基因工程原理第12章植物基因工程

1、无脊椎动物的DNA转移 果蝇的P元件 P元件是果蝇的转座元件，在特定的条件下，可在果蝇的生殖细胞中高度转移 P-M杂种不育 P元件和侧翼序列克隆到pBR322载体上，用于转座1果蝇的早期胚胎发生2作为载体系统的P元件衍生物3植物基因工程 4Introduction 人们应经投入相当的努力来培育各种产量及营养价值提高的作为 玉米、小麦、水稻、其他食用植物和园艺品种 用于微生物系统的重组DNA技术，对植物同样有效 植物细胞具有全能性5转基因植物的应用 抗虫、抗病毒传染、抗除草剂、抗病原真菌和细菌、延缓衰老、环境压力耐受、花色改变、种子中蛋白营养含量增加、收割后保质期延长以及自交不亲和性。 治疗剂、

2、多聚体、诊断试剂，如抗体片段 口服疫苗6CellExtracted DNACell divisionTransgenic plantA single geneTransformationPlant cellPlant Genetic Engineering Process植物愈伤组织和细胞培养 愈伤组织的培养 外植体 平衡的植物激素8脱落酸脱落酸吲哚乙酸吲哚乙酸 生长素生长素愈伤组织愈伤组织 细胞悬浮培养 愈伤组织转移到液体培养基，加以搅动，细胞团块就会打碎，形成含有单个细胞、小的细胞丛和形体更大的细胞集合体的悬浮液9 原生质体 将细胞的纤维素壁去除后余下的部分 由悬浮培养物、愈伤组织或完整组

3、织获得 原生质体融合10可育植物的再生 外植体、愈伤组织、细胞悬浮液或原生质体置于适当的培养基上使完整的可育植物再生。1112器官形成器官形成体细胞胚发生体细胞胚发生合子胚发生合子胚发生利用土壤农杆菌的Ti质粒进行植物转化 农杆菌是一种植物病原菌，可以在其正常的生命周期中，遗传转化植物细胞。 这种遗传转化导致植物形成冠瘿瘤，干扰受感染植物的正常生长。13 冠瘿瘤的形成 农杆菌可以在双子叶植物的伤口处诱生冠瘿瘤。 即使细菌被杀死后，愈伤组织仍可以体外培养，并保留肿瘤特性。14冠瘿碱的代谢 冠瘿病的重要特征 冠瘿碱的类型由细菌株系决定15致瘤质粒Ti 植物细胞的转化状态不需要农杆菌的持续存在 “肿

4、瘤诱导要素” 根瘤农杆菌的有毒菌株中含有大的质粒 去除这些质粒后，细菌的毒性和诱导冠瘿碱的合成能力就会丧失， 当有毒质粒导入无毒菌株时，就会使菌株获得以上特性 因此，这种质粒称作致瘤质粒 Ti16 Ti质粒限定了受转化的植物组织中合成的冠瘿碱的类型，也限定了细菌所利用的冠瘿碱。17T-DNA转化 植物肿瘤细胞中并没有发现完整的Ti质粒，而是质粒的一个小的特异片段，大约23kb 冠瘿瘤的形成就是这一特定片段基因转移、整合到植物细胞的基因组上，进行表达的结果 T-DNA（转移DNA） 这些基因不是转化所必须的，并且可以为外源DNA取代18 T-DNA的长度在不同菌株的质粒中是不同的，范围大约是12

5、-24 kb T-DNA的两侧是25bp的不完全正向重复序列，称作边界序列 边界序列与转化过程有关，删除右边界序列使T-DNA不能转化，左边界序列可能是非必须的19转化时所需的基因 对T-DNA转化起作用的基因位于Ti质粒上的一个独立部分，叫做vir （毒性区域） 其中，virA和virC低水平组成型表达，并且控制其他vir基因的激活 virA是一个跨膜激酶，是受伤植物细胞释放的某种酚类分子的受体20 酚类化合物并不吸引细菌到受损伤的植物细胞，而糖类和氨基酸则会诱导vir基因 VirA激活后，磷酸化VirC，VirC是其他vir基因的转录激活剂 vir基因的表达会合成用于形成接合纤毛的蛋白，通

6、过接合纤毛将T-DNA导入植物细胞21 DNA的转化是由virD1和virD2基因的产物形成的核酸内切酶起始的 在T-DNA的25bp边界区引入单链缺刻或者双链断裂 virD2蛋白保持共价的结合在加工过的T-DNA上 最终将DNA导入细胞核22 农杆菌将基因导入植物基因组 农杆菌还可以将DNA转化进入其他的细菌和酵母 基因从农杆菌转入培养的人类细胞也是可能的23Ti质粒转化 利用Ti质粒转化植物的最简单的办法就是把目的基因插入到T-DNA，然后利用Ti质粒和农杆菌将该基因转移和插入到易感的植物细胞的基因组中。24Ti质粒的局限性 在培养基中生长的转化细胞产生的植物激素阻止它们再生成为成熟的植株

7、。 编码冠瘿碱的基因对转基因植物没有用处 Ti质粒很大（200 800 kb） Ti质粒在大肠杆菌中不能复制25卸甲Ti质粒的衍生物用作植物载体T-DNA基因的功能 编码生长素和冠瘿碱生物合成所需要的酶26T-DNA的结构和转录27卸甲Ti载体 删除T-DNA中包含的致瘤基因，将T-DNA卸甲为没有致瘤性的载体，可以有效的使植物再生。28 利用冠瘿碱产物筛选 引入显性选择标记，通过药物或者除草剂抗性筛选29共整合载体 卸甲Ti载体个体较大操作不便，酶切位点缺乏 “三亲本交配”实现转化30双元载体 Ti质粒的vir基因的功能是以反式方式来实现的 vir基因和包含转化基因的卸甲T-DNA可以由不同

8、的质粒提供双元载体31根瘤农杆菌叶盘转化32农杆菌与单子叶植物 大部分单子叶植物在农杆菌的宿主范围之外 受伤的单子叶植物不能产生足够水平的酚类物质来诱导vir基因表达 农杆菌转化水稻是第一个得到转化的谷类植物 单子叶植物的受伤位点倾向于木质化 添加酚类物质，增强毒性功能33高容量双元载体 非常大的基因分析或者多基因的转化 BIBAC2，包含一个F质粒的复制起始位点，并且模仿细菌人工染色体 反式提供高水平的VirG和VirE的毒性辅助质粒 TAC，模仿P1人工染色体的载体 用于由突变确定的基因的定位克隆34根毛农杆菌与Ri质粒 毛根农杆菌引起植物毛状根疾病，它是由根诱导质粒（Ri）引发的 Ri质

9、粒是类似于根瘤农杆菌的Ti质粒 Ri T-DNA在植物中通过有性方式传递，并影响多种形态学和生理学性状，但通常可能不具有毒性35DNA直接转化植物原生质体转化 扩大农杆菌的宿主范围 聚乙二醇、电转化 原生质体转化的主要限制不在于基因转化过程本身，而是在于宿主物种从原生质体再生的能力36基因枪 使用金属颗粒包裹DNA，以足够穿透细胞壁的速度打入植物细胞。 TMV轰击洋葱表皮 大豆、烟草、玉米 应用范围没有限制，完全由物理参数控制37整株（in planta）转化 减少对组织培养的需求 拟南芥 个体小，每株产生的种子多 种子在农杆菌的培养物中浸泡吸取过夜，然后再进行发芽 将细菌真空渗透进拟南芥的花中 将受精时期的花浸泡在细菌悬液中38叶绿体转化 T-DNA复合物往往都要进入细胞核 衣藻，单个的大型叶绿体 颗粒轰击 基因枪和聚乙二醇转化实现有效的叶绿体转化39植物病毒载体农杆菌或DNA直接转移的替代，具有以下优点： 病毒可以吸附完整的植物细胞并将其核酸导入 感染细胞可以产生大量病毒，可以进行高水平的基因表达 病毒感染通常是全系统的 病毒感染很快，几周之内就会产生大量的重组蛋白 植物病毒是游离型复制，不受位置效应的影响40DNA病毒载体花椰菜花叶病毒 典型成员是CaMV 最大插入片段小于1kb41双粒病毒 具有一对病毒粒子，它们含有两个可以