GBS核酸检测复习进程

1、GBS核酸检测GBSGBS概述概述GBS对新生儿的影响对新生儿的影响GBS感染是新生儿感染的主要原因感染是新生儿感染的主要原因早发型感染早发型感染 n多见于出生后1周内。n母婴垂直传播是其主要传播途径。n主要临床表现为败血症（80%）、肺炎（7%）、脑膜炎（6%）；若治疗不及时，可引发远期后遗症，如智力发育迟缓、视觉听觉丧失等。 晚发型感染晚发型感染n 多发生于出生1周后。n 主要为水平传播：可能与院内感染或家庭接触有关。n 常呈隐匿性发病，其特征表现为脑膜炎；1/3的晚发型疾病出现脑膜炎，故这些生存下来的新生儿中更易发生神经系统后遗症。GBS的传播与感染的传播与感染感染感染GBS产妇产妇 未

2、传染给新生儿未传染给新生儿3060%传染给新生儿传染给新生儿40%70%无症状无症状97%早发性疾病：败血症，肺炎早发性疾病：败血症，肺炎或脑膜炎或脑膜炎1%3%5%会导致死亡会导致死亡国内外国内外GBS筛查现状筛查现状美国疾病控制中心(CDC) 制定了围产期GBS预防指南该指南已经获得以下认可：p美国妇产科学院p美国儿科学会p美国护士助产士协会p美国家庭医生协会p美国微生物学会p美国流行病学会p美国药理学会在我国，2011年，中华医学会妇产科学分会产科学组在孕前和孕期保健指南(第1版)中已将B族链球菌筛查作为一个备查项目。围产期围产期GBS预防指南预防指南指出指出对所有孕妇于妊娠3537 周

3、进行GBS筛查，结果阳性者进行预防性治疗以下情况应进行预防性治疗 ：p本次妊娠有GBS 菌尿p上次新生儿GBS 感染史p 在妊娠37 周之前分娩p 破膜时间超过18小时p 分娩体温超过38.0度GBS的筛查与预防的筛查与预防阳性(+)或产时高危因素：早产，产时发热38 ，胎膜早破18小时不需要抗生素预防孕35-37周取阴道和直肠拭子作GBS检测阳性(+)抗生素预防未检测阴性()临产后GBS检测阴性( )且无产时高危因素抗生素预防预防预防GBS疾病的抗生素使用方案举例疾病的抗生素使用方案举例:围产期GBS预防指南指出： GBS阳性患者应用抗生素进行预防性治疗阳性患者应用抗生素进行预防性治疗Boy

4、er在1989年研究中指出，产时氨苄青霉素使用超过1小时就可以使得新生儿感染从28%减少到4%。LIN在2001年的研究中表明，与无产时应用抗生素相比，抗生素预防超过2小时的有效率是89%，不足2小时的有效率为71%。挑战：我妈妈会进行IAP治疗吗？有无青霉素过敏否是青霉素G，首次剂量500万单位（静脉注射）然后每4小时250300万单位，直至分娩或者氨苄青霉素，首次剂量2g（静脉注射），然后每4个小时1g，直到分娩病人在接受青霉素或头孢菌素时有无出现下列任一症状？过敏症、血管性水肿、呼吸窘迫、荨麻疹否是头孢唑啉，首次剂量2G，然后每8个小时1g，直到分娩红霉素和克林霉素治疗是否有效否是万古霉

5、素每12小时1g（静脉注射）直至分娩克林霉素每8小时900mg（静脉注射）直至分娩围产期围产期GBS预防指南预防指南GBS检测方法比较检测方法比较PCRPCR介绍介绍聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)，简称PCR，是一种分子生物学技术，用于放大扩增特定的DNA片段；可看作生物体外的特殊DNA复制。 什么是什么是PCRPCR PCRPCR原理原理PCR一般由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成：DNADNA变性变性：（90-96）：双链DNA模板在热作用下，氢键断裂，形成单链DNA 。退火退火 ：（25-65）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链。

6、 延伸延伸：（70-75）：在Taq酶的作用下，以dNTP为原料，从引物的3端5端延伸，合成与模板互补的DNA链。 每一循环经过变性、退火和延伸，DNA含量即增加一倍;23小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。 PCR原理原理变性，退火，延伸一次循环二次循环三次循环PCRPCR反应体系反应体系PCR反应体系中的主要试剂有： PCRPCR扩增仪扩增仪 PCR温度循环至关重要，PCR扩增仪各参数必须准确。 现已有几十家不同的厂家在国内外生产和销售PCR扩增仪。国外厂家：Bio-Rad，ABI, Roche 国内厂家：杭州朗基 ，杭州博日PCRPCR反应特点反应特点特异性强特异性强：引物与模板DN

7、A特异正确结合 ，碱基配对原则 ，Taq DNA聚合酶忠实性扩增灵敏度高灵敏度高 ：PCR产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克(pg=10-12）量级的起始待测模板扩增到微克（g=10-6）水平 简便快速简便快速：一般在14 小时完成扩增反应 模板纯度要求低模板纯度要求低 ：不需要分离病毒/细菌/培养细胞，DNA 粗制品及RNA均可作为扩增模板 1. 每扩增一条DNA链，就切断一个探针2. 每切断一个探针，就产生一个单位荧光信号3. 荧光信号强度与结合探针的DNA分子数成正比实时荧光PCR技术：是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的积累实时监测整个PCR进程，最后通过扩增曲线对

8、模板进行分析的方法。 GBSGBS核酸检测产品核酸检测产品荧光PCR检测B族链球菌（GBS） B B族链球菌族链球菌(GBS)(GBS)核酸检测试剂盒核酸检测试剂盒(PCR-(PCR-荧光探针法荧光探针法) ) Taqman 探针实时PCR技术 选择B族链球菌基因组特异且无高频SNP位点的序列区域cAMP因子，设计特异性引物和探针 内参照系统排除PCR反应过程中可能的假阴性结果 UNG酶避免扩增污染物造成的假阳性 适用仪器：Roche LightCycler 480，ABI 7500，Bioer Line-Gene K等多色荧光PCR仪产品特点产品特点规格：20人份/盒有效期：18 以下避光保

9、存6个月试剂：DNA提取液、GBS PCR反应液、GBS阳性对照品，空白对照品标本类型：生殖道/直肠等部位带上皮细胞的分泌物标本试剂盒介绍试剂盒介绍 溶血样本、保妇康栓、皮炎平对检测结果有显著影响，应尽量避免这些样本的检测。 其他常见干扰物质（粘液和脓液）以及常用药物（青霉素G、阿奇霉素、强力霉素及氧氟沙星、聚甲酚磺醛溶液、洁尔阴洗液、黄硝呋太尔制霉素阴道软胶囊、肛泰软膏、开塞露）均无明显影响。待测样本在2-8保存不应超过24小时；-18以下保存不超过4天。标本要求标本要求标本标本保存保存检测流程（检测流程（ 2 h ）35 min5 min1h 10minn PCR扩增n 结果分析n 分装G

10、BS PCR反应液n 加DNA模板PCR反应体系配制PCR扩增及结果分析DNA 提取n 标本n GBS阳性对照品n 空白对照品DNA提取提取1mL标本沉淀+1mL生理盐水沉淀+ 50L DNA提取液99-100 加热10min取上清至1.5mL离心管中保存13,000 rpm 10 min13,000 rpm 5 min13,000 rpm 10 min标本，GBS阳性对照品，空白对照品均需要提取DNA。PCR体系配制体系配制40 L 体系：35 L PCR反应液 + 5 L DNA模板PCR扩增扩增程序： 50 2min 95 5min（ 95 15s60 35s ）45 cycles实时监

11、测PCR扩增过程FAM 通道 HEX通道 FAM通道检测结果：分析样本，空白对照品： Ct值不显示；阳性对照品： Ct30.00； HEX通道检测结果： 分析内参照基因，Ct35.00 阴性阴性：样品的FAM通道无Ct值显示, HEX通道Ct35.00 阳性阳性： 样品的FAM通道 Ct38.00， HEX通道Ct35.00备注备注：若样品的FAM通道 38.00Ct45.00，建议重新检测该样本， 若重检结果仍为38.00Ct45.00或Ct38.00，判定为阳性阳性； 若Ct不显示且HEX通道Ct35.00，判定为阴性阴性。结果有效性判定结果有效性判定结果分析结果分析以上要求需在同一次实验中同时满足以上要求需在同一次实验中同时满足产品优势一产品优势一 灵敏度高：灵敏度高：采用PCR方法检测DNA，试剂与国际领先试剂性能相同 特异性强：特异性强：不与临床常见其它各类病原体产生交叉反应 稳定性好：稳定性好：样本DNA提取质量高，阳性对照品、空白对照品内参基因扩增曲线高度吻合，试剂稳定 无污染：无污染：全封闭PCR体系，避免实验室其它PCR产物污染 易操作：易操作：操作简便，采用预制PCR反应液，无需额外加入内参照基因、酶等 速度快：速度快：检测周期短，从核酸提取到PCR结束实验过程不到2小时产品优势二产品优势二 公司GBS、 UU (解脲脲原体)