重组DNA技术概述

1、重组DNA技术概述重组DNA技术产生的基础n1 DNA1 DNA分子的切割与连接技术分子的切割与连接技术n1970年Smith HinfIn1972年Herbert EcoRIn1970年Khoranan T4DNA连接酶n1972年第一次体外重组DNAnSV40与DNA n2 载体构建和大肠杆菌转化体系的建立n1970年Mandel发现适当浓度的CaCl2处理大肠杆菌，可使其转化效率大大提高。n1973年构建出人造质粒，并能够转化和在宿主菌中复制。n3 Southern杂交、DNA序列分析和聚合酶链反应n1975 Southern发明Southern blot（印迹）n1977 Sanger

2、 双脱氧终止法DNA测序技术。n1985 Millus PCR遗传密码表东方神秘主义-易经的核心是阴阳n阴的符号为，阳的符号为。阴阳的相互交融，便构成了宇宙中无穷层次的阴阳体。n“无极生太极，太极生两仪，两仪生四象，四象生八卦”n易经中的阴阳衍生规律，反映了宇宙中物质从简单到复杂的派生规律。 图图3：四象与：四象与4种碱基对应种碱基对应图图 n易传系辞曰：“一阴一阳之谓道。”易经中的64卦，每一行称为宫。64卦从下往上数，第1、3、5、7宫称为阳宫，第2、4、6、8宫称为阴宫。n这样排在阳宫上的遗传密码所译成的氨基酸，按照东方的思维就是阳性氨基酸，排在阴宫上的遗传密码所代表的氨基酸则是阴性氨基

3、酸。n于是发现，西方的极性氨基酸与东方的阳性氨基酸基本一致。西方的非极性氨基酸与东方的阴性氨基酸基本一致。重组DNA技术的定义及步骤n1 定义：Recombination DNA technologyn 是按照人的意愿，在体外对DNA分子进行重组，再将重组分子导入受体细胞，使期在细胞中扩增和繁殖，以获得该DNA分子的大量拷贝。n克隆（clone）：无性繁殖系及其后代。基因完全相同。n基因克隆；基因工程等2 重组DNA技术的基本步骤n（1）目的基因的获得n（2）目的基因与载体的连接n（3）重组DNA分子导入受体细胞n（4）筛选出含重组DNA的受体细胞n（5）克隆基因的表达以及表达产物的检测和分离

4、纯化3重组DNA技术的意义n填平了生物种属间不可逾越的鸿沟。n缩短了生物进化的时间n使人们能够对生物进行定向改造重组DNA技术潜在的危机转基因生物及转基因食品之弊转基因生物及转基因食品之弊对人、动物、植物，微生物对人、动物、植物，微生物 潜在危害的潜在危害的不确定性不确定性例如：例如：将土壤细菌的一个抗虫害的一个基因转移到将土壤细菌的一个抗虫害的一个基因转移到玉米中后，可抗一种螟蛉的侵害。当转基因玉米的玉米中后，可抗一种螟蛉的侵害。当转基因玉米的花粉落到临近的乳草植物的花上，王蝶在采集该花花粉落到临近的乳草植物的花上，王蝶在采集该花之后而导致其幼虫的死亡增加了七倍。之后而导致其幼虫的死亡增加了

5、七倍。但是：但是：农药的使用不仅成百倍地杀死农药的使用不仅成百倍地杀死非有害非有害昆虫，昆虫，而且导致了更多的具有而且导致了更多的具有抗药性抗药性的害虫的扩增。的害虫的扩增。对人、动物、植物，微生物对人、动物、植物，微生物 潜在危害的潜在危害的不确定性不确定性例如：例如：在在2002年年3月月8日，美国联邦法官判定一个日，美国联邦法官判定一个 9百万美元的赔偿，因为一消费者对于在百万美元的赔偿，因为一消费者对于在 超市上买的转基因玉米食品产生了超市上买的转基因玉米食品产生了过敏反应过敏反应， 尽管，该玉米食品已被美国环境保护署批准尽管，该玉米食品已被美国环境保护署批准 只能兽用而不能人用。只能

6、兽用而不能人用。但是：许多研究证明，但是：许多研究证明，对于过敏群体，对于过敏群体，天然抗原天然抗原， 例如蛋，奶，例如蛋，奶， 植物蛋白，远远超过转基因植物蛋白，远远超过转基因 食品的蛋白食品的蛋白 潜在过敏原造成的伤害和影响。潜在过敏原造成的伤害和影响。从事转基因作物农业的人员的职业健康风险从事转基因作物农业的人员的职业健康风险要远远底于从事传统农业，手工业，烧烤业，要远远底于从事传统农业，手工业，烧烤业，废品分类业人员的健康风险。废品分类业人员的健康风险。对人、动物、植物，微生物对人、动物、植物，微生物 潜在危害的潜在危害的不确定性不确定性转基因蛋白对哺乳动物有毒性吗？转基因蛋白对哺乳动

7、物有毒性吗？在转基因和非转基因作物的未加工和加工的食品在转基因和非转基因作物的未加工和加工的食品之间没有发现在毒性上的差异之间没有发现在毒性上的差异。对生态和环境对生态和环境 潜在危害的潜在危害的不确定性：不确定性：转基因生物转基因生物的的外源基因外源基因能转移到食物链中的其它生物体内吗？能转移到食物链中的其它生物体内吗？外源基因的外源基因的垂直转移垂直转移，例如，从微生物到植物，例如，从微生物到植物，从微生物到动物，从微生物到人体，在从微生物到动物，从微生物到人体，在去掉载体去掉载体和标记和标记的的条件下，少到的的条件下，少到难以检测难以检测出来。出来。外源基因的外源基因的水平转移水平转移时

8、而发生，例如，时而发生，例如，带有带有抗除草剂基抗除草剂基因因的转基因小麦和转基因谷子自发地将该基因转移到有一的转基因小麦和转基因谷子自发地将该基因转移到有一定关系的野草中，使得该野草有了抗除草剂的性能。定关系的野草中，使得该野草有了抗除草剂的性能。然而，然而，在自然界在自然界，这种外源基因的，这种外源基因的水平转移水平转移以前发生过，以前发生过，现在正在发生，以后还要发生。现在正在发生，以后还要发生。转基因生物及其转基因食品对人体、动物，生态、转基因生物及其转基因食品对人体、动物，生态、环境的环境的长期影响尚未确定。长期影响尚未确定。然而，现在使用的农药、除草剂等对然而，现在使用的农药、除草

9、剂等对人体、动物，人体、动物，生态、环境的生态、环境的有害影响已经确定。有害影响已经确定。城市的增加和扩大，江河的拦截，核能的利用等城市的增加和扩大，江河的拦截，核能的利用等对对生态和环境的生态和环境的负面影响已经确定负面影响已经确定。 为什么人们为什么人们接受接受已被确认有已被确认有危害的事物危害的事物，却却不接受不接受其其危害尚未确定的事物危害尚未确定的事物那？那？ 因为，人们有因为，人们有怀疑怀疑和和惧怕惧怕新生事物新生事物的天的天性。性。 在人类的科学发展史上，没有一个重大在人类的科学发展史上，没有一个重大的的科技进展科技进展在开始阶段没被在开始阶段没被怀疑怀疑和和否定否定的。的。结论

10、结论 任何一项科学技术的出现，若不加控制，任其滥用，任何一项科学技术的出现，若不加控制，任其滥用，肯定会给人类带来灾难，用于生产转基因食品的肯定会给人类带来灾难，用于生产转基因食品的基基因重组技术（基因工程）因重组技术（基因工程）也不例外。也不例外。 在整个社会的监督下、在政府的管理和协调下、在在整个社会的监督下、在政府的管理和协调下、在科学工作者的努力下，科学工作者的努力下，转基因食品转基因食品给人类带来的给人类带来的利利大大超过其带来的大大超过其带来的敝敝。 政府和相关科学工作者有责任客观地将转基因食品政府和相关科学工作者有责任客观地将转基因食品的真实情况告诉广大消费者，消费者有权知道在市

11、的真实情况告诉广大消费者，消费者有权知道在市场上，那种食品是转基因食品，那种不是转基因食场上，那种食品是转基因食品，那种不是转基因食品。品。 消费者有消费者有知情权知情权和和最终选择权最终选择权。重要的工具酶-内切酶n1 限制性内切酶n定义：是一类能够识别和切割双链DNA分子中特定碱基顺序的核酸水解酶。n命名：第1字母（大写）产生该酶细菌的属名的第一字母；第2、3字母（小写）细菌的种名；第4字母（大写）细菌菌株名；最后是罗马数字，代表该菌株中发现的第几个酶。nEcoRI，EcoRVnBamHI，HinFI2 功能n严格识别切割顺序，识别点多为回文结构，识别长度4-8bp，以6bp最常见。n切口

12、2种n（1）平末端 5GGCC 3 5GG CC 3 3CCGG 5 5CC GG 5n（2）粘末端n 5GGATCC 3 5G GATCC 3n 3CCTAGG 5 3CCTAG G 5n异源同工酶（同裂酶）不同来源的内切酶，但有相同的识别位点，其切割位点可以一样或不同。n同尾酶：识别序列相关，切割后粘性末端相同。n远距离裂解酶：识别位点与切割位点不一致。识别位点切割位点n可变酶：识别位点中个别碱基可以变化，要求不特定。nSinInGG（A/T）CCnCC（T/A）GG3 DNA的甲基化作用n细菌体内存在限制和修饰系统（R-M）n对自身的DNA甲基化修饰，免受内切酶降解。n对外来的DNA通过

13、限制性内切酶降解。n应用：n应用甲基化处理保护免受限制性内切酶降解n如：PstI和甲基化PstI的切割点相同，但切割的对象不同，结果不同。4 内切酶的使用注意事项n用途nDNA重组克隆及亚克隆nDNA杂交与序列分析n改建质粒n构件基因组DNA物理图谱和文库n使用注意n保存-20-80冰箱n酶量不超过反应体系的10%n两个酶同时切割时注意反应缓冲液条件，差距大时，分步酶切，步间要纯化。DNA聚合酶n1 大肠杆菌DNA聚合酶I及其大片段（Klenow片段）35KD 76KD枯草蛋白酶水解枯草蛋白酶水解Klenow片段片段n大肠杆菌DNA聚合酶I的酶活性n5-3DNA聚合酶活性n3-5外切酶活性n5

14、-3外切酶活性nKlenow片段的酶活性n5-3DNA聚合酶活性n3-5外切酶活性主要用途n催化DNA切口平移反应，准备高比活DNA探针对DNA进行末端标记（仅限于Klenow）n2 Taq酶n是一类耐热的DNA聚合酶。n5-3聚合酶活性n具有5-3外切酶活性n多数Taq酶缺乏3-5外切酶活性，但进行荧光定量PCR时，所用Taq酶具备3-5外切酶活性n3 反转录酶（逆转录酶）n催化以RNA为模板的DNA聚合反应n以mRNA为模板，催化合成出互补的DNA，称为cDNA n具有5-3的聚合酶活性n缺乏3-5外切酶活性，故它无校对功能，错配率较高。mRNADNA逆转录过程常见的逆转录酶常见的逆转录酶

15、nAMV 禽病毒来源 反应温度42 n 用量2-8单位/反应 nMMLV 鼠来源病毒 反应温度38 n 用量100-300单位/反应n4 末端脱氧核糖核酸转移酶n活性：催化dNTP加到3羟基末端n用途：制造人工粘端n 进行末端标记DNA连接酶n作用：将两段DNA连接起来n种类：T4/T4（噬菌体来源）连接酶n 大肠杆菌DNA连接酶 n注意：连接DNA片段是否粘端n ATP活性n PEG和BSA合理添加n 反应温度和时间碱性磷酸酶n作用：去除5磷酸基团，防止自身连接。n种类：BAP细菌性碱性磷酸酶n CIP小牛肠碱性磷酸酶n用途：基因克隆中防止自身连接n 某些5端标记前除取5磷酸基团目的基因获得

16、n目的基因目的基因：要进行研究或应用的基因n目的基因的用途目的基因的用途1.研究该基因的结构、功能及其调控2.与正常基因对比，寻找基因变异点3.研究生物种系进化与同源性关系4.生产所需要的蛋白或多肽5.改造目的基因，以改良品种6.建立基因疗法目的基因获得方法一、构建一、构建cDNAcDNA文库筛选目的基因文库筛选目的基因二、构建真核细胞基因组文库筛选目的基因二、构建真核细胞基因组文库筛选目的基因三、人工合成目的基因三、人工合成目的基因DNADNA四、聚合酶链反应合成目的基因四、聚合酶链反应合成目的基因五、其他方法五、其他方法n构建差示文库筛选特殊基因nmRNA差示显示法获得目的基因一、构建cD

17、NA文库筛选目的基因n基因文库：是将某种生物基因组DNA切割成一定大小的片段，然后分别与合适的载体重组后导入宿主细胞，这些重组子插入的片段的总和可代表该种生物的全部基因组。ncDNA文库：是将某种生物所有mRNA逆转成cDNA，再将这些cDNA与合适的载体重组后导入宿主细胞，这一组重组子带有该种生物的所有蛋白的编码基因。基因组文库构建基因组文库构建一、构建cDNA文库筛选目的基因（一）真核细胞mRNA的分离n提取细胞RNAn分离纯化mRNA（二）反转录合成cDNA（三）构建cDNA文库ncDNA两端加接头ncDNA与载体连接n导入宿主细胞（四）筛选目的基因n核酸杂交法n免疫结合法二 构建真核细胞基因组文库筛选目的基因n（一）分离纯化基因组DNA，切割n（二）DNA片段与载体连接n（三）导入细胞n（四）筛选目的基因n缺点：基因中包含内含子三、人工合成目的基因三、人工合成目的基因DNADNAn全自动基因合成仪合成n优点：方便、快捷n缺点：价格昂贵n目前国内合成商n上海生工公司n大连