GB坂崎肠杆菌检验实用教案

1、 本标准与GB/T 4789.40-2008 相比，主要变化如下： 修改了标准的中英文名称； 删除(shnch)了附录A 中。第1页/共36页第一页，共37页。 Enterobacter sakazakii(ES)Enterobacter sakazakii(ES)2第2页/共36页第二页，共37页。内容第一部分：一般特征(tzhng)(tzhng)第二部分：流行病学特征(tzhng)(tzhng)第三部分：ESES的检验3第3页/共36页第三页，共37页。第一(dy)(dy)部分：一般特征命名( (m mn ng g m mn ng)g)培养特征生化反应抵抗力增殖能力致病性4第4页/共36页

2、第四页，共37页。 1980 1980年之前(zhqin)(zhqin)一直被称为黄色阴沟肠杆菌。DNA-DNADNA-DNA杂交生化反应黄色素抗生素敏感性 5一、命名(mng mng)第5页/共36页第五页，共37页。二、培养(piyng)(piyng)特征G G无芽孢杆菌，兼性厌氧，在6 6- -4 47 7范围内均可生长，适温3 35 5- -3 37 7营养要求不高： V VR RB BG GA A、T TS SA A、N NA A、M MA AC C、E EM MB B、其他( (q qt t)与其他( (q qt t)常见肠杆菌相似6第6页/共36页第六页，共37页。三、生化(sh

3、n(shn hu) hu)反应 生化反应结果D-山梨醇-产生吐温80脂酶+细胞外Dnase+氧化酶试验-黄色菌落 +-葡萄糖苷酶 +7第7页/共36页第七页，共37页。8ES及亲缘关系较近的肠杆菌生化反应比较试验生化反应1阪崎肠杆菌阴沟肠杆菌产气肠杆菌成团肠杆菌日勾维肠杆菌赖氨酸脱羧酶精氨酸双水解酶鸟氨酸脱羧酶KCN生长v发酵:蔗糖()卫矛醇()()核糖醇()棉子糖vD-山梨醇v-甲基-葡萄糖甙()D-阿拉伯糖醇()黄色素()注： ：90-100；() ：75-89%； V ：25-74；()：10 -24； ：0-9第8页/共36页第八页，共37页。第三(d sn)部分食品卫生微生物学检验食

4、品卫生微生物学检验(jinyn)阪崎肠杆菌检验阪崎肠杆菌检验(jinyn)第9页/共36页第九页，共37页。主要(zhyo)(zhyo)内容一、制订(zhdng)(zhdng)的主要依据二、食品卫生微生物学检验 阪崎肠杆菌检验10第10页/共36页第十页，共37页。制订的主要(zhyo)依据ISO 2006年“乳和乳制品中阪崎肠杆菌的检测(jin c)”（Milk and milk productsDetection of Enterobacter sakazakii）方法；美国FDA 2002年颁布的“婴儿配方粉中阪崎肠杆菌的分离和计数”（Isolation and Enumeration

5、of Enterobacter sakazakii from Dehydrated Powdered Infant Formula）方法；2004年荷兰乳及乳制品控制中心对各种阪崎肠杆菌检测(jin c)方法的比较研究；雀巢研究中心2005年环境样品中阪崎肠杆菌快速检测(jin c)方法；阪崎肠杆菌快速检测(jin c)培养基DFI研究资料。第11页/共36页第十一页，共37页。 SN第一部分：分离与计数方法 第二部分：PCR方法 第三(d sn)部分：荧光PCR方法第12页/共36页第十二页，共37页。常见(chn(chn jin) jin)选择性培养基 DFI (Oxoid, UK)DFI

6、 (Oxoid, UK) ESIA (AES, France)ESIA (AES, France) R RF F（R&F LaboratoriesR&F Laboratories，SwitzerlandSwitzerland） OK mediumOK medium 其他：国内阪崎肠杆菌(gnjn)(gnjn)显色培养基、CES (Merck, Germany)CES (Merck, Germany)，NA+ NA+ -MUG-MUG13第13页/共36页第十三页，共37页。显色(xin s)(xin s)培养基的特点 -葡萄糖苷酶活性指示剂：5-溴-4-氯-3-吲哚(yn du)- ，D-吡喃

7、葡糖甙（X Glc）4-甲基伞形酮- -D-葡糖苷（ -MUG）4-邻硝基苯- -D-吡喃葡糖甙 14第14页/共36页第十四页，共37页。15第15页/共36页第十五页，共37页。选择选择(xunz)(xunz)性培养基的选择性培养基的选择(xunz)(xunz)1. FDA1. FDA方法使用方法使用VRBGAVRBGA，ISO ISO 方法中使用方法中使用ESIAESIA，本方法中我们选用本方法中我们选用(xunyng)DFI(xunyng)DFI。和和DFIDFI的基本原理相似，二者都是根据的基本原理相似，二者都是根据ESES能产生能产生-葡萄糖苷酶，分解底物葡萄糖苷酶，分解底物XaG

8、lcXaGlc产生有色菌落。产生有色菌落。对对ESES的选择性差，的选择性差，ESES、阴沟肠杆菌和成团肠杆菌、阴沟肠杆菌和成团肠杆菌等多种肠道菌都可以在该平板上生长并产生粉紫等多种肠道菌都可以在该平板上生长并产生粉紫色菌落，胆汁酸沉淀形成紫色晕圈。色菌落，胆汁酸沉淀形成紫色晕圈。即：不能观察到即：不能观察到ESES的特征性菌落。的特征性菌落。16第16页/共36页第十六页，共37页。2022-5-18显色培养基的选择性较好显色培养基的选择性较好DFIDFI对对ESES的选择性较好，的选择性较好，ESES形成的蓝绿色特征性菌落易形成的蓝绿色特征性菌落易于辨认，而且：于辨认，而且：硫化氢指示剂可

9、以区分硫化氢指示剂可以区分ESES和产生少量和产生少量-葡萄糖苷酶但葡萄糖苷酶但H2SH2S阳性菌株（如普通变形杆菌）。阳性菌株（如普通变形杆菌）。ESES都可以在都可以在DFIDFI平板上生长并产生蓝绿色菌落平板上生长并产生蓝绿色菌落其他常见菌在其他常见菌在DFIDFI平板的菌落颜色平板的菌落颜色(yns)(yns)白色菌落：肺炎克雷伯氏菌、阴沟肠杆菌、大肠埃希氏白色菌落：肺炎克雷伯氏菌、阴沟肠杆菌、大肠埃希氏菌、泛菌属的多种菌等菌、泛菌属的多种菌等黄色菌落：赫氏埃希氏菌黄色菌落：赫氏埃希氏菌黑褐色、粉色或中心蓝绿菌落：少量菌种黑褐色、粉色或中心蓝绿菌落：少量菌种ESIA:ESIA:蓝色，蓝

10、色，1-3mm1-3mm17第17页/共36页第十七页，共37页。2022-5-18选择选择(xunz)性增菌肉汤的选择性增菌肉汤的选择(xunz) FDAFDA方法选择方法选择EEEE肉汤，肉汤，ISOISO方法选择方法选择mLST-VmmLST-Vm，即在，即在LSTLST中加入中加入NaclNacl和和VmVm。本标准使用。本标准使用mLST-VmmLST-Vm。 EEEE肉汤适合所有肠道菌群的生长繁殖，这就可能对肉汤适合所有肠道菌群的生长繁殖，这就可能对ESES的生长产生竞的生长产生竞争性抑制作用，降低检出率。争性抑制作用，降低检出率。 研究证明与其他肠杆菌科细菌（如沙门氏菌，大肠埃希

11、氏菌等）相比，研究证明与其他肠杆菌科细菌（如沙门氏菌，大肠埃希氏菌等）相比，ESES具有较高的耐渗透压能力。加入的具有较高的耐渗透压能力。加入的NaclNacl在保证在保证ESES良好良好(lingho)(lingho)生长的同时，可以有效地抑制上述其他细菌的生长。生长的同时，可以有效地抑制上述其他细菌的生长。 VmVm可有效地抑制可有效地抑制G+G+菌的生长。而较高的生长温度可以进一步抑制其菌的生长。而较高的生长温度可以进一步抑制其他细菌的生长。他细菌的生长。第18页/共36页第十八页，共37页。二、食品卫生微生物学检验(jinyn)(jinyn)阪崎肠杆菌检验(jinyn)(jinyn)1

12、9第19页/共36页第十九页，共37页。本标准(biozhn)(biozhn)修改采用ISO/TS 22964 （ 1st edition 2006-02-01 ）Milk and milk products Detection of Enterobacter sakazakiiFDA July 2002; Revised August 2002 Isolation and Enumeration of Enterobacter sakazakii from Dehydrated Powdered Infant Formula 20第20页/共36页第二十页，共37页。第一法：阪崎肠杆菌(gn

13、jn)(gnjn)的检验第二法：阪崎肠杆菌(gnjn)(gnjn)的计数21第21页/共36页第二十一页，共37页。第一法 阪崎肠杆菌(gnjn)(gnjn)的检验22第22页/共36页第二十二页，共37页。阪崎肠杆菌检验(jinyn)程序 报 告TSA251，48h4h生化鉴定挑取黄色菌落DFI琼脂361，24 h2h挑取蓝绿色菌落1mL + mLST-Vm 10mL440.5，24 h2h检样100 g（mL）+BPW稀释液 900 mL361，18 h2h前增菌选 择 性 增 菌选择性分离( f n l )生化(shn h u ) 鉴 定100 g（ mL ）第23页/共36页第二十三页

14、，共37页。5.1 5.1 前增菌和增菌 左图：未混合左图：未混合(hnh)(hnh)； 右图：右图：混合混合(hnh)(hnh)后。后。24加样入已预热(y r)到44的BP中第24页/共36页第二十四页，共37页。5.2 分离(fnl)DFIDFI36361124 h24 h2h2h25第25页/共36页第二十五页，共37页。TSATSA： 25 25 培养后培养后典型典型ESES：黄色：黄色阴性对照阴性对照E. coli ATCC 25922E. coli ATCC 25922：白色：白色(bis)(bis)菌落菌落26黄色素第26页/共36页第二十六页，共37页。5.3 鉴定(jind

15、ng)（生化反应）27生化试验特征黄色素产生氧化酶L-赖氨酸脱羧酶L-鸟氨酸脱羧酶（）L-精氨酸双水解酶柠檬酸水解()发酵：D-山梨醇（）L-鼠李糖D-蔗糖D-蜜二糖苦杏仁甙注：99%阳性；99%阴性；（）90%99%阳性；（）90%-99%阴性。第27页/共36页第二十七页，共37页。商业生化鉴定(jindng)(jindng)系统的应用 推荐使用的ESES生化鉴定方法有很多，主要有API API 20E20E，ID 32EID 32E，Biolog GN2 MicroPlateBiolog GN2 MicroPlate，VITEK VITEK GNI+GNI+等。 上述方法都比较成熟，稳定

16、性较好，已被许多国家和组织的标准(biozhn)(biozhn)采用。 在肠杆菌的生化鉴定中使用最广泛的是API 20EAPI 20E和Vitek GNI+Vitek GNI+。28第28页/共36页第二十八页，共37页。API 20EAPI 20E生化(shn(shn hu) hu)鉴定板典型生化(shn(shn hu) hu)反应图示 API 20E反应编码API 20E结果评价3345 373Excellent identification3305 173Excellent identification3305 363Very good identification3305 373Goo

17、d identification29第29页/共36页第二十九页，共37页。VITEK-GNI+VITEK-GNI+30第30页/共36页第三十页，共37页。质量(zhling)(zhling)控制 选择标准菌株作为阳性对照，检测增菌液和分离培养基对阪崎肠杆菌生长的影响和生化鉴定结果，对整个实验(shyn)的操作过程进行质量控制。31第31页/共36页第三十一页，共37页。第二(d r)(d r)法 阪崎肠杆菌的计数32第32页/共36页第三十二页，共37页。3 3管MPNMPN法33第33页/共36页第三十三页，共37页。2022-5-18SN标准(biozhn)第34页/共36页第三十四页，共37页。谢谢(xi xie)大家！第35页/共36页第三十五页，共37页