实验二酵母蔗糖酶ppt课件

1、实验二、酵母蔗糖酶的提取和实验二、酵母蔗糖酶的提取和酶活测定酶活测定实验目的实验目的n学习提取酵母蔗糖酶和测定酶活力的方法；n学习提取生物活性大分子的方法。实验资料实验资料n资料：活性干酵母粉、石英砂；n试剂：95冰乙醇、DNS液、PBSpH7.2、n 5蔗糖溶液、1N NaOH溶液；n仪器：水浴锅、高速冷冻离心机、722型分光 n 光度计。实验原理实验原理n蔗糖酶的提取过程和酶活的测定方法；n蛋白质等生物活性大分子的提取方法。自学提取工艺和酶活测定n蔗糖酶蔗糖酶n蔗糖酶的耐热温度为蔗糖酶的耐热温度为50度，度，45度以下可坚持酶活度以下可坚持酶活不变；在不变；在pH3.08.0范围内均可坚持

2、较高的酶活；范围内均可坚持较高的酶活；n蔗糖酶的活性中心有巯基，因此在提取时应防止其蔗糖酶的活性中心有巯基，因此在提取时应防止其被氧化，或者参与复原剂如被氧化，或者参与复原剂如Vc坚持酶活力；坚持酶活力；n酵母细胞存在两种蔗糖酶，一种在细胞壁中，一种酵母细胞存在两种蔗糖酶，一种在细胞壁中，一种在细胞质内，前者活力较高，分子量较大约在细胞质内，前者活力较高，分子量较大约270KDa，后者活力较低，分子量约为，后者活力较低，分子量约为KDa，两，两种酶的底物专注性和动力学性质非常类似，因此，种酶的底物专注性和动力学性质非常类似，因此，本实验未区分内酶与外酶。本实验未区分内酶与外酶。n提取工艺提取工

3、艺n1. 破碎酵母细胞的方法：破碎酵母细胞的方法：n 蔗糖酶分子量较大，普通采用研磨法彻底破蔗糖酶分子量较大，普通采用研磨法彻底破碎细胞使其释放出来，但应留意研磨过程中坚碎细胞使其释放出来，但应留意研磨过程中坚持低温防止酶失活；持低温防止酶失活；n 或者采用自溶法适当的酸度和温度下利用或者采用自溶法适当的酸度和温度下利用酵母菌本身的酶系破坏细胞壁，此方法较为酵母菌本身的酶系破坏细胞壁，此方法较为温暖，但是时间较长，需参与少量防腐剂，防温暖，但是时间较长，需参与少量防腐剂，防止过程中外界细菌污染；止过程中外界细菌污染；n 化学浸透法等较温暖的非机械法。化学浸透法等较温暖的非机械法。n 原那么：低

4、温，处置时间短，防止酶失活。原那么：低温，处置时间短，防止酶失活。2. 选择性热变性： 根据蔗糖酶的耐热性质，将热不稳定性杂蛋白变性除去， 而蔗糖酶坚持活性仍在上清液中；该法简便易行。原那么：1、选择适宜的温度和加热时间，防止目的物变性， 2、溶液的蛋白质浓度要适宜，防止蔗糖酶与杂蛋白共沉淀。3. 有机溶剂沉淀法： 根据蔗糖酶的分子量和亲水性，在溶液中参与一定量的无水乙醇溶 液，利用其脱水作用，破坏了蛋白质分子外表的水化膜，使蔗糖酶 聚集沉淀下来，而与其它杂质分开。普通采用分级沉淀法探求目的 物沉淀的条件。原那么：1、留意在低温下操作，故无水乙醇要预冷； 2、边加乙醇边搅拌溶液，防止部分乙醇过

5、浓，导致酶变性失活； 3、离心后应迅速将上清倒出，沉淀物用缓冲液溶解，防止酶与有 机溶剂长时间接触，防止其变性。n测定酶活的原理测定酶活的原理n蔗糖酶可作用于蔗糖酶可作用于1，2糖苷键，将蔗糖糖苷键，将蔗糖水解为水解为D葡萄糖和葡萄糖和D果糖；果糖； Cu2+ 、 Zn2+ 、 Fe2+ 是其激活剂，是其激活剂，Mn2+ 是其抑是其抑制剂。制剂。n葡萄糖和果糖具有复原性，在偏碱性条件葡萄糖和果糖具有复原性，在偏碱性条件下，可与下，可与3，5二硝基水杨酸共热后生成二硝基水杨酸共热后生成棕红色物质，在一定浓度范围内，复原糖棕红色物质，在一定浓度范围内，复原糖的量和反响液的颜色强度成正比例关系。的量

6、和反响液的颜色强度成正比例关系。n蔗糖酶的活力经过其水解生成的复原糖量蔗糖酶的活力经过其水解生成的复原糖量来反映。来反映。n n n提取酶本卷须知提取酶本卷须知n了解目的物的分子量、酸碱稳定性、热稳定性，了解目的物的分子量、酸碱稳定性、热稳定性，选择适宜的提取条件；选择适宜的提取条件；n提取过程中采用缓冲液系统溶解酶，并可添加提取过程中采用缓冲液系统溶解酶，并可添加一些维护剂如复原剂、金属螯合剂等；一些维护剂如复原剂、金属螯合剂等；n提取过程普通坚持低温、防止猛烈搅拌、强酸、提取过程普通坚持低温、防止猛烈搅拌、强酸、强碱等变性的要素；强碱等变性的要素；n普通先选择分辨率低处置量大的方法如萃取、

7、普通先选择分辨率低处置量大的方法如萃取、沉淀、吸附浓缩酶，再采用分辨率高的方法沉淀、吸附浓缩酶，再采用分辨率高的方法如离子交换层析、亲和层析、超滤精制；如离子交换层析、亲和层析、超滤精制；n经过酶活测定，调理提取条件。经过酶活测定，调理提取条件。生物活性大分子的提取方法自学书P3641实验步骤实验步骤n反复冻融法破碎酵母细胞反复冻融法破碎酵母细胞n 称取称取1g活性干酵母泥，活性干酵母泥，0.2g石英砂，置于预冷的研钵中，石英砂，置于预冷的研钵中，研磨至粉状，参与研磨至粉状，参与5mLPBSpH7.2，混合均匀，研磨，混合均匀，研磨5min ,20度冷冻，再研磨度冷冻，再研磨5min；n离心获

8、得粗酶液离心获得粗酶液n 汲取约汲取约4mL酵母细胞破碎液于离心管中，酵母细胞破碎液于离心管中，8000rpm 5min，保管上清液；保管上清液；粗酶液粗酶液n分别纯化获得纯酶液分别纯化获得纯酶液n汲取剩余的约汲取剩余的约2mL酵母细胞破碎液于离心管中，酵母细胞破碎液于离心管中，45度水浴度水浴10min，缓慢搅拌，迅速冰浴冷却，缓慢搅拌，迅速冰浴冷却， 12000rpm 5min，保管，保管上清液；上清液；选择性热变性除去杂蛋白选择性热变性除去杂蛋白n将上清液置于离心管中，参与等体积预冷的无水乙醇乙醇终将上清液置于离心管中，参与等体积预冷的无水乙醇乙醇终浓度约浓度约50，20度静置度静置15

9、20min，12000rpm 5min，保，保管沉淀物；管沉淀物；有机溶剂沉淀法获得蔗糖酶有机溶剂沉淀法获得蔗糖酶n每管参与每管参与1mLPBSpH7.2于沉淀物中，悄然搅拌促溶；于沉淀物中，悄然搅拌促溶；纯酶液纯酶液n酶活测定酶活测定n蔗糖酶将底物水解为复原糖蔗糖酶将底物水解为复原糖试剂（均（均35度预度预热）热）粗酶液组粗酶液组纯酶液组纯酶液组测定组1对照组1测定组2对照组2酶液（mL）1.01.01.01.01N NaOH液（mL）0.50.55%蔗糖液（mL）2.02.02.02.035度水浴10min，自来水冷却1N NaOH液（mL）0.50.52、DNS法测定复原糖量法测定复原糖量试剂粗酶液组纯酶液组测定组1对照组1测定组2对照组2水解液（mL）1111蒸馏水（mL）0.50.50.50.5DNS液（mL）1.01.01.01.0沸水浴5min，自来水冷却，稀释至10mL，以对照组调零以对照组调零，记录测定组OD540nm。实验结果实验结果n计算酶活力计算酶活力n 将吸光值代入实验一葡萄糖规范曲线，将吸光值代入实验一葡萄糖规范曲线，得到水解液中复原糖的毫克数得到水解液中复原糖的毫克数n 酶活力酶活力U/mL复原糖毫克数复原糖毫克数3.5水解液体积水解液体积n 蔗糖酶活力定义：在一定实