常用分子生物学技术

1、1北京八达岭长城北京八达岭长城2广西北海银滩海水浴场广西北海银滩海水浴场3杭州西湖涌金桥杭州西湖涌金桥45第六章第六章常用分子生物学技术常用分子生物学技术（第二讲）（第二讲）6掌握掌握：1. 1.分子杂交技术的概念及基本原理分子杂交技术的概念及基本原理2.2.SoutherSouther、NorthernNorthern、WesternWestern印迹法印迹法的适用范围。的适用范围。3.3.聚合酶链式反应的概念及基本原理聚合酶链式反应的概念及基本原理4.4.RNARNA干扰技术干扰技术5.5.反义核酸及药物反义核酸及药物学习要求学习要求学习要求7第六章第六章 常用分子生物学技术常用分子生物学

2、技术第一节第一节 分子杂交技术分子杂交技术第二节第二节 目的基因制备技术目的基因制备技术第三节第三节 基因敲除技术基因敲除技术第四节第四节 RNARNA干扰技术干扰技术补充：反义核酸及药物（第八章补充：反义核酸及药物（第八章P202P202）8核酸的分子杂交：核酸的分子杂交： 碱基序列互补碱基序列互补的单链核酸，根据的单链核酸，根据碱基互补原则，借助氢键相连而形成碱基互补原则，借助氢键相连而形成双链双链杂交分子杂交分子的过程。的过程。第一节第一节 分子杂交技术分子杂交技术基本原理基本原理91.Southern1.Southern印迹杂交法：印迹杂交法： 检测特异检测特异DNADNA片段片段2.

3、Nouthern2.Nouthern印迹杂交法：印迹杂交法： 检测特异的检测特异的RNARNA片段片段3.Western3.Western印迹杂交法：印迹杂交法： 检测检测蛋白质蛋白质第一节第一节 分子杂交技术分子杂交技术 应用应用10第一节第一节 分子杂交技术分子杂交技术 应用应用基因芯片在药物研究方面的贡献基因芯片在药物研究方面的贡献p用于药物作用新靶标的发现。用于药物作用新靶标的发现。p进行药物作用机制的研究。进行药物作用机制的研究。p用于药物基因组学研究，实施个体化治疗。用于药物基因组学研究，实施个体化治疗。p进行毒理学研究进行毒理学研究, , 用于药品安全性评价。用于药品安全性评价。

4、 11第六章第六章 常用分子生物学技术常用分子生物学技术第一节第一节 分子杂交技术分子杂交技术第二节第二节 目的基因制备技术（目的基因制备技术（PCRPCR）第三节第三节 基因敲除技术基因敲除技术第四节第四节 RNARNA干扰技术干扰技术补充：反义核酸及药物（第八章补充：反义核酸及药物（第八章P202P202）12第二节第二节 目的基因制备技术目的基因制备技术 聚合酶链式反应聚合酶链式反应（polymerase chain reaction, PCRpolymerase chain reaction, PCR） 是在试管中模拟发生于细胞内的是在试管中模拟发生于细胞内的DNADNA复制过程，故又

5、称为基因的体外扩增法。复制过程，故又称为基因的体外扩增法。是制备目的基因的主要方法之一。是制备目的基因的主要方法之一。13第二节第二节 目的基因制备技术目的基因制备技术一、一、PCRPCR技术的基本原理技术的基本原理 以目的以目的DNADNA分子为模板，以一对分别与模分子为模板，以一对分别与模板互补的板互补的DNADNA片段为引物，在片段为引物，在DNADNA聚合酶作用聚合酶作用下，以下，以dNTPdNTP为底物，按半保留复制的原理，通为底物，按半保留复制的原理，通过变性、复性和延伸三个步骤完成新过变性、复性和延伸三个步骤完成新DNADNA的合成，的合成，并反复这一过程，实现目的并反复这一过程

6、，实现目的DNADNA合成量的指数增合成量的指数增长。长。14第二节第二节 目的基因制备技术目的基因制备技术二、二、PCRPCR反应体系反应体系1 1、模板模板2 2、一对特异性引物、一对特异性引物3 3、热稳定、热稳定DNADNA聚合酶聚合酶4 4、dNTPdNTP5 5、缓冲液、阳离子、缓冲液、阳离子15第二节第二节 目的基因制备技术目的基因制备技术三、三、PCRPCR基本操作基本操作变变 性性复复 性性延延 伸伸16第二节第二节 目的基因制备技术目的基因制备技术 PCRPCR循环：循环： DNADNA模板变性模板变性 引物与模板退火引物与模板退火 引物延伸引物延伸17第六章第六章 常用分

7、子生物学技术常用分子生物学技术第一节第一节 分子杂交技术分子杂交技术第二节第二节 目的基因制备技术（目的基因制备技术（PCRPCR）第三节第三节 基因敲除技术基因敲除技术第四节第四节 RNARNA干扰技术干扰技术补充：反义核酸及药物（第八章补充：反义核酸及药物（第八章P202P202）18第六章第六章 常用分子生物学技术常用分子生物学技术第一节第一节 分子杂交技术分子杂交技术第二节第二节 目的基因制备技术（目的基因制备技术（PCRPCR）第三节第三节 基因敲除技术基因敲除技术第四节第四节 RNARNA干扰技术干扰技术补充：反义核酸及药物（第八章补充：反义核酸及药物（第八章P202P202）19

8、第三节第三节 基因敲除技术基因敲除技术基因敲除技术的概念基因敲除技术的概念产生及发展的意义产生及发展的意义几种常用的基因敲除技术几种常用的基因敲除技术20 基因敲除基因敲除 ( gene knockout) ： 又称为基因打靶，是指从分子又称为基因打靶，是指从分子水平上将某基因去除或使基因失去活水平上将某基因去除或使基因失去活性性, , 用以观察生物或细胞的表型变化，用以观察生物或细胞的表型变化，是研究基因功能的重要手段。是研究基因功能的重要手段。第三节 基因敲除技术 通过一定的途径，使机体特定通过一定的途径，使机体特定的基因失活或缺失的技术。的基因失活或缺失的技术。21产生及发展的意义产生及

9、发展的意义： 研究基因功能的方法主要有两种思路：研究基因功能的方法主要有两种思路： 增强表达增强表达, ,取得表达产物进行研究；取得表达产物进行研究； 减弱或者终止其表达减弱或者终止其表达, ,观察整体功能的变观察整体功能的变化化, ,进而推测相应的基因功能。进而推测相应的基因功能。第三节 基因敲除技术22发展及产生的意义发展及产生的意义： 增强的表达不易真实反映基因产物的表达情况增强的表达不易真实反映基因产物的表达情况, ,较难于分析而逐渐被较难于分析而逐渐被抛弃。抛弃。 基因表达的沉默相对而言更能为基因的功能提供直接证据基因表达的沉默相对而言更能为基因的功能提供直接证据, ,因而其技因而其

10、技术不断得到发展和完善术不断得到发展和完善, ,其中最常用的就是基因敲除技术。其中最常用的就是基因敲除技术。第三节 基因敲除技术23常用的基因敲除技术常用的基因敲除技术同源重组法同源重组法插入突变法插入突变法RNAiRNAi法法第三节 基因敲除技术24常用的基因敲除技术常用的基因敲除技术同源重组法同源重组法插入突变法插入突变法RNAiRNAi法法第三节 基因敲除技术25常用的基因敲除技术常用的基因敲除技术同源重组法：同源重组法： 应用应用DNADNA同源重组原理，同源重组原理，用同源片段替代靶基因片段，用同源片段替代靶基因片段，从而达到基因敲除的目的。从而达到基因敲除的目的。第三节 基因敲除技

11、术26利用同源重组构建基因敲除动物模型的利用同源重组构建基因敲除动物模型的基本步骤基本步骤第三节 基因敲除技术7 71. 1.基因载体的构建基因载体的构建2.2.获得获得ES,ES,同源重组同源重组3.3.筛选重组筛选重组ESES4.4.表型研究表型研究 27常用的基因敲除技术常用的基因敲除技术同源重组法同源重组法插入突变法（基因捕获法）插入突变法（基因捕获法）RNAiRNAi法法第三节 基因敲除技术是构建基因敲除动物模型是构建基因敲除动物模型中最普遍的使用方法。中最普遍的使用方法。28利用随机插入突变进行基因敲除利用随机插入突变进行基因敲除 大规模的随机插入突变,它为在基因组范围内敲除掉任何

12、一个基因提供了可能。 这项技术具有效率高、基因完全失活、容易分离鉴定被插入引起失活的目的基因等优点。 第三节 基因敲除技术29RNARNA干扰引起的基因敲除干扰引起的基因敲除 RNA干扰(RNA interference, RNAi)是一种普遍的转录后基因沉默的机制, 通过特异性地降解细胞内与其同源的mRNA,封闭内源性基因的表达来失活该基因，同样可以实现基因的敲除。第三节 基因敲除技术30基因敲除技术的应用基因敲除技术的应用建立生物模型建立生物模型 在基因功能，代谢途径等研究中模型生物的建立非常重要。基因敲除技术就常常用于建立某种特定基因缺失的生物模型，从而进行相关的研究。第三节 基因敲除技

13、术31基因敲除技术的应用基因敲除技术的应用建立生物模型建立生物模型 第三节 基因敲除技术裸鼠，此动物缺乏胸腺，不能生产裸鼠，此动物缺乏胸腺，不能生产T T细胞，细胞，因此造成免疫缺陷。多用于肿瘤生物学研究因此造成免疫缺陷。多用于肿瘤生物学研究以及异体移植学研究。以及异体移植学研究。 32. .提供廉价的异种移植器官提供廉价的异种移植器官 器官来源稀少往往是人体器官移植的一大制约因素，而大量廉价的异种生物如猪等的器官却不能用于人体。这是因为异源生物的基因会产生一些能引起人体强烈免疫排斥的异源分子，如果能将产生这些异源分子的基因敲除，那么动物的器官将能用于人体的疾病治疗，这将为患者带来具大的福音。

14、第三节 基因敲除技术基因敲除技术的应用基因敲除技术的应用33疾病的分子机理研究和疾病的基因治疗疾病的分子机理研究和疾病的基因治疗 通过基因敲除技术可以确定特定基因的性质通过基因敲除技术可以确定特定基因的性质以及研究它对机体的影响。这无论是对了解疾病以及研究它对机体的影响。这无论是对了解疾病的根源或者是寻找基因治疗的靶目标都有重大的的根源或者是寻找基因治疗的靶目标都有重大的意义。意义。 第三节 基因敲除技术基因敲除技术的应用基因敲除技术的应用34 免疫学中的应用免疫学中的应用 异源的抗体用于人体时会有一定的免疫排斥，异源的抗体用于人体时会有一定的免疫排斥，使得人用抗体类药物的生产和应用受阻。而如

15、果使得人用抗体类药物的生产和应用受阻。而如果将动物免疫分子基因敲除，换以人的相应基因，将动物免疫分子基因敲除，换以人的相应基因，那么将产生人的抗体，从而解决人源抗体的生产那么将产生人的抗体，从而解决人源抗体的生产问题。问题。 第三节 基因敲除技术基因敲除技术的应用基因敲除技术的应用35改造生物、培育新的生物品种改造生物、培育新的生物品种 基因敲除技术则是遗传工程中的重基因敲除技术则是遗传工程中的重大飞跃，它为定向改造生物，培育新型生大飞跃，它为定向改造生物，培育新型生物提供了重要的技术支持。物提供了重要的技术支持。第三节 基因敲除技术基因敲除技术的应用基因敲除技术的应用36第六章第六章 常用分

16、子生物学技术常用分子生物学技术第一节第一节 分子杂交技术分子杂交技术第二节第二节 目的基因制备技术目的基因制备技术第三节第三节 基因敲除技术基因敲除技术第四节第四节 RNARNA干扰技术干扰技术补充：反义核酸及药物（第八章补充：反义核酸及药物（第八章P202P202）3637第四节第四节RNARNA干扰技术干扰技术2002 2002 年，年，RNA RNA 干扰被干扰被Science Science 杂志评为本年杂志评为本年度十大科学成就之首。度十大科学成就之首。3738 小分子双链小分子双链RNARNA干扰技术作为一项干扰技术作为一项高效、高特异性地关闭特定基因表达高效、高特异性地关闭特定基

17、因表达的的新技术新技术, , 将为基因功能的研究提供一种快将为基因功能的研究提供一种快速、简便的全新方法速、简便的全新方法, ,同时也为同时也为功能基因功能基因组研究组研究与人类疾病的与人类疾病的基因治疗基因治疗带来革命带来革命性的变革。性的变革。第四节第四节RNARNA干扰技术干扰技术383920062006年的诺贝尔生理学奖获得者年的诺贝尔生理学奖获得者3940第四节第四节RNARNA干扰技术干扰技术一、一、RNAiRNAi的定义及其发现的定义及其发现二、二、RNAiRNAi的作用及其机制的作用及其机制三、三、RNAiRNAi的应用的应用4041第四节第四节RNARNA干扰技术干扰技术一、

18、一、RNAiRNAi的定义及其发现的定义及其发现1.RNA1.RNA干扰（干扰（RNA interference, RNAiRNA interference, RNAi）： 是指在进化过程中高度保守的是指在进化过程中高度保守的，由由双双链链RNARNA（dsRNAdsRNA）诱发）诱发的的，同源同源mRNAmRNA高高效特异性效特异性降解降解的现象。的现象。4142 第四节第四节RNAiRNAi研究史研究史19901990年，转年，转基因矮牵牛基因矮牵牛花花 “ “基因沉基因沉默默”。1998 1998 年年, , 秀丽隐秀丽隐杆线虫的杆线虫的“基因基因沉默沉默”研究研究。RNARNA干扰理论

19、提干扰理论提出出4243 转基因转基因 矮牵牛花矮牵牛花 的的“基因沉默基因沉默”现象现象 第四节第四节RNAiRNAi研究史研究史4344 第四节第四节RNAiRNAi研究史研究史19901990年，转年，转基因矮牵牛基因矮牵牛花花 “ “基因沉基因沉默默”。1998 1998 年年, , 秀丽隐秀丽隐杆线虫的杆线虫的“基因基因沉默沉默”研究研究。RNARNA干扰理论提干扰理论提出出4445秀丽隐杆线虫秀丽隐杆线虫 第四节第四节RNAiRNAi研究史研究史4546 第四节第四节RNAiRNAi研究史研究史19901990年，转年，转基因矮牵牛基因矮牵牛花花 “ “基因沉基因沉默默”。1998

20、 1998 年年, , 秀丽隐秀丽隐杆线虫的杆线虫的“基因基因沉默沉默”研究研究。RNARNA干扰理论提干扰理论提出出4647第四节第四节RNAiRNAi一、一、RNAiRNAi的定义及其发现的定义及其发现二、二、RNAiRNAi的作用及其机制的作用及其机制三、三、RNAiRNAi的应用的应用4748第四节第四节RNAiRNAi-作用机制作用机制dsRNA：双链RNADicer：一种核酶siRNA：小干扰RNARISC：RNA诱导沉默 复合体cleavage：断裂RNAiRNAi作用机制模式图作用机制模式图4849第四节第四节RNAiRNAidsRNA被Dicer酶切割成siRNA siRNA

21、双链结合一个核酶复合物形成RISC （RNA诱导沉默复合体）siRNA解链,活化RISC活化的RISC通过碱基配对定位到同源mRNAmRNA降解49外源基因整合入宿主细胞产生外源基因整合入宿主细胞产生dsRNAdsRNA50第四节第四节RNAiRNAiRNAi的作用的作用 是是细胞为保护自身基因免遭诸如细胞为保护自身基因免遭诸如病毒入侵等损害病毒入侵等损害，而采取的一种使入而采取的一种使入侵的外源基因失活、却不影响细胞内侵的外源基因失活、却不影响细胞内基因正常表达的基因正常表达的保护性调控机制保护性调控机制。5051第四节第四节RNAiRNAi一、一、RNAiRNAi的定义及其发现的定义及其发

22、现二、二、RNAiRNAi的作用及其机制的作用及其机制三、三、RNAiRNAi的应用的应用5152第四节第四节RNAiRNAi1 1、RNAiRNAi在探索基因功能中的应用在探索基因功能中的应用 RNAiRNAi高效高效、简单，是简单，是基因基因功能研究的重要工具。功能研究的重要工具。2 2、RNAiRNAi在新药物的研究和开发中的应用在新药物的研究和开发中的应用 药物靶点确认的一个重要工具。药物靶点确认的一个重要工具。3 3、RNAiRNAi在肿瘤治疗中的应用在肿瘤治疗中的应用 一种一种dsRNAdsRNA 即可产生多个基因同时沉默的效应即可产生多个基因同时沉默的效应。5253第四节第四节R

23、NAiRNAisiRNA作为一种新型药物还存在的问题：作为一种新型药物还存在的问题：1、siRNA的稳定性不佳，需进行适当的稳定性不佳，需进行适当的改进；的改进；2、药物转运的载体问题尚未解决；、药物转运的载体问题尚未解决；3、作用特异性不高。、作用特异性不高。5354第六章第六章 常用分子生物学技术常用分子生物学技术第一节第一节 分子杂交技术分子杂交技术第二节第二节 目的基因制备技术目的基因制备技术第三节第三节 基因敲除技术（自学）基因敲除技术（自学）第四节第四节 RNARNA干扰技术干扰技术补充：反义核酸及药物（第八章补充：反义核酸及药物（第八章P202P202）5455反义核酸及药物反义

24、核酸及药物一、概述一、概述二、反义核酸及药物二、反义核酸及药物三、反义核酸的应用三、反义核酸的应用5556遗传信息传递规律的中心法则遗传信息传递规律的中心法则反义核酸及药物反义核酸及药物 概述概述5657正义链与反义链正义链与反义链反义核酸及药物反义核酸及药物 概述概述正义链正义链反反义链反义链57581、反义核酸的定义、反义核酸的定义 根据碱基互补原理，用人工合成或生命有根据碱基互补原理，用人工合成或生命有机结合成的特定互补的机结合成的特定互补的DNA或或RNA片段，与目片段，与目的序列结合，通过空间位阻效应或诱导的序列结合，通过空间位阻效应或诱导RNA酶酶降解作用，在复制、转录、剪接、降解

25、作用，在复制、转录、剪接、mRNA转运转运及翻译水平上抑制或封闭目的基因的表达。及翻译水平上抑制或封闭目的基因的表达。反义核酸及药物反义核酸及药物 概述概述58591、反义核酸的定义、反义核酸的定义 根据根据碱基互补原理碱基互补原理，用人工合成或生命有，用人工合成或生命有机结合成的特定机结合成的特定互补的互补的DNA或或RNA片段片段，与目，与目的序列结合，通过的序列结合，通过空间位阻效应或诱导空间位阻效应或诱导RNA酶酶降解作用降解作用，在复制、转录、剪接、，在复制、转录、剪接、mRNA转运转运及翻译水平上及翻译水平上抑制或封闭目的基因抑制或封闭目的基因的表达。的表达。反义核酸及药物反义核酸

26、及药物 概述概述5960反义核酸及药物反义核酸及药物 概述概述反反 义义 核核 酸酸与模板链与模板链（功能链功能链）互补，但不参与转互补，但不参与转录翻译的核酸分子录翻译的核酸分子模板链模板链：DNADNA或者或者mRNAmRNA反义反义核酸核酸：DNADNA或者或者RNARNA目标目标：抑制或封闭目的基因的表达抑制或封闭目的基因的表达6061反义核酸及药物反义核酸及药物 概述概述2 2、可作用的靶核酸区域：、可作用的靶核酸区域：6162反义核酸及药物反义核酸及药物 概述概述mRNA5mRNA5端非翻译区：端非翻译区：SDSD序列或序列或RBSRBSmRNA5mRNA5 端编码区：起始密码端编

27、码区：起始密码AUGAUGmRNA5 mRNA5 端帽子形成位点端帽子形成位点mRNAmRNA PolyAPolyA形成位点形成位点前体前体mRNAmRNA外显子与内含子的结合部位外显子与内含子的结合部位阻断阻断mRNA mRNA 的成熟及其向胞浆中转运的成熟及其向胞浆中转运2 2、可作用的靶核酸区域：、可作用的靶核酸区域：反义核酸及药物反义核酸及药物 概述概述翻译水平翻译水平 蛋白质的合成蛋白质的合成63643. 3. 反义核酸的分类反义核酸的分类反义核酸及药物反义核酸及药物 概述概述反义反义DNADNA 针对某个基因互补的DNA片段。 其作用为抑制或封闭靶基因的表达。反义反义RNARNA

28、与mRNA互补的RNA片段。 形成双链复合物，阻止mRNA的翻译加速mRNA降解。核核 酶酶 具有酶活性的RNA 在特定部位上剪切mRNA使其丧失功能。6465反义核酸及药物反义核酸及药物一、概述一、概述二、反义技术及药物二、反义技术及药物三、反义核酸的应用三、反义核酸的应用6566反义核酸及药物反义核酸及药物 反义技术反义技术根据碱基互补原理，用人工合成或生根据碱基互补原理，用人工合成或生物体合成特定互补的物体合成特定互补的DNA或或RNA片段，片段，抑制或封闭基因表达的技术。抑制或封闭基因表达的技术。定定 义义6667 反义药物反义药物定定 义义利用反义技术，设计出与致病有关的利用反义技术

29、，设计出与致病有关的基因及其基因及其mRNAmRNA互补的反义互补的反义“封条封条”（DNADNA或或RNARNA片段），通过特异封片段），通过特异封闭这些基因不让它们表达或复制，从闭这些基因不让它们表达或复制，从而达到治疗疾病的目的。而达到治疗疾病的目的。反义核酸及药物反义核酸及药物 6768反义核酸及药物反义核酸及药物 反义寡核苷酸反义寡核苷酸 细胞核细胞核 目标基因目标基因 转录转录 细胞质细胞质 核糖体核糖体 翻译抑制翻译抑制 mRNA mRNA 断裂断裂 6869 反义药物反义药物分分 类类反义核酸及药物反义核酸及药物 69第一代：反义第一代：反义DNADNA第二代：反义第二代：反义

30、RNARNA第三代：肽核酸第三代：肽核酸70反义反义DNA定义：人工合成的与定义：人工合成的与待封闭基因待封闭基因的某一区的某一区段上互补的正常或化学修饰的段上互补的正常或化学修饰的DNA片段片段，用来抑制、封闭这一基因的表达。用来抑制、封闭这一基因的表达。7071反义反义DNA化学修饰的目的：化学修饰的目的：更好地解决进入细胞的问题更好地解决进入细胞的问题稳定、特异地和靶稳定、特异地和靶mRNA结合结合激活核酸酶降解激活核酸酶降解mRNA7172反义反义RNA定义定义：与目的：与目的RNARNA序列互补的序列互补的RNARNA片段片段，通过配，通过配对碱基间氢键作用，与对应的对碱基间氢键作用

31、，与对应的RNARNA形成双链复合形成双链复合物而影响靶物而影响靶RNARNA的的正常修饰、翻译正常修饰、翻译等过程，从而等过程，从而抑制或封闭靶抑制或封闭靶RNARNA的功能的功能。来源来源：重组：重组DNADNA技术、人工合成、人工修饰技术、人工合成、人工修饰72731定定 义义在在特定肽链特定肽链上连接不同的碱基，即以上连接不同的碱基，即以类氨基多类氨基多肽链肽链代替核酸中的核糖磷酸骨架，并按一定的代替核酸中的核糖磷酸骨架，并按一定的序列结合上标准的序列结合上标准的A、T、C、G碱基所形成的碱基所形成的肽核酸，它能与互补肽核酸，它能与互补DNA或或RNA特异结合，从特异结合，从而封闭靶基

32、因的表达。而封闭靶基因的表达。肽核酸肽核酸第三代反义寡核苷酸第三代反义寡核苷酸73742特特 点点|与靶基因结合能力强与靶基因结合能力强|稳定性好，易吸收稳定性好，易吸收|在体内有内切酶活性和抑制端粒作用在体内有内切酶活性和抑制端粒作用肽核酸肽核酸第三代反义寡核苷酸第三代反义寡核苷酸7475第四节第四节 反义核酸及药物反义核酸及药物一、概述一、概述二、反义核酸及药物二、反义核酸及药物三、反义核酸的应用三、反义核酸的应用7576抗肿瘤抗肿瘤治疗治疗对于反义药物而言，对于反义药物而言，它能特异阻断肿瘤它能特异阻断肿瘤细胞内癌基因、原细胞内癌基因、原癌基因的表达，且癌基因的表达，且不影响其他基因的不

33、影响其他基因的正常表达正常表达 。反义核酸为肿瘤治疗开辟了一条新的道路。反义核酸为肿瘤治疗开辟了一条新的道路。反义核酸及药物反义核酸及药物 - - 应用应用 7677Add your text in here抗肿瘤治疗的方案抗肿瘤治疗的方案 抑制癌基因抑制癌基因的表达的表达 用反义核酸技术在癌基因表达时与其用反义核酸技术在癌基因表达时与其mRNA特异性结合，阻断癌基因的表达，特异性结合，阻断癌基因的表达，也可应用核酶降解癌基因也可应用核酶降解癌基因mRNA。7778反义核酸及药物反义核酸及药物 - - 应用应用 c- c-mycmyc过度表达过度表达激活端粒酶激活端粒酶细胞永生化细胞永生化正常

34、细胞结正常细胞结构基因构基因调控细胞增调控细胞增殖分化殖分化mycmyc原癌基因家族原癌基因家族- c-myc- c-myc7879反义核酸及药物反义核酸及药物 - - 应用应用 福米韦生福米韦生（VitraveneVitravene， ISIS2922ISIS2922）：）： 唯一被美国食品药品管理局（唯一被美国食品药品管理局（FDAFDA） 批准上市的反义核酸药物。批准上市的反义核酸药物。7980反义核酸及药物反义核酸及药物 - - 应用应用 科学研究成果科学研究成果临临 床床 应应 用用8081O高度特异的抑制高度特异的抑制某一某一mRNA的翻的翻译，从而抑制相译，从而抑制相应基因的功能

35、。应基因的功能。O不影响邻近基因不影响邻近基因的正常表达。的正常表达。反义药物反义药物应用的应用的“瓶颈瓶颈” 细胞内大量核酸细胞内大量核酸酶对反义核酸的降解酶对反义核酸的降解; ; 反义药物高浓度反义药物高浓度的使用带来的毒副作的使用带来的毒副作用的增加和治疗费用用的增加和治疗费用的增加。的增加。|反义药物的优点及应用的反义药物的优点及应用的“瓶颈瓶颈”优优 点点8182第六章第六章常用分子生物学技术常用分子生物学技术（小（小 结）结）8283第六章第六章 常用分子生物学技术常用分子生物学技术第一节第一节 分子杂交技术分子杂交技术第二节第二节 目的基因制备技术目的基因制备技术第三节第三节 基

36、因敲除技术基因敲除技术第四节第四节 RNARNA干扰技术干扰技术补充：反义核酸及药物（第八章补充：反义核酸及药物（第八章P202P202）8384核酸的分子杂交：核酸的分子杂交： 碱基序列互补碱基序列互补的单链核酸，根据的单链核酸，根据碱基互补原则，借助氢键相连而形成碱基互补原则，借助氢键相连而形成双链双链杂交分子杂交分子的过程。的过程。第一节第一节 分子杂交技术分子杂交技术基本原理基本原理84851.Southern1.Southern印迹杂交法：印迹杂交法： 检测特异检测特异DNADNA片段片段2.Nouthern2.Nouthern印迹杂交法：印迹杂交法： 检测特异的检测特异的RNARN

37、A片段片段3.Western3.Western印迹杂交法：印迹杂交法： 检测检测蛋白质蛋白质第一节第一节 分子杂交技术分子杂交技术 应用应用8586第一节第一节 分子杂交技术分子杂交技术 应用应用基因芯片在药物研究方面的贡献基因芯片在药物研究方面的贡献p用于药物作用新靶标的发现。用于药物作用新靶标的发现。p进行药物作用机制的研究。进行药物作用机制的研究。p用于药物基因组学研究，实施个体化治疗。用于药物基因组学研究，实施个体化治疗。p进行毒理学研究进行毒理学研究, , 用于药品安全性评价。用于药品安全性评价。 8687第二节第二节 目的基因制备技术目的基因制备技术 聚合酶链式反应（聚合酶链式反应

38、（polymerase chain polymerase chain reaction, PCRreaction, PCR）是在试管中模拟发生）是在试管中模拟发生于细胞内的于细胞内的DNADNA复制过程，故又称为复制过程，故又称为基因的体外扩增法。是制备目的基因基因的体外扩增法。是制备目的基因的主要方法之一。的主要方法之一。8788 PCRPCR循环：循环： DNADNA模板模板变性变性 引物与模板引物与模板退火退火 引物引物延伸延伸第二节 目的基因制备技术8889 基因敲除基因敲除 ( gene knockout) ： 又称为基因打靶，是指从分子又称为基因打靶，是指从分子水平上将某基因去除或

39、使基因失去活水平上将某基因去除或使基因失去活性性, ,敲除的基因用以观察生物或细胞的敲除的基因用以观察生物或细胞的表型变化，是研究基因功能的重要手表型变化，是研究基因功能的重要手段。段。第三节 基因敲除技术8990常用的基因敲除技术常用的基因敲除技术同源重组法同源重组法插入突变法插入突变法RNAiRNAi法法第三节 基因敲除技术是构建基因敲除动物模型是构建基因敲除动物模型中最普遍的使用方法。中最普遍的使用方法。9091第四节第四节RNARNA干扰技术干扰技术RNARNA干扰（干扰（RNA interference, RNAiRNA interference, RNAi）： 是指在进化过程中高度

40、保守的是指在进化过程中高度保守的，由由双链双链RNARNA（dsRNAdsRNA）诱发）诱发的的，同源同源mRNAmRNA高效特异性高效特异性降解降解的现象。的现象。9192第四节第四节RNAiRNAiRNAi的作用的作用 是是细胞为保护自身基因免遭诸如细胞为保护自身基因免遭诸如病毒入侵等损害病毒入侵等损害，而采取的一种使入而采取的一种使入侵的外源基因失活、却不影响细胞内侵的外源基因失活、却不影响细胞内基因正常表达的基因正常表达的保护性调控机制保护性调控机制。9293第四节第四节RNAiRNAi1 1、RNAiRNAi在探索基因功能中的应用在探索基因功能中的应用 RNAiRNAi高效高效、简单

41、，是简单，是基因基因功能研究的重要工具。功能研究的重要工具。2 2、RNAiRNAi在新药物的研究和开发中的应用在新药物的研究和开发中的应用 药物靶点确认的一个重要工具。药物靶点确认的一个重要工具。3 3、RNAiRNAi在肿瘤治疗中的应用在肿瘤治疗中的应用 一种一种dsRNAdsRNA 即可产生多个基因同时沉默的效应即可产生多个基因同时沉默的效应。9394反义核酸的定义反义核酸的定义 根据根据碱基互补原理碱基互补原理，用人工合成或生命有，用人工合成或生命有机结合成的特定机结合成的特定互补的互补的DNA或或RNA片段片段，与目，与目的序列结合，通过的序列结合，通过空间位阻效应或诱导空间位阻效应或诱导RNA酶酶降解作用降解作用，在复制、转录、剪接、，在复制、转录、剪接、mRNA转运转运及翻译水平上及翻译水平上抑制或封闭目的基因抑制或封闭目的基因的表达。的表达。反义核酸及药物反义核酸及药物 概述概述9495O高度特异的抑制高度特异的抑制某一某一mRNA的翻的翻译，从而抑制相译，