酶组织化学概论

1、酶组织化学概论酶组织化学概论 酶是一种具有催化活性的特殊蛋白酶是一种具有催化活性的特殊蛋白质。人体的各种机能活动都与酶的活性质。人体的各种机能活动都与酶的活性有密切关系。有密切关系。 国际生物化学酶学委员会已登记的国际生物化学酶学委员会已登记的酶有酶有22002200多种。但当前组织化学技术所多种。但当前组织化学技术所能显示的酶仅能显示的酶仅200200多种。多种。 酶组织化学是用组织化学的方法证酶组织化学是用组织化学的方法证明酶的存在，它的基础是组织化学，目明酶的存在，它的基础是组织化学，目的在于阐明组织细胞内的化学反应、功的在于阐明组织细胞内的化学反应、功能及其生物学意义。能及其生物学意义

2、。一、酶的分类一、酶的分类 1.1.氧化还原酶氧化还原酶 是催化氧化还原反应是催化氧化还原反应的酶。包括脱氢酶、氧化酶、过氧化物酶的酶。包括脱氢酶、氧化酶、过氧化物酶和加单氧酶。如苹果酸脱氢酶、黄嘌呤氧和加单氧酶。如苹果酸脱氢酶、黄嘌呤氧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶与羟化酶或混化酶、谷胱甘肽过氧化物酶与羟化酶或混合功能氧化酶。合功能氧化酶。 2. 2.转移酶转移酶 即催化功能基团转移的即催化功能基团转移的酶。此大类可根据底物中被转移的基团酶。此大类可根据底物中被转移的基团性质分为性质分为8 8个亚类。其中第个亚类。其中第6 6亚类为转移亚类为转移含氮基基团的酶，如天门冬酸转移酶。含氮基基团的酶，如

3、天门冬酸转移酶。 3.3.水解酶水解酶 即催化水解反应的酶，即催化水解反应的酶，称为水解酶。水解酶又可根据其与水解称为水解酶。水解酶又可根据其与水解反应有关的键的类型进一步分为亚酶类，反应有关的键的类型进一步分为亚酶类，如酯酶、糖酶和肽酶。如酯酶、糖酶和肽酶。 4. 4.裂解酶裂解酶 又称裂合酶。促进一种化又称裂合酶。促进一种化合物分成两种化合物，或由两种化合物合合物分成两种化合物，或由两种化合物合成一种化合物的酶类。它可使底物移去基成一种化合物的酶类。它可使底物移去基团，如团，如 H H2 20 0、C0C02 2，并出现双键。此类酶的，并出现双键。此类酶的亚类比较多，一般表示分裂的基团，如

4、其亚类比较多，一般表示分裂的基团，如其中第中第1 1亚类为裂解亚类为裂解C-CC-C基团的酶，如草酰乙基团的酶，如草酰乙酸脱羧酶；第酸脱羧酶；第2 2亚类是裂解亚类是裂解C-OC-O基团的酶，基团的酶，如脱羧酶等。如脱羧酶等。 5. 5.异构酶异构酶 催化同分异构体的相互转催化同分异构体的相互转化。磷酸葡萄糖异构酶，磷酸丙糖异构酶化。磷酸葡萄糖异构酶，磷酸丙糖异构酶等。等。 6.6.合成酶（又称连接酶）合成酶（又称连接酶） 系指能将系指能将两种物质合成为一种物质，并必须与两种物质合成为一种物质，并必须与ATPATP分解相偶联的酶。分解相偶联的酶。二、光镜酶组织化学证明法二、光镜酶组织化学证明法

5、 1 1金属金属- -金属盐法金属盐法 金属盐法一般是指金、银、铜、铁、金属盐法一般是指金、银、铜、铁、铝、钴等金属。金属、金属盐及其化合物铝、钴等金属。金属、金属盐及其化合物都具有颜色，容易发生呈色反应。而且酶都具有颜色，容易发生呈色反应。而且酶的分解产物和金属多半可以结合。因此，的分解产物和金属多半可以结合。因此，捕捉酶反应的分解产物，使其与金属结合，捕捉酶反应的分解产物，使其与金属结合，利用其呈色反应，再显现出酶反应的部位，利用其呈色反应，再显现出酶反应的部位，就可以证明某种酶的存在。就可以证明某种酶的存在。 酶作用于底物后生成的分解产物与底酶作用于底物后生成的分解产物与底物孵育液中的金

6、属离子相结合，直接沉着物孵育液中的金属离子相结合，直接沉着于酶的反应局部，然后使其显色。其反应于酶的反应局部，然后使其显色。其反应式如下：式如下： PbPb2+2+ (NH (NH4 4) )2 2S S R-PO R-PO4 4NaNa2 2 + H + H2 2O ROH + PbHPOO ROH + PbHPO4 4 PbS PbS 酶反应酶反应 显色显色 这种方法在底物溶液中的这种方法在底物溶液中的H H+ +浓度为中浓度为中胜或弱酸性，常常可利用易获得的硝酸铅胜或弱酸性，常常可利用易获得的硝酸铅或醋酸铅。因此，本法常被应用于酸性磷或醋酸铅。因此，本法常被应用于酸性磷酸酶和在中性附近起

7、作用的磷酸酯酶类。酸酶和在中性附近起作用的磷酸酯酶类。通常称本法为硫化铅法。通常称本法为硫化铅法。 证明碱性磷酸酶时，通过形成可见的证明碱性磷酸酶时，通过形成可见的黑色硫化钴，称为硫化钴法。黑色硫化钴，称为硫化钴法。 CaCa2+2+ R-POR-PO4 4NaNa2 2 + H + H2 2O ROH + CaHPOO ROH + CaHPO4 4 酶反应酶反应 CoCo2+2+ （NHNH4 4) )2 2S S CoHPO CoHPO4 4 CoS CoS 金属置换金属置换 显色显色 用这些金属盐法能够证明的酶多半是用这些金属盐法能够证明的酶多半是水解酶。其中有碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、水

8、解酶。其中有碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、脲酶、酯酶、硫酸酶、碳酸酐酶、胆碱酯脲酶、酯酶、硫酸酶、碳酸酐酶、胆碱酯酶等。此外，根据磷酸酶的理论，利用组酶等。此外，根据磷酸酶的理论，利用组织化学的鉴别法能证明的酶还有磷酰胺酶、织化学的鉴别法能证明的酶还有磷酰胺酶、5-5-核苷酸酶、核苷酸酶、ATPATP酶、葡萄糖酶、葡萄糖-6-6-磷酸酶磷酸酶等。等。 2 2偶联偶氮色素法偶联偶氮色素法 偶联偶氮色素法，此法又称偶氮色素偶联偶氮色素法，此法又称偶氮色素法，是指用人工合成的酶底物，在酶的作法，是指用人工合成的酶底物，在酶的作用下，产生分解产物，后者与重氮盐结合，用下，产生分解产物，后者与重氮盐结合，引起

9、偶联偶氮反应，使其形成不溶性的偶引起偶联偶氮反应，使其形成不溶性的偶氮色素，以此证明酶的定位。氮色素，以此证明酶的定位。 在这种方法中，最常用的分解产物是在这种方法中，最常用的分解产物是茶酚系列的化合物，如茶酚系列的化合物，如2-2-萘酚、萘酚、1-1-萘酚、萘酚、萘酚萘酚ASAS、萘酚、萘酚ASAS衍生物等。但这些化合物衍生物等。但这些化合物本身也有一定的溶解性，因而其分解产物本身也有一定的溶解性，因而其分解产物有扩散的缺点。有扩散的缺点。 基于重氮盐种类不同，其偶氮颜色也基于重氮盐种类不同，其偶氮颜色也各有差异，可显示出蓝色、紫色、红色、各有差异，可显示出蓝色、紫色、红色、褐色、黑色、棕色

10、等各种颜色。褐色、黑色、棕色等各种颜色。 根据偶联的时间不同，将偶氮色素法根据偶联的时间不同，将偶氮色素法分为两种。分为两种。 1 1）同时偶联法）同时偶联法 同时偶联法是在底同时偶联法是在底物混合液中，通过酶的分解作用所得到的物混合液中，通过酶的分解作用所得到的沉着物，立即形成重氮化合物和偶氮色素。沉着物，立即形成重氮化合物和偶氮色素。 2）后偶联法）后偶联法 后偶联法是为了防止后偶联法是为了防止重氮盐对酶的抑制作用，先使酶在底物内重氮盐对酶的抑制作用，先使酶在底物内发生作用，使分解产物沉着，然后再浸渍发生作用，使分解产物沉着，然后再浸渍于重氮盐溶液中，使其形成偶氮色素。于重氮盐溶液中，使其

11、形成偶氮色素。 目前，可用这种方法证明的酶有：目前，可用这种方法证明的酶有：碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、酯酶、碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、酯酶、-葡葡苷酸酶、苷酸酶、-半乳糖苷酶、半乳糖苷酶、-葡糖苷酶、葡糖苷酶、N-N-乙酰基乙酰基-氨基葡糖酶、氨基肽酶、硫氨基葡糖酶、氨基肽酶、硫酸酯酶等等。酸酯酶等等。 3.3.色素形成法色素形成法 （1 1）四唑盐法）四唑盐法 四唑盐法是指含有四唑盐法是指含有四唑盐或双四唑盐的底物混合液，在脱四唑盐或双四唑盐的底物混合液，在脱氢酶的作用下，从底物分离出来的氢原氢酶的作用下，从底物分离出来的氢原子与无色的四唑盐或双四唑盐相结合，子与无色的四唑盐或双四唑盐相结合，形

12、成红色或蓝色的甲形成红色或蓝色的甲 （formazanformazan）或）或二甲二甲 （diformazandiformazan）色素。该法主要）色素。该法主要证明各种脱氢酶。证明各种脱氢酶。 （2 2）靛酚蓝法）靛酚蓝法 靛酚蓝法用于检测靛酚蓝法用于检测氧化酶的方法，把二甲基氧化酶的方法，把二甲基- -对对- -苯二胺和苯二胺和- - 萘酚加入底物混合液中，由酶作用萘酚加入底物混合液中，由酶作用而释放的氧与此二者发生结合，形成靛而释放的氧与此二者发生结合，形成靛酚蓝，而显示出酶的定位。酚蓝，而显示出酶的定位。 4.4.底物薄膜法底物薄膜法 底物薄膜法是把酶底物在载物片上涂底物薄膜法是把酶底

13、物在载物片上涂成膜，然后再将含酶的组织切片贴附其上，成膜，然后再将含酶的组织切片贴附其上，给以条件让酶发生反应，使底物分解。接给以条件让酶发生反应，使底物分解。接着剥离贴附的切片，对膜进行特殊染色，着剥离贴附的切片，对膜进行特殊染色，只有底物被分解的部位不着色，而未被分只有底物被分解的部位不着色，而未被分解的部位被染色，故未着色部位就是酶的解的部位被染色，故未着色部位就是酶的定位定位。三、电镜酶组织化学证明法三、电镜酶组织化学证明法 1 1氧化还原酶氧化还原酶 （1 1）四唑盐法）四唑盐法 四唑盐是水溶性四唑盐是水溶性的，在水溶液中几乎无色，还原后则的，在水溶液中几乎无色，还原后则难溶于水和脂

14、质，变成有色的高电子难溶于水和脂质，变成有色的高电子密度的甲密度的甲 。现在最常用的四唑盐有。现在最常用的四唑盐有NBTNBT和和TNBTTNBT等。等。 （2）高铁氰化物还原法）高铁氰化物还原法 本法是金本法是金属盐法的一种，高铁氰化物作为人工受属盐法的一种，高铁氰化物作为人工受氢体而被使用。高铁氰化物接受由酶作氢体而被使用。高铁氰化物接受由酶作用而游离出来的氢，从而变成亚铁氰化用而游离出来的氢，从而变成亚铁氰化物，此物质不溶于水，并以电子密度高物，此物质不溶于水，并以电子密度高的亚铁氰化铜的形式在酶活性部位被捕的亚铁氰化铜的形式在酶活性部位被捕捉而沉着。捉而沉着。 琥珀酸琥珀酸 延胡索酸延

15、胡索酸 琥珀酸脱氢酶琥珀酸脱氢酶 Fe(CN)Fe(CN)6 63- 3- Fe(CN) Fe(CN)6 64-4- 高铁氰化物高铁氰化物 亚铁氰化物亚铁氰化物 CuCu2+2+ Cu Cu2 2Fe(CN)Fe(CN)6 6XHXH2 2O O 亚铁氰化物亚铁氰化物 （3）二氨基联苯胺法）二氨基联苯胺法 二氨基联苯二氨基联苯胺法（胺法（diaminobenzidine method，DAB）法主要用在直接证明细胞色素氧化酶、法主要用在直接证明细胞色素氧化酶、过氧化物酶（内源性）、过氧化氢酶活过氧化物酶（内源性）、过氧化氢酶活性检测。性检测。DAB还用于形成嗜锇性多聚体。还用于形成嗜锇性多聚体

16、。 2.2.水解酶水解酶 （1）胆碱酯酶活性检查法）胆碱酯酶活性检查法 1 1）乙硫羧酸法根据使用的捕捉金属种类）乙硫羧酸法根据使用的捕捉金属种类的不同可有铅乙硫羟酸法等，在酶的作用下，的不同可有铅乙硫羟酸法等，在酶的作用下，游离的硫化氢与铅反应，形成硫化铅沉着于酶游离的硫化氢与铅反应，形成硫化铅沉着于酶的活性部位。的活性部位。 酯酶酯酶 Pb(NOPb(NO3 3) )2 2 CH CH3 3COSH CHCOSH CH3 3COOH + HCOOH + H2 2S PbSS PbS 2 2）嗜锇性硫酯法）嗜锇性硫酯法 是以嗜锇性硫是以嗜锇性硫酯作为底物，用坚牢蓝酯作为底物，用坚牢蓝BBNB

17、BN做偶联剂的做偶联剂的方法。方法。四、对照实验四、对照实验 1.1.抑制剂对照抑制剂对照 用酶活性的抑制剂确认酶活性受到抑制。用酶活性的抑制剂确认酶活性受到抑制。 cATPcATP 腺苷腺苷 + Pi+ Pi ATP PPiATP PPi ADP + Pi ADP + Pi 环化酶环化酶ATPATP酶酶四氧嘧啶四氧嘧啶磷酸二酯酶磷酸二酯酶茶碱茶碱特异性底物：特异性底物：5-5-腺苷酰腺苷酰- -亚氨二磷酸亚氨二磷酸 cATPcATP + PNP + PNP（亚氨二磷酸）（亚氨二磷酸）ATP-PNP ATP-PNP 无水解作用无水解作用 环化酶环化酶ATPATP酶酶 2. 2.去底物对照去底物对照 用去底物的无底物孵育液进行反用去底物