第20章重组DNA技术

1、第第 二十二十 章章重组重组DNA技术技术recombinant DNA technique 第第 一一 节节 重组重组DNA技术的基本过程技术的基本过程重组重组DNA技术：又称技术：又称DNA克隆或基因克隆克隆或基因克隆 应用酶学的方法应用酶学的方法，在体外将不同来源的在体外将不同来源的特异基因或特异基因或DNA片段插入病毒、质粒或其片段插入病毒、质粒或其它载体分子，构建重组它载体分子，构建重组DNA分子，然后将分子，然后将重组重组DNA导入到合适的受体细胞中，使其导入到合适的受体细胞中，使其在细胞中扩增和繁殖（称之为在细胞中扩增和繁殖（称之为“克隆克隆”），），筛选出含有目的基因的转化子细

2、胞，再进筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增、提取获得大量同一行扩增、提取获得大量同一DNA分子。分子。l克隆克隆(clone)：来自同一始祖的相同副本或拷来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。贝的集合。l克隆化克隆化(cloning)：获取这类同一的获取这类同一的DNA分子分子群体、细胞群体或个体群体的过程，即无性群体、细胞群体或个体群体的过程，即无性繁殖。繁殖。l重组重组DNA(recombinant DNA,或嵌合或嵌合DNA, chimera DNA)：采用克隆技术，把来自不采用克隆技术，把来自不同生物的外源同生物的外源DNA插入载体分子所形成的杂插入载体分子所形成的杂合合DNA分

3、子。分子。重组重组DNA技术的基本过程技术的基本过程 第二节第二节 重组重组DNA技术中常用工具酶技术中常用工具酶 一、一、 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶二、二、 DNA连接酶连接酶三、三、 DNA聚合酶聚合酶四、四、 其它修饰酶其它修饰酶 1. 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶(restriction endonuclease) 基因工程的基因工程的手术刀手术刀功能：功能： 识别识别双链双链DNA中特异序列，该序列的特中特异序列，该序列的特征为征为4-6个核苷酸的个核苷酸的回文结构回文结构，并在识别序，并在识别序列内或附近列内或附近特异切割特异切割DNA，产生，产生黏性末端黏性末端或或平

4、末端平末端。 根据需要在特定的位点精确切割双链根据需要在特定的位点精确切割双链DNA分子。分子。作用：作用：与甲基化酶共同构成细菌的限与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统，限制外源制修饰系统，限制外源DNA， 保保护自身护自身DNA。分类：分类：、（基因工程技术中常用（基因工程技术中常用型）型）第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株；第四个字母代表株；用罗马数字表示发现的先后次序。用罗马数字表示发现的先后次序。命名：命名：Hin d 属属 系系 株株 序

5、序Haemophilus influenzae d株株流感嗜血杆菌流感嗜血杆菌d株的第三种酶株的第三种酶类酶识别序列特点类酶识别序列特点 回文结构回文结构 (palindrome) 切口：切口：平端切口、粘端切口平端切口、粘端切口 作用模式图：作用模式图：（1）产生）产生5 突出突出黏性末端黏性末端 (sticky end)EcoR I*GAATTC*CTTAAG*5353*G*C T T A A 5335OHP A A T T C* G*5335P OH 作用模式图：作用模式图：（2）产生）产生3 突出突出黏性末端黏性末端Pst I*CTGCAG*GACGTC*53535335OHP*C T

6、 G C A*G5335OHPA C G T C*G* 作用模式图：作用模式图：（3）产生）产生平末端平末端 (blunt end)Alu I*AGCT*TCGA*53535335OHP*AG*TC5335 OHPCT*GA*同裂酶同裂酶来源不同但能识别相同序列的酶，又称来源不同但能识别相同序列的酶，又称同功异源酶同功异源酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC GBam HGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC GBst同尾酶同尾酶有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割同，但切割DNA后，产生相同的黏性末端，称后，产生相同的黏性末

7、端，称为为同尾酶同尾酶。这两个相同的黏性末端称为。这两个相同的黏性末端称为配伍未配伍未端端(compatible end)。 GGATCC CCTAGG AGATCT TCTAGAGCCTAG GATCC GATCTAG GATCT A 可变酶可变酶 识别识别DNA序列中的一个或几个碱基序列中的一个或几个碱基是可变的，并且识别序列往往超过是可变的，并且识别序列往往超过6个个核苷酸。此类酶是核苷酸。此类酶是型限制酶的特例。型限制酶的特例。 如：如：Bstp G GTNACC; Bbl GCC(N)4NGGC2. DNA连接酶连接酶 (DNA ligase) 基因工程的基因工程的缝纫针缝纫针 将两

8、条双链将两条双链DNA片段连接起来，实片段连接起来，实现现DNA的的体外重组体外重组。功能：功能： 催化两条催化两条双链双链DNA分子的分子的互补黏性互补黏性末端末端或或平末端平末端的的5 磷酸磷酸基团与基团与3 羟基羟基形形成成磷酸酯键磷酸酯键。 也可将双链也可将双链DNA分子内部分子内部的单个切的单个切口口(无核苷酸空缺无核苷酸空缺)连接起来。还可作用连接起来。还可作用于于RNA，但效率很低。，但效率很低。 DNA连接酶催化连接酶催化平末端平末端连接要比连接要比黏性黏性末端末端效率低得多。效率低得多。 DNA连接酶有连接酶有T4 DNA连接酶连接酶和大肠和大肠杆菌杆菌DNA连接酶连接酶 D

9、NA连接酶 EcoR I*GAATTC*CTTAAG*5353*G*C T T A A 5335OHPA A T T C* G*5335 P OHDNA连接酶连接酶作用模式图：作用模式图：（1）连接黏性末端黏性末端 作用模式图：作用模式图： （2）连接平末端平末端Alu I*AGCT*TCGA*5353OHP5335 *TC *AG5335 OHPCT*GA*DNA连接酶连接酶 能够把脱氧核糖核苷酸能够把脱氧核糖核苷酸连续地连续地添加到添加到双链双链DNA分子引物链的分子引物链的3 -OH末端末端，催，催化核苷酸的聚合作用化核苷酸的聚合作用 类型：类型： 大肠杆菌大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶 K

10、lenow片段片段 Taq DNA聚合酶聚合酶 反转录酶反转录酶 三、三、DNA聚合酶聚合酶 四、其它修饰酶四、其它修饰酶 n末端脱氧核苷酸转移酶（末端脱氧核苷酸转移酶（terminal deoxynucleotidyl transferase） n多核苷酸激酶（多核苷酸激酶（polynuleotide kinase） n碱性磷酸酶（碱性磷酸酶（alkaline phosphatase） 功能：功能： 催化脱氧核糖核苷酸转移到催化脱氧核糖核苷酸转移到单链单链或或双链双链DNA分子的分子的3-OH末端上。末端上。(1) 底物是底物是单链单链DNA或有或有3突出末端突出末端的的 双链双链 DNA。

11、OH53Mg2+dNTP53(A、G、C、T)nnppi53OHMg2+dNTPnppi53(A、G、C、T)n末端转移酶末端转移酶 (2) 底物是底物是平端平端或或3 凹端凹端的双链的双链DNA。53Co2+dNTP53(A、G、C、T)nnppi53Co2+dNTPnppi53OHOH(A、G、C、T)n 用途：用途： （1）主要作用是在载体或目的基因）主要作用是在载体或目的基因 3 末端加上同源末端加上同源多聚尾巴多聚尾巴，形成，形成人工人工 黏性末端黏性末端，便于，便于DNA重组。重组。（2）DNA 3末端的末端的同位素标记同位素标记。重组重组DNA技术中常用的工具酶技术中常用的工具酶

12、工工 具具 酶酶功功 能能限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶识别特异序列，切割识别特异序列，切割DNADNA连接酶连接酶催化催化DNA中相邻的中相邻的5 磷酸基和磷酸基和3 羟基末端之间形成磷酸二酯羟基末端之间形成磷酸二酯键，使键，使DNA切口封合或使两个切口封合或使两个DNA分子或片段连接分子或片段连接DNA聚合酶聚合酶合成双链合成双链cDNA分子或片段连接分子或片段连接缺口平移制作高比活探针缺口平移制作高比活探针DNA序列分析序列分析填补填补3 末端末端Klenow片段片段又名又名DNA聚合酶聚合酶I大片段，具有完整大片段，具有完整DNA聚合酶聚合酶I的的53 聚合、聚合、35 外切活性，而

13、无外切活性，而无53 外切活性。常用于外切活性。常用于cDNA第二链合第二链合成，双链成，双链DNA 3 末端标记等末端标记等反转录酶反转录酶合成合成cDNA替代替代DNA聚合酶聚合酶I进行填补，标记或进行填补，标记或DNA序列分析序列分析多聚核苷酸激酶多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸催化多聚核苷酸5 羟基末端磷酸化，或标记探针羟基末端磷酸化，或标记探针末端转移酶末端转移酶在在3 羟基末端进行同质多聚物加尾羟基末端进行同质多聚物加尾碱性磷酸酶碱性磷酸酶切除末端磷酸基切除末端磷酸基 目的基因进入原核或真核细胞并高效复目的基因进入原核或真核细胞并高效复制和表达蛋白质，需要装入制和表达蛋白质，需要装入载

14、体载体才能实现。才能实现。载体（载体（vector） 指能携带外源指能携带外源DNA分子进入受体细胞分子进入受体细胞进行扩增和表达的运载工具进行扩增和表达的运载工具第三节第三节 重组重组DNA技术中常用载体技术中常用载体 作为基因工程载体所需具备的基本条件作为基因工程载体所需具备的基本条件n能自主复制；能自主复制；n具有具有两个以上两个以上的遗传标记物，便于重组体的遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定；的筛选和鉴定；n有克隆位点有克隆位点(外源外源DNA插入点插入点)，常具有多，常具有多个个单一酶切位点单一酶切位点，称为多克隆位点；，称为多克隆位点；n分子量小，以容纳较大的外源分子量小，以容纳较

15、大的外源DNA；n拷贝数高拷贝数高n具有较高的遗传稳定性具有较高的遗传稳定性克隆载体克隆载体 (cloning vector) 为使插入的外源为使插入的外源DNA序列被扩增而特意序列被扩增而特意设计的载体。设计的载体。表达载体表达载体 (expression vector) 为使插入的外源为使插入的外源DNA序列可转录翻译成序列可转录翻译成多肽链而特意设计的载体。多肽链而特意设计的载体。 n质粒载体质粒载体：最常用的对目的基因最常用的对目的基因克隆克隆 n 噬菌体噬菌体：主要用于主要用于构建构建基因组基因组DNA或或 cDNA文库文库nM13噬菌体噬菌体：专用于专用于Sanger双脱氧双脱氧D

16、NA测序测序 n 粘粒：粘粒：用于用于克隆大片段克隆大片段DNAn 酵母质粒：酵母质粒：用于在用于在酵母酵母中表达目的蛋白中表达目的蛋白n病毒：病毒：包括人或哺乳动物病毒、昆虫及植物包括人或哺乳动物病毒、昆虫及植物 毒，用于在毒，用于在真核细胞真核细胞中表达目的蛋白中表达目的蛋白 基因工程载体的种类和用途基因工程载体的种类和用途1. 质粒质粒 (plasmid)载体载体 细菌培养细菌培养质粒扩增并表达蛋白质质粒扩增并表达蛋白质大肠杆菌大肠杆菌染色质染色质质粒质粒 细菌染色质以外的双链环状细菌染色质以外的双链环状DNA，能自我复制和表达其携带的遗传信息。能自我复制和表达其携带的遗传信息。 Amp

17、rORITetrpBR322质粒质粒：一种克隆质粒ORI：复制起始点，保证高拷贝自我复制。结构与功能：结构与功能：Ampr, Tetr：两个抗性基因用于筛选阳性克隆。Pst I, BamH I：两个单酶切位点用于插入目的基因分子量较小拷贝数较高pUC18/pUC19pUC192686 bpAmprLac ZP(BLA)PlacOriAva I (413)BamHI (418)EcoRI (397)HindIII (448)Pst I (440)Sma I (415)Xma I (413)Apa LI (178)Apa LI (1121)Apa LI (2367)MCSMCS：Multiple

18、Clonning Site提供多个单酶切位点用于克隆操作提供多个单酶切位点用于克隆操作LacZ: 蓝白斑筛选阳性克隆蓝白斑筛选阳性克隆2. 噬菌体噬菌体 (phage)载体载体 噬菌体噬菌体 (phage) M13噬菌体噬菌体 粘粒粘粒 (cosmid)3. 人工染色体载体人工染色体载体 nYAC可接受可接受100kb2 000kb的外源的外源DNA片段插入，是人类基因组计划中物理图片段插入，是人类基因组计划中物理图谱绘制采用的主要载体谱绘制采用的主要载体n包含的调控元件包含的调控元件 ：着丝粒、端粒、复制着丝粒、端粒、复制起始点、限制性酶切位点、选择标记、起始点、限制性酶切位点、选择标记、原

19、核序列及调控元件原核序列及调控元件 4. 病毒载体病毒载体 目前常用的病毒载体有目前常用的病毒载体有整合型整合型和和游离游离型型两类两类 n反转录病毒载体反转录病毒载体 （整合型）（整合型）n腺病毒载体腺病毒载体 （游离型）（游离型）第四节第四节 目的基因的获得和体外重目的基因的获得和体外重组组 一、目的基因的获得一、目的基因的获得 -分二、目的基因的体外重组二、目的基因的体外重组 -切、接目的基因目的基因 (target DNA)n cDNA (complementary DNA)n基因组基因组DNA (genomic DNA)目的目的:n 分离获得某一感兴趣的基因或分离获得某一感兴趣的基因

20、或DNA序列序列 n 获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）种类：种类：（一）（一） 化学合成法化学合成法要求：要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产已知目的基因的核苷酸序列或其产 物的氨基酸序列物的氨基酸序列（二）聚合酶链反应（二）聚合酶链反应 (polymerase chain reaction, PCR)（三）从基因文库中筛选（三）从基因文库中筛选（一）目的基因的获取（一）目的基因的获取分分* 化学合成法获取目的基因化学合成法获取目的基因由已知氨基酸序列推测可能的由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列序列组织或细胞染色体组织或细胞染色体DNA基因片段基因片段克隆

21、载体克隆载体重组重组DNA分子分子含重组分子的转化菌含重组分子的转化菌限制性内切酶限制性内切酶受体菌受体菌基因组基因组DNA文库文库存在于转化细胞存在于转化细胞内由克隆载体所携带内由克隆载体所携带的所有基因组的所有基因组DNA的的集合集合* 从基因组从基因组DNA文文库获取目的基因库获取目的基因限制酶切位点限制酶切位点限制酶消化限制酶消化 除去中间片段除去中间片段cos LR coscos L左臂左臂R cos右臂右臂真核生物染真核生物染色体色体DNA限制酶部分消化限制酶部分消化 外源外源DNA与载体与载体DNA混合混合 连接反应连接反应 体外包装体外包装 用重组噬菌体用重组噬菌体感染大肠杆菌

22、感染大肠杆菌 20 Kb DNA 片段片段 cos LR cos20 Kb 外源外源 DNA 片段片段 基因文库基因文库mRNA cDNA 双链双链cDNA 重组重组DNA分子分子 cDNA文库文库 反转录酶反转录酶 载体载体 受体菌受体菌 复制复制* 从从cDNA文库获取目的基因文库获取目的基因 反转录酶反转录酶A A A A T T T T AAAASI核酸酶核酸酶 DNA聚合酶聚合酶碱水解碱水解 T T T T 基因组文库：基因组文库：G-文库文库cDNA文库：文库：c-文库文库 (常用常用)方法：方法：基因文库基因文库 用目的基因上的一段用目的基因上的一段DNA做成做成探针探针与文库中

23、的与文库中的DNA作作核酸杂交核酸杂交，从基因，从基因文库中文库中“钓出钓出”有目的基有目的基因的克隆。因的克隆。（三）外源基因与载体的连接（三）外源基因与载体的连接接接1. 黏性末端连接黏性末端连接方式：方式：(1) 同一限制酶切位点连接同一限制酶切位点连接 (2) 不同限制酶切位点连接不同限制酶切位点连接 配伍末端配伍末端连接连接 非配伍末端连接非配伍末端连接（二）克隆载体的选择和构建（二）克隆载体的选择和构建Bam H切割反应切割反应 GGATCC CCTAGGT4 DNA连接酶连接酶15CGATCC GGCCTAG目的基因用目的基因用 Bam H切割切割GCCTAGGCCTAGGCCT

24、AGGCCTAGGATCCGGATCCGGATCCGGATCCG载体载体DNA用用Bam H切割切割GCCTAGGCCTAGGCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCGGATCCGGATCCG重组体重组体GCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCGGCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCG载体自连载体自连目的基因自连目的基因自连同一限制酶切位点连接同一限制酶切位点连接不同限制酶切位点（非配伍末端）的连接不同限制酶切位点（非配伍末端）的连接GAATTCCTTAAGAGATCTTCTAGAEco R切割位点切割位点GCTTAAATCTAGAATTCGGATCTABg l切割位点切割位

25、点AATTCGATCTAGAATTCGGATCTAAATTCGATCTAGEcoR+ Bg l双酶切双酶切Eco R+ Bg l双酶切双酶切GCTTAAATCTAGAATTCGGATCTAT4 DNA连接酶连接酶15C重组体重组体配伍末端的配伍末端的连接情况和同一连接情况和同一限制酶切位点连限制酶切位点连接相似。接相似。2. 平末端连接平末端连接适用于：适用于：限制性内切酶切割产生的粘限制性内切酶切割产生的粘端补齐或切平形成的平端端补齐或切平形成的平端目的基因目的基因载体载体限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶T4 DNA连接酶连接酶15C重组体重组体载体自连载体自连目的基因目的基

26、因 自连自连3. 人工接头人工接头(linker)连接连接 由平端加上新的酶切位点，再用由平端加上新的酶切位点，再用限制酶切除产生黏性末端，而进行粘限制酶切除产生黏性末端，而进行粘端连接。端连接。 人工接头及其应用人工接头及其应用CCGAATTCG GGCTTAAGC5-3-Eco REco REco REco R目目 录录4. 同聚物加尾连接同聚物加尾连接在末端转移酶在末端转移酶(terminal transferase)的作用下，在的作用下，在DNA片段末端加上同聚物片段末端加上同聚物序列、制造出黏性末端，再进行粘端连序列、制造出黏性末端，再进行粘端连接。接。5 3 3 5 载体载体DNA

27、5 3 3 5 目的基因目的基因限制酶或机械剪切限制酶或机械剪切限制酶限制酶 5 3 3 5 5 3 T(T)nT T(T)nT 5 5 3 3 5 5 3 A(A)nA A(A)nA 5 -核酸外切酶核酸外切酶-核酸外切酶核酸外切酶末端转移酶末端转移酶+ dATP末端转移酶末端转移酶+ dTTPT(T)nTA(A)nAA(A)nA T(T)nTT4 DNA连接酶连接酶15C重组体重组体5. T-A克隆克隆是直接将是直接将PCR产物插入到载体中的方产物插入到载体中的方法。法。第五节第五节 重组分子的导入和筛选与鉴定重组分子的导入和筛选与鉴定一、重组一、重组DNA分子的导入分子的导入 转转二、重

28、组二、重组DNA分子的筛选与鉴定分子的筛选与鉴定筛筛一、重组一、重组DNA分子的导入分子的导入宿主细胞应具备的条件宿主细胞应具备的条件n处于感受态处于感受态n对载体无严格限制对载体无严格限制 n限制酶和重组酶缺陷限制酶和重组酶缺陷n不对外源不对外源DNA进行修饰进行修饰 n能表达重组体所提供表型特征能表达重组体所提供表型特征导入方式导入方式n转化转化 (transformation)n转染转染 (transfection)n感染感染 (infection)磷酸钙转染磷酸钙转染DEAE-葡聚糖介葡聚糖介导转染导转染电穿孔转染电穿孔转染脂质体转染脂质体转染显微注射显微注射非转化子非转化子转化子转化

29、子非重组子非重组子重组子重组子鉴定鉴定单抗生素筛选单抗生素筛选非转化子非转化子(不能生长）不能生长）转化子转化子阳性重组子阳性重组子自身环化载体自身环化载体未酶解完全载体未酶解完全载体非目的基因插入载体非目的基因插入载体二、重组二、重组DNA分子的筛选与鉴定分子的筛选与鉴定 直接选择法直接选择法n 抗药性标记选择抗药性标记选择n 标志补救标志补救 (marker rescue)n 分子杂交法分子杂交法 原位杂交原位杂交 Southern印迹印迹 免疫学方法免疫学方法 如免疫化学方法及酶免检测分析等如免疫化学方法及酶免检测分析等重组子的筛选与鉴定方法重组子的筛选与鉴定方法 AmprTerr1.

30、插入失活插入失活: 例例1：在：在Tetr中插入目的基因中插入目的基因在质粒固有的功能基因内插入目的基因，则该基因不能表达有功能的蛋白质。 AmpTet1 2 34 5 63和5 是阳性克隆1 2 34 5 6例例1： X-gal蓝色化合物-半乳糖苷酶Lac-Z基因例例3：蓝白斑筛选：蓝白斑筛选重组重组DNA技术操作过程可形象归纳为技术操作过程可形象归纳为 小小 结结分分分离目的基因分离目的基因 切切限制酶切目的基因与载体限制酶切目的基因与载体接接拼接重组体拼接重组体 转转转入受体菌转入受体菌 筛筛筛选重组体筛选重组体 重组重组DNA技术操作的主要步骤技术操作的主要步骤载体载体质粒质粒噬菌体噬

31、菌体病毒病毒目的基因（外源基因）目的基因（外源基因）基因组基因组DNA cDNA 人工合成人工合成PCR产物产物限制酶消化限制酶消化开环载体开环载体DNA目的基因目的基因连接酶连接酶重组体重组体转化转化体外包装，转染体外包装，转染带重组体的宿主带重组体的宿主筛选筛选表型筛选表型筛选酶切电泳鉴定酶切电泳鉴定菌落原位杂交菌落原位杂交第六节第六节 外源基因的表达外源基因的表达表达体系的建立表达体系的建立表达载体的构建表达载体的构建受体细胞的建立受体细胞的建立表达产物的分离纯化表达产物的分离纯化 外源基因的表达涉及目的基因外源基因的表达涉及目的基因的克隆、复制、转录、翻译、蛋白的克隆、复制、转录、翻译

32、、蛋白质产物的加工及分离纯化等过程质产物的加工及分离纯化等过程 一、外源基因在原核细胞中的表达一、外源基因在原核细胞中的表达 原核表达系统主要有大肠杆菌、芽原核表达系统主要有大肠杆菌、芽孢杆菌及链霉菌系统等孢杆菌及链霉菌系统等 ，其中，其中大肠杆大肠杆菌（菌（E.coli）表达体系最为常用，其优表达体系最为常用，其优点是培养方法简单、迅速、经济而又点是培养方法简单、迅速、经济而又适合大规模生产适合大规模生产 （一）对外源目的基因的要求（一）对外源目的基因的要求1外源真核基因不能带有外源真核基因不能带有5 端非编码区和内端非编码区和内 含子结构，必须用含子结构，必须用cDNA或化学合成基因或化学

33、合成基因2外源基因必须置于原核细胞的强启动子和外源基因必须置于原核细胞的强启动子和 SD序列等元件控制下序列等元件控制下3重组载体必须形成正确的开放阅读框架重组载体必须形成正确的开放阅读框架4外源基因转录生成的外源基因转录生成的mRNA必须相对稳定并必须相对稳定并 能被有效翻译，所表达的蛋白质产物稳，能被有效翻译，所表达的蛋白质产物稳， 不能对宿主菌有毒害作用不能对宿主菌有毒害作用（二）对原核表达载体的要求（二）对原核表达载体的要求1具有强启动子及其两侧的调控序列具有强启动子及其两侧的调控序列2含有含有SD序列，而且序列，而且SD序列与起始序列与起始 密码子密码子AUG之间要有合适的距离之间要有合适的距离 3带有转录终止序列带有转录终止序列 4含多接头克隆位点含多接头克隆位点 （三）外源基因在原核细胞中的表达（三）外源基因在原核细胞中的表达1. 融合型表达蛋白融合型表达蛋白2. 非融合型表达非融合型表达3. 分泌型表达分泌型表达4. 包含体包含体 （四）原核表达系统的不足（四）原核表达系统的不足 n只适合表达克隆的只适合表达克隆的cDNA，不宜表达真核基因，不宜表达真核基因组组DNA n表达的真核蛋白不能形成正确的折叠和进行表达的真核蛋白不能形成正确的折叠和进行糖基化、磷酸化、乙酰化等修饰糖基化、磷酸化、乙酰化等修饰 n真核蛋白常以无生物活性的包含体形式存在真核蛋白常以无生物活