DNA电泳实验步骤PPT学习教案

1、会计学1DNA电泳实验步骤电泳实验步骤 琼脂糖凝胶电泳是常用的用于分离、鉴定DNA、RNA分子混合物的方法，这种电泳方法以琼脂凝胶作为支持物，利用DNA分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应，达到分离混合物的目的。DNA分子在高于其等电点的溶液中带负电，在电场中向阳极移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即分子本身的大小和构型是主要的影响因素。DNA分子的迁移速度与其相对分子量成反比。不同构型的DNA分子的迁移速度不同。如环形DNA分子样品，其中有三种构型的分子：共价闭合环状的超螺旋分子（cccDNA）、开环分子(ocDNA)、和线形DNA分子(IDNA)。这三种不同构型

2、分子进行电泳时的迁移速度大小顺序为:cccDNAIDNAocDNA 当用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙啶(Ethidium bromide, EB)染色，在紫外光下至少可以检出1-10ng的DNA条带，从而可以确定DNA片段在凝胶中的位置。此外，还可以从电泳后的凝胶中回收特定的DNA条带，用于以后的克隆操作。 第1页/共12页第2页/共12页微波炉微波炉实验仪器实验仪器第3页/共12页凝胶电泳槽凝胶电泳槽第4页/共12页凝胶成像凝胶成像系统系统第5页/共12页第6页/共12页4.加样：取加样：取10L DNA样品与样品与2L 6上样液混匀，用微量移液枪小心上样液混匀，用微量移液枪小心加入样品槽中。

3、若加入样品槽中。若DNA含量偏低，则可依上述比例增加上样量，含量偏低，则可依上述比例增加上样量，但总体积不可超过样品槽容量。每加完一个样品要更换但总体积不可超过样品槽容量。每加完一个样品要更换tip头，以头，以防止互相污染，注意上样时要小心操作，避免损坏凝胶或将样品槽防止互相污染，注意上样时要小心操作，避免损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿。底部凝胶刺穿。 5.电泳：加完样后电泳：加完样后,合上电泳槽盖，立即接通电源。控制电压保持在合上电泳槽盖，立即接通电源。控制电压保持在60-80V，电流在，电流在40mA以上。当溴酚蓝条带移动到距凝胶前沿约以上。当溴酚蓝条带移动到距凝胶前沿约2cm时，停止电泳

4、。时，停止电泳。6.染色：未加染色：未加EB的胶板在电泳完毕后移入的胶板在电泳完毕后移入0.5g/mL的的EB溶液中，室溶液中，室温下染色温下染色20-25min。 7.观察和拍照：在波长为观察和拍照：在波长为254nm的长波长紫外灯下观察染色后的或已的长波长紫外灯下观察染色后的或已加有加有EB的电泳胶板。的电泳胶板。 第7页/共12页 琼脂糖通常用水平装置在强度和方向恒定的电场下琼脂糖通常用水平装置在强度和方向恒定的电场下电泳。琼脂糖主要在电泳。琼脂糖主要在DNA制备电泳中作为一种固体支制备电泳中作为一种固体支持基质，其密度取决于琼脂糖的浓度。在电场中，在持基质，其密度取决于琼脂糖的浓度。在

5、电场中，在中性中性pH值下带负电荷的值下带负电荷的DNA向阳极迁移，其迁移速率向阳极迁移，其迁移速率由下列多种因素决定：由下列多种因素决定： 1、 DNA的分子大小的分子大小 2、 琼脂糖浓度琼脂糖浓度 3、 DNA分子的构象分子的构象 4、 电源电压电源电压 5、嵌入染料的存在、嵌入染料的存在 6、 离子强度影响离子强度影响 第8页/共12页DNADNA存在处显示出肉眼可辨的桔红色荧光条带存在处显示出肉眼可辨的桔红色荧光条带 第9页/共12页1. EB是强诱变剂并有中等毒性，配制和使用时都应戴手套是强诱变剂并有中等毒性，配制和使用时都应戴手套，并且不要把，并且不要把EB洒到桌面或地面上。凡是沾污了洒到桌面或地面上。凡是沾污了EB的容的容器或物品必须经专门处理后才能清洗。沾染了器或物品必须经专门处理后才能清洗。沾染了EB的垃圾的垃圾要专门处理后才可丢弃。要专门处理后才可丢弃。2. 当当EB太多太多, 胶染色过深，胶染色过深，DNA带看不清时，可将胶放入带看不清时，可将胶放入蒸馏水冲泡，蒸馏水冲泡，30min后再观察。后再观察。 3. 制备凝胶时，倒胶的温度不可太低，否则凝固不均匀：制备凝胶时，倒胶的温度不可太低，否则凝固不均匀：速度也不可太快，否则容易出现气泡。速度也不可太快，否则