GenProbe结核分支杆菌检测仪介绍Bruce实用教案

1、样本显微镜 (Ziehl.)敏感性低敏感性高2 到8 周改良罗氏培养基 Coletsos液态培养基(MGIT, Bactec, BacT Alert.)生化检测实验条件苛刻, 需数天(Reference center)目视检测准确低MTD2.5小时敏感性高 特异性强Accuprobe 1 小时简单- 准确第1页/共22页第一页，共23页。Gen-Probe检测(jin c)分枝杆菌试剂类型 扩增+杂交检测结核分枝杆菌复合菌: AMPLIFIED MTD ( Gen-Probe) 临床痰标本(涂阳或涂阴) 杂交检测分枝杆菌: ACCUPROBE Gen-Probe 培养阳性(yngxng)标本

2、(菌落或肉汤)第2页/共22页第二页，共23页。MTD (AMPLIFIED Mycobacterium Tuberculosis Direct) 检测(jin c)第3页/共22页第三页，共23页。Gen-Probe MTD检测(jin c)4以16S rRNA 为靶核酸(h sun)4TMA ：转录介导扩增4 HPA：杂交保护分析第4页/共22页第四页，共23页。RNA与 DNA DNA非常稳定，在死亡生物内也可存在双链结构 RNA只存在于活细胞非常脆弱(curu) (RNA容易受破坏)单链结构第5页/共22页第五页，共23页。结核菌核酸(h sun)RNA是DNA的4-5倍rRNA占80

3、%第6页/共22页第六页，共23页。Gen-Probe 扩增第7页/共22页第七页，共23页。超声波裂解(li ji)样品(yngpn)细胞(xbo)溶解目标 rRNA 释放第8页/共22页第八页，共23页。TMA转录(zhun l)介导扩增 2条引物： 2种酶： *逆转录酶(双功能(gngnng):逆转录和RNAse H酶) (RNAse H：一种核糖核酸内切酶，特异性水解DNA：RNA杂交链上RNA链的磷酸二酯键，产生5核苷酸，该酶对单链核酸、双链DNA或双链RNA没有作用) *RNA聚合酶 等温扩增：42第9页/共22页第九页，共23页。RTRTRTRNA 合成酶RTRTTMA原理原理(

4、yunl)第10页/共22页第十页，共23页。10 000 拷贝(kobi)rRNACA TATA TG CG CA TT AA TCGT AG CG CG CA TATG CT AC GT ADNA第11页/共22页第十一页，共23页。扩增产物检测(jin c)：HPA技术 HPA：杂交保护分析技术 标记丫啶酯（Acridinium ester）的DNA 探针(tn zhn)与 RNA 扩增产物杂交，形成DNA：RNA双螺旋结构保护荧光物丫啶酯不被选择试剂淬灭（水解）。AE第12页/共22页第十二页，共23页。HPA 步骤(bzhu)第13页/共22页第十三页，共23页。杂 交AE杂交(zj

5、io)rRNA探针(tn zhn)AEAEAEAEAEAEAE第14页/共22页第十四页，共23页。杂交温度(wnd)的影响AEAEAE第15页/共22页第十五页，共23页。选 择AEAEAEAEAEAEAEAE第16页/共22页第十六页，共23页。CH3N+OORH2O2 / OH-light检 测第17页/共22页第十七页，共23页。化学发光10-19 mole辐射(fsh)同位素 10-18 mole荧光 10-12 mole比色 10-9 mole第18页/共22页第十八页，共23页。总 结 靶核酸: rRNA 等温扩增，2种酶是关键（逆转录酶(RNAse H)、RNA 聚合酶） 扩增

6、原理：TMA（转录介导扩增） 液相杂交：HPA（杂交保护分析） 化学发光法：检测(jin c)杂交信号第19页/共22页第十九页，共23页。STEP1：标本预处理 超声波降解标本STEP2：扩增 (TMA) 扩增试剂, 石腊油，经过预处理的标本-消化(xiohu) 95 , 15 分钟，水浴 42 , 5 分钟-加入酶试剂，扩增 42 , 30 分钟STEP3：探测 ( HPA) 加入探针试剂-杂交 60, 15 分钟-选择 60 , 15 分钟-在发光仪读数第20页/共22页第二十页，共23页。第21页/共22页第二十一页，共23页。谢谢您的观看(gunkn)！第22页/共22页第二十二页，共23页。NoImage内容(nirng)总结样本。分枝杆菌 :用Gen-Probe 产品检测程序和时间。使用生化水解方法，分离杂交及未杂交探针。检测：化学发光检测。第15页/共22页。等温扩增，2种酶是关键（逆转录(zhun l)酶(RNA