Co-Immunoprecipitation免疫共沉淀_第1页
Co-Immunoprecipitation免疫共沉淀_第2页
Co-Immunoprecipitation免疫共沉淀_第3页
Co-Immunoprecipitation免疫共沉淀_第4页
Co-Immunoprecipitation免疫共沉淀_第5页
已阅读5页，还剩8页未读， 继续免费阅读

下载本文档

版权说明：本文档由用户提供并上传，收益归属内容提供方，若内容存在侵权，请进行举报或认领

文档简介

1、Co-Immunoprecipitation 1、原理 2、操作 3、优点 4、局限性 5、应用1、原理免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation)是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质-蛋白质间的相互作用被保留了下来。当用预先固化在argarose beads上的蛋白质A的抗体免疫沉淀A蛋白，那么与A蛋白在体内结合的蛋白质B也能一起沉淀下来。再通过蛋白变性分离，对B蛋白进行检测，进而证明两者间的相互作用。这种方法常用于测定两种目标蛋白质

2、是否在体内结合;也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。2、操作（1）转染后24-48 h 可收获细胞，加入适量细胞裂解缓冲液（含蛋白酶抑制剂），冰上裂解30min, 细胞裂解液于4C， 最大转速离心30 min后取上清；（2）取少量裂解液以备Western blot分析，剩余裂解液加1g相应的抗体加入到细胞裂解液，4C缓慢摇晃孵育过夜；（3）取10l protein A 琼脂糖珠，用适量裂解缓冲液洗3 次，每次3,000 rpm离心3 min；（4）将预处理过的10l protein A 琼脂糖珠加入到和抗体孵育过夜的细胞裂解液中4C缓慢摇晃孵育2-4h，使抗体与protein A琼脂糖珠

3、偶连；（5）免疫沉淀反应后，在4C 以3000 rpm 速度离心3 min，将琼脂糖珠离心至管底；将上清小心吸去，琼脂糖珠用1ml裂解缓冲液洗34次；最后加入15l的2SDS上样缓冲液，沸水煮5分钟； （6）SDS-PAGE、 Western blotting或质谱仪分析。3、优点（1）与蛋白质亲和层析一样, 检测的产物是蛋白质的粗 提物；（2）抗原与相互作用的蛋白以细胞中相类似的浓度存在，避免了人为效应所造成的过量表达；（3）蛋白质以翻译后被修饰的天然状态存在；（4）复合物以天然状态存在，蛋白的相互作用可以在天然状态下进行，可以避免人为影响, 可以分离得到天然状态下相互作用的蛋白复合体。4、局限性（1）需要多克隆抗体或mAb，因而对大规模筛选未知蛋白会遇到障碍；（2）免疫共沉淀同样不能保证沉淀的蛋白复合物为直接相互作用的两种蛋白；（3）用于免疫共沉淀的抗体不总是与操作相合适，与 Western blotting或者ELISA相比容易出现假阳性反应；（4）灵敏度不如亲和色谱高。5、应用主要应用于肿瘤异质性研究、信号通路分子的研究、染色质免疫共沉淀(ChIP)技术 由于蛋白质间相互作用具有重大的意义，因此其检测方法的研究也备受重视。蛋

人人文库> 全部分类> 教育资料 > 辅导培训

温馨提示

  • 1. 本站所有资源如无特殊说明，都需要本地电脑安装OFFICE2007和PDF阅读器。图纸软件为CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.压缩文件请下载最新的WinRAR软件解压。
  • 2. 本站的文档不包含任何第三方提供的附件图纸等，如果需要附件，请联系上传者。文件的所有权益归上传用户所有。
  • 3. 本站RAR压缩包中若带图纸，网页内容里面会有图纸预览，若没有图纸预览就没有图纸。
  • 4. 未经权益所有人同意不得将文件中的内容挪作商业或盈利用途。
  • 5. 人人文库网仅提供信息存储空间，仅对用户上传内容的表现方式做保护处理，对用户上传分享的文档内容本身不做任何修改或编辑，并不能对任何下载内容负责。
  • 6. 下载文件中如有侵权或不适当内容，请与我们联系，我们立即纠正。
  • 7. 本站不保证下载资源的准确性、安全性和完整性, 同时也不承担用户因使用这些下载资源对自己和他人造成任何形式的伤害或损失。

最新文档

评论

0/150

提交评论