第三章沉淀法

1、 沉淀法沉淀法 离心法离心法 电泳法电泳法 层析法层析法 是纯化生物大分子物质常用的一种经是纯化生物大分子物质常用的一种经典方法；优点：操作简单，成本低廉；典方法；优点：操作简单，成本低廉； 分类：分类：盐析沉淀、有机溶剂沉淀和选择沉淀盐析沉淀、有机溶剂沉淀和选择沉淀 原理：是蛋白质在稀盐溶液中，溶解度会随盐原理：是蛋白质在稀盐溶液中，溶解度会随盐浓度的增高而上升浓度的增高而上升( (盐溶盐溶) )但当盐浓度增高到但当盐浓度增高到一定数值时、其溶解度又逐渐下降，直至蛋白一定数值时、其溶解度又逐渐下降，直至蛋白质析出质析出( (盐析盐析) )。 原因：原因：在一定浓度的中性盐作用下，蛋白质颗在一

2、定浓度的中性盐作用下，蛋白质颗粒失去电荷和水膜，则沉淀析出。这时所获得粒失去电荷和水膜，则沉淀析出。这时所获得的蛋白质沉淀，能保留蛋白质原来的性质的蛋白质沉淀，能保留蛋白质原来的性质。 常用中性盐：主要有硫酸铵、硫酸镁、硫酸常用中性盐：主要有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等。钠、氯化钠、磷酸钠等。 其中应用最广的是其中应用最广的是硫酸铵硫酸铵； 其优点：其优点：A.A. 温度系数小而溶解度大温度系数小而溶解度大(25(25时饱和溶解度时饱和溶解度为为4.1mol/L,4.1mol/L,即即767g/L;0767g/L;0为为3.9mol/L3.9mol/L，即，即676g/L)676g

3、/L)，适合许多蛋白质和酶的盐析，适合许多蛋白质和酶的盐析；（1）盐类的选择）盐类的选择B.B. 分级沉淀效果比其他盐好。比如：分级沉淀效果比其他盐好。比如：有些抽提有些抽提液经过加入适量硫酸铵的一步分组沉淀液经过加入适量硫酸铵的一步分组沉淀, ,就就可除去杂蛋白可除去杂蛋白75%75%以上以上；C.C. 不容易引起蛋白质变性，不容易引起蛋白质变性，有稳定蛋白质结构有稳定蛋白质结构的作用。比如将的作用。比如将2-3mol/L2-3mol/L硫酸铵盐析的蛋白硫酸铵盐析的蛋白质置低温下保存一年其性质没有变化；质置低温下保存一年其性质没有变化；D.D. 硫酸铵价廉易得，硫酸铵价廉易得，废液可肥田。废

4、液可肥田。 缺点：缺点：即得到的样品欲继续纯化时，需花一定时间脱盐。即得到的样品欲继续纯化时，需花一定时间脱盐。在大体积粗制品溶液中逐步加入固体硫酸铵，加在大体积粗制品溶液中逐步加入固体硫酸铵，加到一定饱和度时，蛋白质可沉淀出来。到一定饱和度时，蛋白质可沉淀出来。注意：注意： 控制加硫酸铵的速度，在搅拌下、以少量多次方控制加硫酸铵的速度，在搅拌下、以少量多次方式缓慢地加入，待先加的硫酸铵溶解后再加入少式缓慢地加入，待先加的硫酸铵溶解后再加入少量的硫酸铵。量的硫酸铵。固体加入法：固体加入法： 例如：例如： 在尿素酶抽提液中加入固体硫酸铵，当饱在尿素酶抽提液中加入固体硫酸铵，当饱和度达和度达35%

5、35%，尿素酶基本上仍留在溶液中。，尿素酶基本上仍留在溶液中。而饱和度达而饱和度达5555时尿素酶几乎全都沉淀出时尿素酶几乎全都沉淀出来来( (见表见表2-1)2-1)。欲将蛋白质溶液变成一定的硫。欲将蛋白质溶液变成一定的硫酸铵盐饱和溶液时，要加入的硫酸铵数量可酸铵盐饱和溶液时，要加入的硫酸铵数量可从硫酸铵饱和溶液计算表查得。从硫酸铵饱和溶液计算表查得。V = V0S2 - S1S3 - S2 在蛋白质溶液中逐步加入预先调好在蛋白质溶液中逐步加入预先调好pHpH的饱和的饱和硫硫酸铵溶液，不同饱和度所需的硫酸铵量可酸铵溶液，不同饱和度所需的硫酸铵量可用下列公式计算：用下列公式计算：V V 需加入

6、硫酸铵溶液的体积需加入硫酸铵溶液的体积( (毫升毫升) )；V V。= =原来溶剂的体积（毫升原来溶剂的体积（毫升) )；S S1 1原来溶液的百分饱和度；原来溶液的百分饱和度；S S2 2要求达到的百分饱和度；要求达到的百分饱和度；S S3 3需要加入硫酸铵溶液的饱和度需要加入硫酸铵溶液的饱和度( (一般用一般用100%)100%)。 优点：比加入固体硫酸铵沉淀法温和；优点：比加入固体硫酸铵沉淀法温和； 缺点：对于大体积样品不适用。因为硫缺点：对于大体积样品不适用。因为硫酸铵溶液的大量加入，将导致样品溶液酸铵溶液的大量加入，将导致样品溶液体积增加。例体积增加。例如，当样品达到如，当样品达到5

7、050硫酸硫酸铵饱和度时，其体积增加一倍。铵饱和度时，其体积增加一倍。 将盛蛋白质溶液的透析袋放入一定浓度的大将盛蛋白质溶液的透析袋放入一定浓度的大体积盐溶液中，通过透析作用来改变蛋白质体积盐溶液中，通过透析作用来改变蛋白质溶液中的盐浓度。溶液中的盐浓度。 特点：盐浓度是以连续的状态变化，可以避特点：盐浓度是以连续的状态变化，可以避免盐浓度局部升高产生的不良影响，分离效免盐浓度局部升高产生的不良影响，分离效果好。果好。 用盐析法沉淀欲分离样品时所需盐浓度范围用盐析法沉淀欲分离样品时所需盐浓度范围要通过实验确定。要通过实验确定。具体步骤：具体步骤： 取一定体积已测含量之蛋白质或酶的待分离取一定体

8、积已测含量之蛋白质或酶的待分离溶液，调节溶液，调节pHpH至稳定范围，分至稳定范围，分6-106-10次加入不次加入不同量的硫酸铵：第一次加硫酸铵到溶液出现同量的硫酸铵：第一次加硫酸铵到溶液出现微弱混浊状态时，静置一段时间，离心或过微弱混浊状态时，静置一段时间，离心或过滤即得到第一个分级沉淀部分。接着以同样滤即得到第一个分级沉淀部分。接着以同样的操作加硫酸铵到上清液或过滤液中则得的操作加硫酸铵到上清液或过滤液中则得到第二个分级沉淀部分。到第二个分级沉淀部分。 如此连续进行便可得到如此连续进行便可得到6-106-10个分级沉淀部个分级沉淀部分。然后将每个分级沉淀部分分别重新溶解分。然后将每个分级

9、沉淀部分分别重新溶解于一定体积的适宜于一定体积的适宜pHpH的缓冲液中，根据其蛋的缓冲液中，根据其蛋白质或酶含量和相对应的硫酸铵浓度之间的白质或酶含量和相对应的硫酸铵浓度之间的关系作图，即可得到典型盐析曲线，在此曲关系作图，即可得到典型盐析曲线，在此曲线基础上，参照分级试验方法，可找出有利线基础上，参照分级试验方法，可找出有利于提高收得率和纯化倍数的精细盐析范围。于提高收得率和纯化倍数的精细盐析范围。4020蛋白质沉淀蛋白质沉淀% %100%饱和度饱和度时的溶质量时的溶质量20406080100盐析曲线示意图盐析曲线示意图硫酸铵溶液的饱和度硫酸铵溶液的饱和度饱和度饱和度范围范围% %酶沉淀酶沉

10、淀% %蛋白蛋白沉淀沉淀% %纯化纯化倍数倍数备注备注第一第一次试次试验验04004040604060608060804 4626232322525222232322.82.81.01.0酶在酶在4060%盐中沉淀比盐中沉淀比6080%的多，要改试的多，要改试4570%的盐沉淀。的盐沉淀。第二第二次试次试验验045045457045706 69090323225252.42.44570%的盐收得率高但的盐收得率高但纯化倍数纯化倍数第一次，欲第一次，欲提高纯度，需试提高纯度，需试4865%的盐饱和度。的盐饱和度。第三第三次试次试验验0480484865486510107575353525253.

11、03.0硫酸铵的分级试验硫酸铵的分级试验每种蛋白质在溶液中的溶解度和该溶液的盐浓度之间每种蛋白质在溶液中的溶解度和该溶液的盐浓度之间存在下列关系，即溶解度存在下列关系，即溶解度(S(S，以，以mgmgmlml表示表示) )的对数的对数值与溶液中盐的浓度值与溶液中盐的浓度(M)(M)成反比例关系，可用下面的公成反比例关系，可用下面的公式表示式表示: : lgSlgS- K- Ka a M M式中式中 表示有效成分在水中溶解度的对数值；表示有效成分在水中溶解度的对数值；MM表示克表示克分子浓度；分子浓度；K Ka a表示有效成分在特定条件下的数值，即表示有效成分在特定条件下的数值，即表示有效成分之

12、溶解度降低的速率是随着盐浓度的增表示有效成分之溶解度降低的速率是随着盐浓度的增加而增加的。加而增加的。(1)盐析常数盐析常数(Ka) K Ka a值大，则意味着有效成分溶解度降低值大，则意味着有效成分溶解度降低的速率快。因此，对一种有效成分而言，的速率快。因此，对一种有效成分而言，K Ka a值越大，分级范围越窄。盐析效果就值越大，分级范围越窄。盐析效果就越好。越好。 某一蛋白质的某一蛋白质的K Ka a值不仅与蛋白质本身的值不仅与蛋白质本身的性质有关，而且与溶液的性质有关，而且与溶液的pHpH、温度和盐、温度和盐的种类等因子也有关。的种类等因子也有关。 当分离两种以上蛋白质时，若每一种蛋白当

13、分离两种以上蛋白质时，若每一种蛋白质的质的K Ks s值都很大，而且盐析范围值都很大，而且盐析范围( (盐离子强盐离子强度度) )差异明显，则分离效果好；若差异明显，则分离效果好；若K Ks s值很大，值很大，但盐析范围差异较小，则分离效果不好。但盐析范围差异较小，则分离效果不好。沉淀量（沉淀量（mg）30405060708090ABC三种蛋白质的盐析曲线图三种蛋白质的盐析曲线图硫酸铵饱和度硫酸铵饱和度% 溶解度与溶解度与pHpH和盐浓度有密切关系。当这两种因子变和盐浓度有密切关系。当这两种因子变动时，溶解度将发生明显的变化。动时，溶解度将发生明显的变化。例如，兔肌甘油醛磷酸脱氢酶例如，兔肌甘

14、油醛磷酸脱氢酶( (等电点等电点8.58.5左右左右) )在在PHPH6.06.0时，能溶于时，能溶于3.2mol/L(NH3.2mol/L(NH4 4) )2 2SOSO4 4溶液，但当溶液，但当PHPH调至调至7 7时，立即产生沉淀，甚至有结晶析出。时，立即产生沉淀，甚至有结晶析出。 蛋白质存在的形式蛋白质存在的形式( (均一的，还是混合的均一的，还是混合的) )和和浓度不同，盐析范围和溶解度也不同。在混浓度不同，盐析范围和溶解度也不同。在混合的蛋白质溶液中，不同分子间的相互作用合的蛋白质溶液中，不同分子间的相互作用会发生共沉淀现象。蛋白浓度越高，这种现会发生共沉淀现象。蛋白浓度越高，这种

15、现象越明显，盐析分离效果则越差。因此一象越明显，盐析分离效果则越差。因此一般控制样品液蛋白浓度在般控制样品液蛋白浓度在0.20.2一一2 2为宜。为宜。 其它其它在进行盐析沉淀时，有时需在溶液中加在进行盐析沉淀时，有时需在溶液中加1mmo1/L1mmo1/L的的EDTA-NaEDTA-Na盐，盐，以除去沉淀剂中带入以除去沉淀剂中带入的金属离子。的金属离子。 再者是加硫酸铵沉淀的时间要控制好，过长再者是加硫酸铵沉淀的时间要控制好，过长过短都不适宜。一般需要二小时左右。过短都不适宜。一般需要二小时左右。具体操作：是把待脱盐溶液装入有一定孔径的透析具体操作：是把待脱盐溶液装入有一定孔径的透析袋，扎紧

16、袋口袋，扎紧袋口( (袋内留适当的空间袋内留适当的空间) )。漂在水或适当。漂在水或适当的透析液中。要防止透析液从袋口进入，以免引起的透析液中。要防止透析液从袋口进入，以免引起透析袋胀裂，盐离子和小分子物质将穿过半透膜由透析袋胀裂，盐离子和小分子物质将穿过半透膜由高向低进行扩散渗透，而大分子物质如蛋白质等则高向低进行扩散渗透，而大分子物质如蛋白质等则留在袋内。为了加快透析速度，应不断更新透析液，留在袋内。为了加快透析速度，应不断更新透析液，若用温和搅动的办法则效果较好；若用温和搅动的办法则效果较好；为了避免蛋白质为了避免蛋白质或酶类破坏，通常宜在低温下进行。或酶类破坏，通常宜在低温下进行。常用

17、方法：凝胶过滤法和透析法。常用方法：凝胶过滤法和透析法。购买的透析袋购买的透析袋( (或纸或纸) ) 用蒸馏水洗净用蒸馏水洗净, ,无漏洞时，即可无漏洞时，即可使用。使用。除去某些易被金属或水解酶等破坏的样品中所含盐除去某些易被金属或水解酶等破坏的样品中所含盐类时，透析袋的处理方法：类时，透析袋的处理方法： 将将l0 l0厘米长的透析袋置厘米长的透析袋置500500毫升含毫升含1mmo11mmo1L L EDTA-NaEDTA-Na2 2的的2 2碳酸氢钠溶液中煮沸碳酸氢钠溶液中煮沸1010分钟，用干分钟，用干净镊子或戴橡皮手套取出，蒸馏水煮沸、漂洗后，净镊子或戴橡皮手套取出，蒸馏水煮沸、漂洗

18、后，即可使用。用过的透析袋依上述方法处理，能重复即可使用。用过的透析袋依上述方法处理，能重复使用，若不马上使用，可泡在蒸馏水中置低温使用，若不马上使用，可泡在蒸馏水中置低温（44）；或泡在）；或泡在7070的乙醇中保存。的乙醇中保存。（1 1）透析袋的处理）透析袋的处理 透析袋或透析管的孔径和规格因厂而异。透透析袋或透析管的孔径和规格因厂而异。透析袋的孔径大小除与其型号有关外，还受处析袋的孔径大小除与其型号有关外，还受处理方法的影响。例如，用理方法的影响。例如，用64%64%氯化锌溶液浸氯化锌溶液浸泡过的透析袋，可使其孔径增大到能通过泡过的透析袋，可使其孔径增大到能通过135000135000

19、道尔顿的大分子。而经乙酰化作用的道尔顿的大分子。而经乙酰化作用的透析袋，则可使其孔径缩小到能阻滞甲醇分透析袋，则可使其孔径缩小到能阻滞甲醇分子的通过。子的通过。 一般选用的透析液均为低离子强度的中性缓一般选用的透析液均为低离子强度的中性缓冲液。对含有辅基的酶透析时，在透析液中冲液。对含有辅基的酶透析时，在透析液中宜加入适量的辅基或保护辅基的试剂。为了宜加入适量的辅基或保护辅基的试剂。为了防止微生物生长，透析应在防止微生物生长，透析应在44进行或在透进行或在透析液中添加析液中添加0.020.02叠氮化钠。叠氮化钠。 操作在搅拌下进行时，样品液与透析液体操作在搅拌下进行时，样品液与透析液体积之比以

20、积之比以1:101:10较好，一般三小时可达平衡。较好，一般三小时可达平衡。若透析在静止状态下过夜进行时，则比例若透析在静止状态下过夜进行时，则比例应扩大到应扩大到1 1：2020以上。以上。 有机溶剂能降低蛋白质溶解度的原因：有机溶剂能降低蛋白质溶解度的原因：1 1、与盐溶液一样具有脱水作用；、与盐溶液一样具有脱水作用；2 2、有机溶剂的介电常数比水小，导致、有机溶剂的介电常数比水小，导致溶剂的极性减小。溶剂的极性减小。 常用的有机溶剂：甲醇、乙醇和丙酮常用的有机溶剂：甲醇、乙醇和丙酮。V V需加入有机溶剂的体积；需加入有机溶剂的体积；VoVo蛋白溶液的蛋白溶液的原始体积；原始体积；S1S1

21、蛋白溶液中有机溶剂的浓度蛋白溶液中有机溶剂的浓度( (体积百分浓度体积百分浓度) )；S2蛋白溶液中欲达到的溶蛋白溶液中欲达到的溶剂浓度剂浓度(体积百分浓度体积百分浓度)。 V = V0 S2-S1100-S2 如果使用的有机溶剂含量不是如果使用的有机溶剂含量不是100100而是而是95%95%，则公式中的则公式中的100100应改应改9595，余此类推。，余此类推。 用有机溶剂沉淀法分离某些蛋白质时，效果用有机溶剂沉淀法分离某些蛋白质时，效果也不错。如，从解酚假单胞菌分离邻苯二酚也不错。如，从解酚假单胞菌分离邻苯二酚- -2,3-2,3-双加氧酶时双加氧酶时, ,在粗提液中加入在粗提液中加入

22、5050到到6060的冷丙酮溶剂的冷丙酮溶剂, ,能把几乎全部欲分离物沉淀能把几乎全部欲分离物沉淀出来。有机溶剂沉淀法的操作与硫酸铵盐析出来。有机溶剂沉淀法的操作与硫酸铵盐析法相似。法相似。 由于有机溶剂加入水溶液时产生放热反应会由于有机溶剂加入水溶液时产生放热反应会引起蛋白质变性，因此必须把所用之有机溶引起蛋白质变性，因此必须把所用之有机溶剂预冷至剂预冷至-10-10，而且整个操作要在低温下，而且整个操作要在低温下进行。进行。(1)(1)低温下操作低温下操作加入适量的中性盐能增加蛋白质在有机溶剂中的溶加入适量的中性盐能增加蛋白质在有机溶剂中的溶解度，可降低有机溶剂对蛋白质的变性作用，同时解度

23、，可降低有机溶剂对蛋白质的变性作用，同时还可提高分级效果。还可提高分级效果。但是，加入的量过多，则可引起蛋白质析出，影响但是，加入的量过多，则可引起蛋白质析出，影响有机溶剂的分级作用。中性盐的离子强度在有机溶剂的分级作用。中性盐的离子强度在0.050.05以以下时，能防止蛋白质变性。下时，能防止蛋白质变性。用有机溶剂沉淀蛋白质时，宜在稀盐溶液或低浓度用有机溶剂沉淀蛋白质时，宜在稀盐溶液或低浓度缓冲液中进行。缓冲液中进行。 有些蛋白质和多价阳离子有些蛋白质和多价阳离子( (如如ZnZn2+2+、CuCu2+2+等等) )能能结合形成复合物，致使蛋白质在有机溶剂中结合形成复合物，致使蛋白质在有机溶

24、剂中的溶解度降低。这对在高浓度溶剂中才能沉的溶解度降低。这对在高浓度溶剂中才能沉淀的蛋白质特别有益。淀的蛋白质特别有益。 例如，在某些蛋白质溶液中只要加入例如，在某些蛋白质溶液中只要加入0.005-0.005-0.02nmol/L Zn0.02nmol/L Zn2+2+，就可大大减少有机溶剂的，就可大大减少有机溶剂的用量，而将蛋白质沉淀出来。用量，而将蛋白质沉淀出来。盐溶盐溶盐析盐析有机溶剂沉淀有机溶剂沉淀影响影响因素因素蛋白质分子表面的蛋白质分子表面的带电基团带电基团蛋白质分子表面的非蛋白质分子表面的非极性基团极性基团除了疏水之外的其它作除了疏水之外的其它作用力用力试剂试剂NaCl(单价离子

25、单价离子)硫酸铵硫酸铵(两价离子两价离子)甲醇、丙酮等有机溶剂甲醇、丙酮等有机溶剂发生发生机制机制蛋白质在其蛋白质在其pI下，下，因电荷为零而聚集因电荷为零而聚集沉淀；若加入盐类，沉淀；若加入盐类，会阻碍其聚集而增会阻碍其聚集而增加溶解度。加溶解度。硫酸铵的两价离子，硫酸铵的两价离子，在溶液中抢走附在蛋在溶液中抢走附在蛋白质表面白质表面(非极性非极性)的水的水分子，使得非极性部分子，使得非极性部分相互吸引而聚集沉分相互吸引而聚集沉淀。淀。降低水活性，使溶液的降低水活性，使溶液的介电常数下降，增加蛋介电常数下降，增加蛋白质溶质分子之间的作白质溶质分子之间的作用力，而聚集在一起。用力，而聚集在一起

26、。其它其它说明说明对较低浓度缓冲液对较低浓度缓冲液进行透析是盐溶的进行透析是盐溶的反向过程。反向过程。非极性蛋白质较早沉非极性蛋白质较早沉淀下来；在硫酸铵中淀下来；在硫酸铵中蛋白质相当稳定。蛋白质相当稳定。部分蛋白质变性；有助部分蛋白质变性；有助沉淀的因素：蛋白质分沉淀的因素：蛋白质分子量大，缓冲液子量大，缓冲液pH值接值接近近pI；脂溶性蛋白质的脂溶性蛋白质的溶解度反而增加。溶解度反而增加。各种盐析及沉淀法的比较各种盐析及沉淀法的比较多价阳离子的碱性蛋白质，如鱼精蛋白，除能有多价阳离子的碱性蛋白质，如鱼精蛋白，除能有效地沉淀核酸类物质外效地沉淀核酸类物质外, ,还能沉淀某些蛋白质，还能沉淀某

27、些蛋白质，当把当把90mg90mg鱼精蛋白加入部分纯化的磷酸果糖激鱼精蛋白加入部分纯化的磷酸果糖激酶溶液（含有酶溶液（含有1g1g蛋白）时候，溶液中的酶蛋白便蛋白）时候，溶液中的酶蛋白便吸附鱼精蛋白吸附鱼精蛋白- -核酸沉淀物上。沉淀物用核酸沉淀物上。沉淀物用0.1mol/L0.1mol/L磷酸缓冲液洗脱后，收得的磷酸果糖激酶的纯度磷酸缓冲液洗脱后，收得的磷酸果糖激酶的纯度比原来提高了九倍。比原来提高了九倍。1 1、碱性蛋白质、碱性蛋白质 反应是不可逆的，应用受到了限制；反应是不可逆的，应用受到了限制； 在应用多价阳离子物质时，因其水溶液在应用多价阳离子物质时，因其水溶液PHPH值值为为2-3

28、2-3，所以要小心地中和后，再加到蛋白，所以要小心地中和后，再加到蛋白质溶液中。质溶液中。缺点：缺点：植物中特殊的蛋白质，对糖蛋白中糖链的末端糖植物中特殊的蛋白质，对糖蛋白中糖链的末端糖序列具有明显、特异的凝集力。例如，伴刀豆球序列具有明显、特异的凝集力。例如，伴刀豆球蛋白与含有葡萄糖、甘露糖等分子的糖蛋白能发蛋白与含有葡萄糖、甘露糖等分子的糖蛋白能发生特异的凝集沉淀作用，通过离心操作可把糖蛋生特异的凝集沉淀作用，通过离心操作可把糖蛋白和一般蛋白质分开，获得的凝集素白和一般蛋白质分开，获得的凝集素- -糖蛋白复糖蛋白复合物用单糖作抑制剂就能使其解离。合物用单糖作抑制剂就能使其解离。优点：反应条

29、件较温和，专一性强。优点：反应条件较温和，专一性强。 重金属盐如铅盐、汞盐作为蛋白质沉淀剂能重金属盐如铅盐、汞盐作为蛋白质沉淀剂能使蛋白质或酶纯化。重金属会使蛋白质变性，使蛋白质或酶纯化。重金属会使蛋白质变性，因此控制在较温和的因此控制在较温和的条件下进行，并要及时条件下进行，并要及时通过透析方法把蛋白质和重金属尽快分开。通过透析方法把蛋白质和重金属尽快分开。 优点：优点： 条件温和，不易引起蛋白质变性，而且沉淀较条件温和，不易引起蛋白质变性，而且沉淀较完全，应用范围颇广。完全，应用范围颇广。 缺点：缺点： 易受各种因子如易受各种因子如pHpH、离子强度、蛋白质浓度及、离子强度、蛋白质浓度及聚

30、合物分子量的影响。聚合物分子量的影响。沉淀作用较满沉淀作用较满意的聚合物是个分子量在意的聚合物是个分子量在400-400-60006000之间的聚乙二醇。之间的聚乙二醇。水溶性非离子型聚合物，可使蛋白质发生沉淀作用。水溶性非离子型聚合物，可使蛋白质发生沉淀作用。 当从卡尔斯伯酵母菌提取当从卡尔斯伯酵母菌提取-葡糖苷酶时，加葡糖苷酶时，加2020PEG 6000PEG 6000或或57%PEG40057%PEG400到置冰浴中并已盛到置冰浴中并已盛抽提液的离心管内，立即在旋涡仪上振荡混抽提液的离心管内，立即在旋涡仪上振荡混合再置冰浴合再置冰浴15-1815-18小时，小时，10000g10000

31、g离心离心1 1小时，小时，去上清液，沉淀物溶在去上清液，沉淀物溶在10mmo1/L10mmo1/L磷酸缓冲液磷酸缓冲液pHl6.8)pHl6.8)中。中。a-a-葡糖苷酶的回收率在葡糖苷酶的回收率在8080左左右。就右。就a-a-葡糖苷酶的纯度而言，用葡糖苷酶的纯度而言，用PEG400PEG400沉淀沉淀远比远比PEG6000PEG6000高。高。PEG400PEG400产生高专一性的分离产生高专一性的分离效果，有时可与葡萄糖凝胶层析效果，有时可与葡萄糖凝胶层析相比。相比。 根据各种蛋白质在不同物理化学因子根据各种蛋白质在不同物理化学因子( (如温度、如温度、酸碱度和有机溶剂等酸碱度和有机溶剂等) )作用下稳定性不同的特作用下稳定性不同的特点，用适当的选择性沉淀法，即可使杂蛋白点，用适当的选择性沉淀法，即可使杂蛋白变性沉淀，而欲分离的有效成分则存在于溶变性沉淀，而欲分离的有效成分则存在于溶液中液中( (或者发生可逆性沉淀或者发生可逆性沉淀) )，从而达到纯化，从而达到纯化有效成分的目的。有效成分的目的。 例如，从一种假单胞菌培养液纯化碱性脂酶例如，从一种假单胞菌培养液纯化碱性脂酶时，是采用改变酸碱度的选择性沉淀法。即时，是采用改变酸碱度的选择性沉淀法。即在培养液中加盐酸酸调在培养液中加盐酸酸调pHpH到到4.04.0，出现含碱性，出现含碱性脂酶