢酶的辅

15、酶如脱氢酶的辅酶NAD(P)+NAD(P)+相当于相当于A A，NAD(P)HNAD(P)H相当相当于于Q Q。 随机反响random reaction 如肌酸激酶催化肌酸与如肌酸激酶催化肌酸与ATPATP反响生成磷反响生成磷酸肌酸和酸肌酸和ADPADP。乒乓反响乒乓反响ping pong reactionping pong reaction 如转氨酶催化转氨反响：如转氨酶催化转氨反响：氨基酸氨基酸1 1 酮酸酮酸2 2 酮酸酮酸1 1 氨基氨基酸酸2 2 A B P Q三、酶的抑制造用 因酶蛋白变性而酶活力丧失称为酶的失活作用，因酶蛋白变性而酶活力丧失称为酶的失活作用，而由于某种物质与酶结合

16、使酶活力丧失称为酶的抑而由于某种物质与酶结合使酶活力丧失称为酶的抑制造用，酶受抑制丧失活力时酶蛋白并没有变性。制造用，酶受抑制丧失活力时酶蛋白并没有变性。能抑制酶活力的物质称为酶的抑制剂能抑制酶活力的物质称为酶的抑制剂inhibitorinhibitor。 研讨酶的抑制造用是研讨酶的构造和功能、酶研讨酶的抑制造用是研讨酶的构造和功能、酶的催化机制，以及阐明代谢途径的根本手段，也可的催化机制，以及阐明代谢途径的根本手段，也可以为医药设计新药物和为新农药的研制提供实际根以为医药设计新药物和为新农药的研制提供实际根据。据。抑制程度的表示方法 %100)1 (%100)1 (%0VVaii1相对活力分

17、数剩余活力分数相对活力分数剩余活力分数2相对活力百分数剩余活力百分数相对活力百分数剩余活力百分数3抑制分数被抑制而失去活力的分数抑制分数被抑制而失去活力的分数4抑制百分数抑制百分数0VVai%100%0VVai011VVaii抑制造用的类型1不可逆抑制造用不可逆抑制造用irreversible inhibition 抑制剂与酶活性中心的基团以共价键结合，抑制剂与酶活性中心的基团以共价键结合，不能用透析、超滤、凝胶过滤等物理方法去除。不能用透析、超滤、凝胶过滤等物理方法去除。2可逆抑制造用可逆抑制造用reversible inhibition 抑制剂与酶活性中心的基团以非共价键结合，抑制剂与酶活

18、性中心的基团以非共价键结合，可以用透析、超滤、凝胶过滤等物理方法去除可以用透析、超滤、凝胶过滤等物理方法去除而使酶恢复活力。而使酶恢复活力。可逆抑制造用的3种类型 1竞争性抑制竞争性抑制competitive inhibition I 和和 S 竞争与酶的活性中心结合，二者只能竞争与酶的活性中心结合，二者只能结合一个。竞争性抑制剂通常是底物类似物，结合一个。竞争性抑制剂通常是底物类似物，它可以与酶结合，但不能被酶催化发生反响。它可以与酶结合，但不能被酶催化发生反响。竞争性抑制剂举例可逆抑制造用的3种类型2非竞争性抑制非竞争性抑制noncompetitive inhibition I 与与 S

19、可以分别与酶结合，谁先结合都可以，可以分别与酶结合，谁先结合都可以，构成构成 ESI 三元复合物，但三元复合物，但 ESI 中的中的 S 不能转变成不能转变成产物。这类抑制剂是与酶活性中心之外的某个部产物。这类抑制剂是与酶活性中心之外的某个部位结合。位结合。竞争性和非竞争性抑制剂的抑制机理可逆抑制造用的3种类型3反竞争性抑制剂反竞争性抑制剂uncompetitive inhibition I 只与只与 ES 结合，只需结合，只需 ES 能分解出产物，能分解出产物，ESI 中中的的 S 不能转变成产物。由于不能转变成产物。由于 I 的存在促进了的存在促进了 E 和和S 的结合，所以称为反竞争性抑

20、制。的结合，所以称为反竞争性抑制。 ES + I ESI P + E + I可逆抑制造用和不可逆抑制造用的动力学鉴别 在反响系统中参与一定量的抑制剂，以及在反响系统中参与一定量的抑制剂，以及不同量的酶，测定反响速率与酶量的关系。斜不同量的酶，测定反响速率与酶量的关系。斜率较小的直线是可逆抑制剂，不经过原点但斜率较小的直线是可逆抑制剂，不经过原点但斜率与对照一样的是不可逆抑制剂。率与对照一样的是不可逆抑制剂。1. control2. irreversible inhibitor3. reversible inhibitor可逆抑制造用和不可逆抑制造用的动力学鉴别 在反响系统中参与不同量的酶及抑制

21、剂，作不在反响系统中参与不同量的酶及抑制剂，作不同抑制剂浓度下反响速率对酶量的直线。可逆抑制同抑制剂浓度下反响速率对酶量的直线。可逆抑制剂得到的是一组经过原点但斜率不同的直线，不可剂得到的是一组经过原点但斜率不同的直线，不可逆抑制剂得到的是一组不经过原点但斜率与对照一逆抑制剂得到的是一组不经过原点但斜率与对照一样的平行线。样的平行线。一些重要的不可逆抑制剂 1 1非专注性不可逆抑制剂非专注性不可逆抑制剂 有机磷化合物有机磷化合物 有机汞、有机砷化合物有机汞、有机砷化合物 重金属盐重金属盐 烷化试剂烷化试剂 氰化物、硫化物和氰化物、硫化物和COCO 青霉素青霉素2 2专注性不可逆抑制剂专注性不可

22、逆抑制剂 Ks Ks型不可逆抑制剂型不可逆抑制剂 Kcat Kcat型不可逆抑制剂型不可逆抑制剂 有机磷化合物 很多农药是有机磷化合物，它们能抑制某些蛋白很多农药是有机磷化合物，它们能抑制某些蛋白酶及酯酶的活力，与酶分子活性部位的丝氨酸羟基共酶及酯酶的活力，与酶分子活性部位的丝氨酸羟基共价结合而使酶失活。这类化合物剧烈地抑制胆碱酯酶价结合而使酶失活。这类化合物剧烈地抑制胆碱酯酶活力，使乙酰胆碱不能水解成乙酸和胆碱，导致乙酰活力，使乙酰胆碱不能水解成乙酸和胆碱，导致乙酰胆碱积累，引起神经中毒病症。所以这类化合物又称胆碱积累，引起神经中毒病症。所以这类化合物又称为神经毒剂。用解磷定碘化醛肟甲基吡啶

23、或氯磷为神经毒剂。用解磷定碘化醛肟甲基吡啶或氯磷定氯化醛肟甲基吡啶能把酶上的毒剂夺取下来，定氯化醛肟甲基吡啶能把酶上的毒剂夺取下来，使酶恢复活力，到达解毒的作用。使酶恢复活力，到达解毒的作用。 有机磷化合物解磷定的解毒机理有机汞化合物 有机汞化合物能与酶的巯基结合而使酶失活。有机汞化合物能与酶的巯基结合而使酶失活。过量的半胱氨酸或复原型谷胱甘肽能解毒。过量的半胱氨酸或复原型谷胱甘肽能解毒。 有机砷化合物 有机砷化合物能与酶的巯基结合而使酶失活。有机砷化合物能与酶的巯基结合而使酶失活。BALBAL二巯基丙醇能解毒。二巯基丙醇能解毒。 路易斯毒气路易斯毒气为了六十一个阶级兄弟重金属盐 Ag+ Ag

24、+、Cu2+Cu2+、Hg2+Hg2+、Pb2+Pb2+、Fe3+Fe3+在高浓度时能使在高浓度时能使酶蛋白变性，低浓度时抑制某些酶的活力。可用金酶蛋白变性，低浓度时抑制某些酶的活力。可用金属螯合剂属螯合剂EDTAEDTA、半胱氨酸等螯合除去重金属离子。、半胱氨酸等螯合除去重金属离子。 烷化试剂含有一个活泼的卤素离子，可以修饰烷化试剂含有一个活泼的卤素离子，可以修饰酶分子中的许多基团，如巯基、氨基、羧基、咪唑酶分子中的许多基团，如巯基、氨基、羧基、咪唑基及硫醚基等。基及硫醚基等。烷化试剂氰化物、硫化物和CO 氰化物能与细胞色素氧化酶中的氰化物能与细胞色素氧化酶中的Fe2+Fe2+结合，使结合，

25、使酶失活不能呼吸。酶失活不能呼吸。COCO与血红蛋白结合阻止氧运输。与血红蛋白结合阻止氧运输。硫化物能与多种含金属的酶构成较为稳定的络合物，硫化物能与多种含金属的酶构成较为稳定的络合物，使酶失活。使酶失活。 糖肽转肽酶在细菌细胞壁合成中使肽聚糖链交糖肽转肽酶在细菌细胞壁合成中使肽聚糖链交联。青霉素与糖肽转肽酶的丝氨酸羟基结合，使细联。青霉素与糖肽转肽酶的丝氨酸羟基结合，使细菌细胞壁不能合成。菌细胞壁不能合成。 青霉素 青霉素的抗菌机理Ks型不可逆抑制剂型不可逆抑制剂 此类抑制剂构造与底物类似，并带有高反响性基此类抑制剂构造与底物类似，并带有高反响性基团，与酶活性部位结合后，修饰活性部位的基团使

26、酶团，与酶活性部位结合后，修饰活性部位的基团使酶失活。主要修饰活性部位，其它部位也能够修饰。失活。主要修饰活性部位，其它部位也能够修饰。 胰蛋白酶的人工底物胰蛋白酶的人工底物胰蛋白酶的胰蛋白酶的KsKs型抑制剂型抑制剂Kcat型不可逆抑制剂型不可逆抑制剂 此类抑制剂不但构造与底物类似，而且需求经酶此类抑制剂不但构造与底物类似，而且需求经酶催化反响后才产生高反响性基团，比催化反响后才产生高反响性基团，比KsKs型不可逆抑制型不可逆抑制剂专注性更强。剂专注性更强。 -卤代卤代-D-D-丙氨酸丙氨酸 磷酸吡哆醛磷酸吡哆醛丙氨酸消旋酶丙氨酸消旋酶可逆抑制剂底物的类似物合成叶酸的组分合成叶酸的组分磺胺药

27、物竞争抑制二氢磺胺药物竞争抑制二氢叶酸合成酶的活性叶酸合成酶的活性 蝶呤蝶呤 对氨基苯甲酸对氨基苯甲酸 谷氨酸谷氨酸 叶酸叶酸磺胺药物磺胺药物可逆抑制剂 过渡态底物类似物 过渡态底物类似物抑制力更强，由于酶过渡态底物类似物抑制力更强，由于酶对过渡态底物的亲和力比对底物的亲和力强对过渡态底物的亲和力比对底物的亲和力强得多。得多。多种酶催化反响多种酶催化反响时的过渡态底物时的过渡态底物过渡态底物类似物过渡态底物类似物可逆抑制剂 过渡态底物类似物可逆抑制剂 过渡态底物类似物四、温度对酶反响的影响 在较低温度范围内，酶反响速率随着温度的在较低温度范围内，酶反响速率随着温度的升高而添加，当温度高到一定程

28、度时，酶开场变升高而添加，当温度高到一定程度时，酶开场变性失活，反响速率反而下降。所以对于酶反响来性失活，反响速率反而下降。所以对于酶反响来说，有一个最适反响温度。普通来说，动物细胞说，有一个最适反响温度。普通来说，动物细胞内酶的最适反响温度在内酶的最适反响温度在35354040，植物细胞中的，植物细胞中的酶可达酶可达40405050，也有一些生长在堆肥、温泉中，也有一些生长在堆肥、温泉中的微生物酶的最适温度更高，如的微生物酶的最适温度更高，如Taq DNATaq DNA聚合酶的聚合酶的最适温度可高达最适温度可高达7070。 需求留意的是，最适温度值不是酶的特征性需求留意的是，最适温度值不是酶的特征性常数，此值随着反响时间的延伸而有所下降。常数，此值随着反响时间的延伸而有所下降。温度对酶反响速率的影响五、pH对酶反响的影响 酶的活力受环境酶的活力受环境pHpH的影响，存在一个最适的影响，存在一个最适反响反响pHpH。酶的最适反响。酶的