CRISPR基因编辑技术

1、CRISPR/Cas 9 系统介绍系统介绍 许许 汪汪 盛程程盛程程 于艳超于艳超周步丹周步丹 刘天昕刘天昕 郭歆岩郭歆岩CRISPR/Cas 9 背景背景 CRISPR是生命进化历史上，细菌和病毒进行斗争是生命进化历史上，细菌和病毒进行斗争产生的免疫武器，简单说就是病毒能把自己的基因整合产生的免疫武器，简单说就是病毒能把自己的基因整合到细菌内，利用细菌的细胞工具为自己的基因复制服务，到细菌内，利用细菌的细胞工具为自己的基因复制服务，细菌为了将病毒的外来入侵基因清除，进化出很多成簇细菌为了将病毒的外来入侵基因清除，进化出很多成簇的、规律间隔的短回文重复序列的、规律间隔的短回文重复序列( (既既

2、CRISPR序列序列) )和和CRISPR相关基因，这一序列首先由日本学者于相关基因，这一序列首先由日本学者于1987年年首次发现首次发现(1)，于，于2002年被年被Jansen等将正式命名等将正式命名(2)。由这。由这些序列和基因组成的系统我们称之为些序列和基因组成的系统我们称之为CRISPR/Cas系统，系统，而在这个系统中常用到的核酸内切酶为而在这个系统中常用到的核酸内切酶为Cas9, ,所以通常所以通常称该系统称该系统CRISPR/Cas9 系统。利用这个系统，细菌可系统。利用这个系统，细菌可以不动声色地把病毒基因从自己的染色体上切除，这是以不动声色地把病毒基因从自己的染色体上切除，

3、这是细菌特有的免疫系统。细菌特有的免疫系统。CRISPR/Cas 9概述概述CRISPR-Cas：一种来源是细菌获得性免疫的由：一种来源是细菌获得性免疫的由RNA指指导导Cas蛋白对靶向基因进行修饰的技术。蛋白对靶向基因进行修饰的技术。CRISPR/Cas系统的基本结构系统的基本结构识别作用识别作用切割作用切割作用 CRISPR系统通常包括：由不连续的重复序列（系统通常包括：由不连续的重复序列（repeats，R）与长度相似的间区序列（与长度相似的间区序列（spacers，S）间隔排列而成的）间隔排列而成的CRISPRCRISPR簇，簇，前导序列前导序列( (leader，L)以及一系列的以及

4、一系列的CRISPR相关蛋白基因相关蛋白基因(cas)(cas)。 Cas（CRISPR associated）：存在于）：存在于CRISPR位点附近，是位点附近，是一种双链一种双链DNA核酸酶，能在核酸酶，能在guide RNA引导下对靶位点进行切引导下对靶位点进行切割。它不需要形成二聚体才能发挥作用。割。它不需要形成二聚体才能发挥作用。CRISPR的转录与加工的转录与加工CRISPR簇首先转录成长的转录体，即（簇首先转录成长的转录体，即（crRNA），然后），然后逐步被加工成小的逐步被加工成小的 crRNA。CRISPR/Cas 9作用机理作用机理CRISPR/Cas 9作用机理作用机理P

5、AM（NGG序列）序列）CRISPR/Cas 9系统靶向要求系统靶向要求最主要的要求：最主要的要求：PAM（protospacer-adjacent motif）为）为NGG。在人。在人类基因组中，平均每类基因组中，平均每8bp就出现一个就出现一个NGG PAM。CRISPR/Cas 9基因编辑实验流程图基因编辑实验流程图CRISPR/Cas 9的技术应用的技术应用应用于基因的敲除、敲入以及基因沉默、激活等。应用于基因的敲除、敲入以及基因沉默、激活等。能够在真核细胞中发挥作用，使真核基因组中的特能够在真核细胞中发挥作用，使真核基因组中的特异性位点发生双链断裂。异性位点发生双链断裂。在模式生物中

6、的应用在模式生物中的应用: :成功地对线虫成功地对线虫( (左左) )、斑马鱼胚胎（中）和果蝇进行遗传学改造，斑马鱼胚胎（中）和果蝇进行遗传学改造，获得更粗短的线虫，腹部组织体积更大的获得更粗短的线虫，腹部组织体积更大的斑马鱼胚胎，和眼睛颜色更深的果蝇，表斑马鱼胚胎，和眼睛颜色更深的果蝇，表明明CRISPR技术在动物基因改造方面有巨技术在动物基因改造方面有巨大应用潜力。大应用潜力。中国科学院遗传中国科学院遗传所高彩霞团队：所高彩霞团队：成功地使三种水成功地使三种水稻基因失活。稻基因失活。三大基因修饰技术比较三大基因修饰技术比较CRISPR/Cas 9系统的优势系统的优势操作简单，靶向精确性更高

7、。操作简单，靶向精确性更高。sgRNA靶向序列和基因组序列靶向序列和基因组序列必须完全匹配，必须完全匹配，Cas9才会对才会对DNA进行剪切。编码进行剪切。编码sgRNA 的序列的序列不超过不超过100bp，因此比构建，因此比构建TALENs和和ZENs更简单方便，用于更简单方便，用于CRISPR的的sgRNA识别序列仅需识别序列仅需2020个核苷酸。个核苷酸。CRISPR/Cas9系统是由系统是由RNA调控的对调控的对DNA的修饰，其基因修的修饰，其基因修饰可遗传。饰可遗传。基因修饰率高，基因修饰率高，CRISPRs基因敲入的效率为基因敲入的效率为51%-79%，TALENs的效率为的效率为

8、0%-34%。基因调控方式多样，例如敲除、插入、抑制、激活等基因调控方式多样，例如敲除、插入、抑制、激活等无物种限制无物种限制, ,可实现对靶基因多个位点同时敲除。可实现对靶基因多个位点同时敲除。实验周期短，最快仅需实验周期短，最快仅需2个月，节省大量时间和成本。个月，节省大量时间和成本。(ZFNS(ZFNS一个靶点成本一个靶点成本60006000) )CRISPR/Cas 9系统的评价系统的评价参考文献：参考文献：1 Y. Ishino, H. Shinagawa, K. Makino, M. Amemura, A. Nakata, Nucleotide sequence of the ia

9、p gene, responsible for alkaline phosphatase isozyme conversion in Escherichia coli, and identification of the gene product. Journal of bacteriology 169, 5429-5433 (1987).2 R. Jansen, J. D. A. v. Embden, W. Gaastra, L. M. Schouls, Identification of genes that are associated with DNA repeats in prokaryotes. Molecular microbiology 43, 1565-1575 (2002).3方锐,畅飞,孙照霖,李宁,孟庆勇. CRISPR/Cas9介导的基因组定点编辑技术J. 生物化学与生物物理进展,2013