药物定量分析与分析方法验证

1、2021/3/261第五章第五章 体内药物分析体内药物分析 体内药物分析是一门研究生物机体中药体内药物分析是一门研究生物机体中药物及其代谢物和内源性物质的质与量变化规律物及其代谢物和内源性物质的质与量变化规律的分析方法学的分析方法学 体内药物分析又被称为体内药物分析又被称为 生物医药分析生物医药分析 Biomedical AnalysisBiomedical Analysis 生物药物分析生物药物分析 Biopharmaceutical AnalysisBiopharmaceutical Analysis2021/3/262药物分析的重要分支学科药物分析的重要分支学科研究生物机体中外源性药物及

2、其代谢物和内源性研究生物机体中外源性药物及其代谢物和内源性活性物质的质与量的变化规律活性物质的质与量的变化规律药物的体内研究和治疗药物监测药物的体内研究和治疗药物监测综合性较强的应用学科综合性较强的应用学科:分析方法学分析方法学为将来的相关课程（临床药学、临床药理学、生为将来的相关课程（临床药学、临床药理学、生物药剂学）学习和实验研究奠定重要的基础物药剂学）学习和实验研究奠定重要的基础2021/3/263药物进入体内后药物进入体内后经过吸收、分布、代谢和排泄等动力学过程经过吸收、分布、代谢和排泄等动力学过程化学结构和存在状态都可能发生变化化学结构和存在状态都可能发生变化在不同个体中存在差异（个

3、体差异）在不同个体中存在差异（个体差异）进而直接影响到药物在不同个体中的治疗效应进而直接影响到药物在不同个体中的治疗效应和毒副作用和毒副作用需对生物体内药物及其代谢物进行研究分析需对生物体内药物及其代谢物进行研究分析2021/3/264药物在人（或动物）体内的存在形式药物在人（或动物）体内的存在形式 游离型游离型: :原形药物或代谢物原形药物或代谢物 药物或其代谢物与葡萄糖醛酸等结合药物或其代谢物与葡萄糖醛酸等结合: :缀合物缀合物 药物与蛋白质结合药物与蛋白质结合: :结合物结合物体内药物分析的任务体内药物分析的任务 检测人（或动物）的体液或组织（生物样本）检测人（或动物）的体液或组织（生物

4、样本）中的药物或特定代谢物的浓度中的药物或特定代谢物的浓度2021/3/265 生物样本的特点生物样本的特点 1.1.药物浓度药物浓度: :低低, ,要求方法灵敏度高要求方法灵敏度高 2.2.干扰物质干扰物质: :多多, ,要求方法专属性好要求方法专属性好 3.3.样品量少、不能重复取样样品量少、不能重复取样. .生物样品多数在特生物样品多数在特定条件下采集定条件下采集, ,无法再次取样，且浓度低、变化幅无法再次取样，且浓度低、变化幅度大度大. . 在样品测定之前，进行适当的样品制备，在样品测定之前，进行适当的样品制备，进行分离、纯化、浓集、必要时还需对待测组分进进行分离、纯化、浓集、必要时还

5、需对待测组分进行化学衍生化，然后进行测定行化学衍生化，然后进行测定2021/3/266 评价药物的安全性（临床前研究）评价药物的安全性（临床前研究）: :动物动物 评价药物的有效性（临床研究）评价药物的有效性（临床研究）: :人体（健康人体（健康志愿者或患者）志愿者或患者） 用药的安全、有效与合理用药的安全、有效与合理: :人体（患者人体（患者TDM :TDM :治治疗药物血浓度监测疗药物血浓度监测 ）2021/3/267 分析方法有分析方法有: : 色谱法色谱法:HPLC,HPCE,GC:HPLC,HPCE,GC 光谱法光谱法: :比色法、紫外比色法、紫外- -可见分光光度法、荧可见分光光度

6、法、荧光分光光度法、原子吸收分光光度法光分光光度法、原子吸收分光光度法 免疫分析法免疫分析法: :放射免疫法放射免疫法RIARIA、酶免疫法、酶免疫法EIAEIA、化学发光酶免疫、荧光免疫分析化学发光酶免疫、荧光免疫分析 联用技术联用技术:GC-MS:GC-MS、LC-MSLC-MS、LC-NMRLC-NMR2021/3/268 发展概况发展概况 2020世纪世纪6060年代年代: :临床药理学与生物药剂学建立临床药理学与生物药剂学建立 7070年代初年代初: :体内药物分析在国外开始建立体内药物分析在国外开始建立 7070年代末年代末: :血药浓度监测广泛用于临床血药浓度监测广泛用于临床 8

7、080年代年代: :体内药物分析学科雏形基本形成体内药物分析学科雏形基本形成 国内发展概况国内发展概况: :在在7070年代末受到关注年代末受到关注19791979年有相关论文发表年有相关论文发表 19811981年在年在“中国药学会药物分析第一次学术会中国药学会药物分析第一次学术会议议”大会上作学术报告大会上作学术报告, ,引起了广泛的关注和兴趣引起了广泛的关注和兴趣8080年代中期年代中期, ,许多高等医药院校为本科生、硕士研许多高等医药院校为本科生、硕士研究生开设了体内药物分析必修和选修课程究生开设了体内药物分析必修和选修课程. . 2021/3/269学科主要研究问题学科主要研究问题

8、游离型血药浓度测定方法研究游离型血药浓度测定方法研究 血中游离型药物浓度血中游离型药物浓度(F)(F)与总浓度与总浓度(T)(T)的比率的比率(F/T)(F/T)及唾液与血液游离浓度的比率及唾液与血液游离浓度的比率(S/P)(S/P)以及它们以及它们之间的相关性的研究之间的相关性的研究 代谢物的监测与研究代谢物的监测与研究 对映体的监测与研究对映体的监测与研究 体内微量元素的测定与研究体内微量元素的测定与研究 方便、快捷的样品制备方法与样品直接进样分方便、快捷的样品制备方法与样品直接进样分析的研究析的研究 分析新方法、新技术的联用研究分析新方法、新技术的联用研究 体内药物分析方法的质量控制研究

9、体内药物分析方法的质量控制研究2021/3/2610第一节第一节 常用体内样品的制备与贮藏常用体内样品的制备与贮藏一一. 样品种类样品种类,采集与制备采集与制备v 1.1.血样血样: :血药浓度一般指血浆（血清中）药物血药浓度一般指血浆（血清中）药物浓度浓度, ,它可正确反映药物在作用点的浓度。它可正确反映药物在作用点的浓度。v 药物在血中分布均匀后取样药物在血中分布均匀后取样: :a.a.动物动物: :动脉或动脉或心脏心脏, ,b.b.人静脉或毛细管采血人静脉或毛细管采血. . 血液：血液：a.a.加抗凝加抗凝剂混合（剂混合（EDTA,EDTA,肝素肝素etc),etc),离心离心(3000

10、r/min (3000r/min , ,5min)5min)取上清液为取上清液为血浆血浆。b.b.室温放室温放0.51h0.51h，3000 r/min3000 r/min离心离心510 min ,510 min ,取上清液为取上清液为血清血清。C.C.全血全血. . 2021/3/2611 要点要点: :取样后及时分离出血浆（清）取样后及时分离出血浆（清）, ,随随后进行分析后进行分析, ,若不能马上测定若不能马上测定, ,应密塞后置冰应密塞后置冰箱保存（时间短箱保存（时间短: :4 4，长，长: :-20)-20) 应用应用: :药物动力学药物动力学; ;生物利用度生物利用度; ;临床治临

11、床治疗药物监测疗药物监测(TDM)(TDM)2021/3/2612v 2 2尿液尿液 优点优点: :易收集、量大易收集、量大, ,主要用于药物剂量回收主要用于药物剂量回收, ,尿清除率尿清除率, ,生物利用度研究，以及药物代谢研究，生物利用度研究，以及药物代谢研究，一般采集一般采集24h24h尿液，最好立即测定，否则要加防尿液，最好立即测定，否则要加防腐剂（腐剂（PhCHPhCH3 3,CHCl,CHCl3 3etcetc）置冰箱保存。）置冰箱保存。 缺点缺点: :尿液中药浓度与血药浓度相关性差，尿液中药浓度与血药浓度相关性差，肾功能不全者不适于取样肾功能不全者不适于取样v 33唾液唾液: :

12、 优点：样品易得，采集无痛，无危险。优点：样品易得，采集无痛，无危险。 缺点：一般唾液中药浓与血药浓度不吻合，缺点：一般唾液中药浓与血药浓度不吻合，易变易变2021/3/2613v 4.4.组织组织: :用于药物体内动力学研究用于药物体内动力学研究v 步骤步骤: :取样取样, ,匀浆匀浆, ,去蛋白去蛋白v 5.5.头发头发: :主要用于体内微量元素的测定。主要用于体内微量元素的测定。v 枕部取样枕部取样, ,洗净，消化或者高温灰化后测定洗净，消化或者高温灰化后测定2021/3/2614v 二二 体内样品的贮藏与处理体内样品的贮藏与处理v 1.1.冷藏或冷冻冷藏或冷冻v 2.2.去活性去活性:

13、 :快速冷冻快速冷冻; ;微波照射微波照射; ;加入酶活性阻断加入酶活性阻断剂或者抗氧剂剂或者抗氧剂; ;高温煮沸。高温煮沸。2021/3/2615第二节第二节.体内样品分析的前处理体内样品分析的前处理v依据依据: 1 1）样品种类（血）样品种类（血, ,尿）尿） 2 2）被测药物结构及性质）被测药物结构及性质 3 3）测定方法）测定方法: :专属性专属性, ,LODLOD 应用应用: : 1.1.药物含量高药物含量高, ,处理简单。处理简单。 2.2.样品干扰小样品干扰小,(,(如尿）如尿）, ,前处理简单前处理简单 3.3.测定方法专属性好测定方法专属性好(HPLC),(HPLC),前处理

14、简单。前处理简单。 2021/3/2616v 一一. . 目的目的v 1.1.使待测药物游离使待测药物游离v 2.2.满足测定方法的要求满足测定方法的要求: :重点考虑分析方法的重点考虑分析方法的灵敏度和专属性灵敏度和专属性. .v 3. 3.改善分析环境改善分析环境: :如如HPLC.HPLC.2021/3/2617二二. .样品前处理方法样品前处理方法1.1.去除蛋白质去除蛋白质v 目的目的:使结合型药物释放出来使结合型药物释放出来 减少乳化减少乳化 保护色谱柱保护色谱柱 方法方法: 1 1）加入与水相混溶的有机溶剂加入与水相混溶的有机溶剂（EtOH,MeEtOH,Me2 2CO, CO,

15、 CHCH3 3CN, etcCN, etc）, ,混匀后离心混匀后离心,取上清液分析（破坏氢取上清液分析（破坏氢键使蛋白质凝聚键使蛋白质凝聚）. . 2 2）加中性盐加中性盐NaNa2 2SOSO4 4,(NH,(NH4 4) )2 2SOSO4 4 : :与水结合与水结合, ,使使蛋白质脱水而沉淀蛋白质脱水而沉淀, ,离心后取上清液。离心后取上清液。 2021/3/2618 3 3）加强酸（）加强酸（CClCCl3 3COOH,HClOCOOH,HClO4 4）, ,适于适于pHpHPI,PI,蛋蛋白质白质为阳离子为阳离子,与强酸形成不溶性盐而沉淀。与强酸形成不溶性盐而沉淀。 4 4）加锌

16、或铜盐的沉淀剂如）加锌或铜盐的沉淀剂如CuSOCuSO4 4-Na-Na2 2WOWO4 4, ZnSO, ZnSO4 4 NaOH,NaOH,适于适于pHpHPI,PI,蛋白质为阴离子蛋白质为阴离子, ,与金属阳离与金属阳离子形成不溶盐而沉淀子形成不溶盐而沉淀 5 5）酶解法）酶解法: :用枯草菌溶素使肽链降解用枯草菌溶素使肽链降解, ,5060 5060 具最大活力具最大活力, ,条件温和，作用强，适于酸不稳定及条件温和，作用强，适于酸不稳定及结合牢固的药物结合牢固的药物. . 6) 6)热凝固法热凝固法 2021/3/2619样品前处理样品前处理 2. 2.分离分离, ,纯化纯化, ,浓

17、集浓集 目的目的: :消除干扰消除干扰, ,使待测物以适合的形式和使待测物以适合的形式和量用于分析。量用于分析。 (1)(1)液液- -液提取（液提取（LLELLE） 药物亲脂性强药物亲脂性强 内源性杂质亲水性强内源性杂质亲水性强 采用有机溶剂提取后可大大纯化样品采用有机溶剂提取后可大大纯化样品2021/3/2620 1 1）有机溶剂）有机溶剂( (极性见表极性见表5-1)5-1): :要求对待侧组分要求对待侧组分S S大大, ,bpbp低低, ,水溶性小水溶性小, ,无毒，稳定，不易乳化。常用无毒，稳定，不易乳化。常用EtEt2 2O,CHClO,CHCl3 3 2 2）二相体积比）二相体积

18、比: :采用少量多次提取法。采用少量多次提取法。 3 3）水相）水相pHpH值值: :主要考虑药物的酸碱性主要考虑药物的酸碱性 如：选择水相如：选择水相pHpH为碱性为碱性药物是生物碱药物是生物碱内源性杂质为酸性内源性杂质为酸性游离碱游离碱 脂液脂液成盐成盐 水溶性增加水溶性增加2021/3/2621（2) 2) 固相萃取（固相萃取（Solid-phase Extraction,SPESolid-phase Extraction,SPE） 小型柱色谱小型柱色谱, ,填料粒度小填料粒度小, ,分离效能高分离效能高, ,无无乳化现象，处理样品速度快，常用提取乳化现象，处理样品速度快，常用提取: :

19、 a.a.亲水性用硅藻土亲水性用硅藻土; ;b.b.疏水性用疏水性用C C1818. .由由VarianVarian公公司生产的半自动样品制备系统（司生产的半自动样品制备系统（Advanced Advanced automated sample processor, AASP)automated sample processor, AASP)使使SPESPE更更简便，快速，样品经简便，快速，样品经1010个固定微型柱离线萃取，个固定微型柱离线萃取，微柱转移到自动进样器做预柱，由流动相将分微柱转移到自动进样器做预柱，由流动相将分析物洗脱至分析柱。析物洗脱至分析柱。 缺点缺点: :成本高成本高20

20、21/3/2622v (3)(3)超滤超滤: :一种膜分离技术一种膜分离技术, ,按照分子量大按照分子量大小小, ,分离水溶性生物大分子分离水溶性生物大分子. .2021/3/26233.3.缀合物水解缀合物水解 含极性基团（含极性基团（OH,NHOH,NH2 2,COOH,COOH）的药物）的药物, ,常与常与内源性物质（如葡萄糖醛酸）形成缀合物内源性物质（如葡萄糖醛酸）形成缀合物, ,当当测定尿液中药物浓度时测定尿液中药物浓度时, ,需将缀合物中药物释需将缀合物中药物释出，常用酸解或酶解的方法。出，常用酸解或酶解的方法。2021/3/26244.4.化学衍生化学衍生目的目的: :1 1）提

21、高检测灵敏度）提高检测灵敏度, ,如如HPLCHPLC紫外检测紫外检测2 2）增加药物稳定性。）增加药物稳定性。3 3）提高药物分析能力）提高药物分析能力, ,如如: : a.GCa.GC中的中的-COOH-COOH衍生成衍生成-COOCH-COOCH3 3增大挥发增大挥发 性性, ,减少极性。减少极性。 b.b.手性分离中手性分离中: :生成非光学异构体（普通生成非光学异构体（普通柱色谱分析）柱色谱分析）2021/3/26251 1）GC: RCOOHGC: RCOOH Ar-OH Ar-OHCHCH2 2N N2 2 CHCH3 3OHOHRCOOCHRCOOCH3 3RCOOSiMeRC

22、OOSiMe3 3ArOCOCHArOCOCH3 3Ar-O-CHAr-O-CH3 3 Ar-OSiMe3Ar-OSiMe32021/3/2626 2 2）手性分离）手性分离: : + +（R R）-E-E R-SA R-SA S-SA S-SA手性药物手性药物 （R R）E-E-（R R）SASA（R R）E-E-（S S）SASA光活性试剂光活性试剂非对映异构体非对映异构体2021/3/2627 3 3）HPLC:HPLC:如庆大霉素如庆大霉素C C组分检查组分检查 a.a.柱前柱前衍生衍生 b.b.柱后柱后衍生衍生, ,需一个额外的泵需一个额外的泵 2021/3/2628第三节第三节 定

23、量分析方法验证定量分析方法验证v 一一 分析方法的建立分析方法的建立v 1.1.分析方法分析方法: :色谱分析法色谱分析法; ;免疫分析法免疫分析法; ;生物学生物学方法方法. .v 2. 2.步骤步骤:(1):(1)色谱条件选择色谱条件选择,(2),(2)色谱条件优化色谱条件优化: :空白溶剂试验空白溶剂试验考查溶剂影响考查溶剂影响; ;空白生物基质试验空白生物基质试验考查生物基质中内源性物质的影响考查生物基质中内源性物质的影响( (方法特异性方法特异性); ); 质控生物样品试验质控生物样品试验（空白生物基质中加入待测药物）空白生物基质中加入待测药物）考查考查方法效能指标方法效能指标;(3

24、);(3)实际样品实际样品(Incurre (Incurre samples)samples)测试测试代谢产物的干扰代谢产物的干扰( (方法特异性方法特异性) )2021/3/2629v 二二 分析方法验证分析方法验证(validation)(validation) 用于实际生物样品分析之前验证分析方法的用于实际生物样品分析之前验证分析方法的可行性与可靠性可行性与可靠性2021/3/2630（一）方法特异性（一）方法特异性specificityspecificity( (专属性或选择性专属性或选择性selectivityselectivity) )系指当有内源性物质存在时系指当有内源性物质存在

25、时, ,方法准确测定待方法准确测定待测物质的能力测物质的能力专属性专属性: :表示所检测的信号表示所检测的信号( (响应响应) )系属于待测系属于待测药物所特有的能力。药物所特有的能力。选择性选择性: :系指将待测物质与其代谢物及同服的系指将待测物质与其代谢物及同服的其它药物加以区分其它药物加以区分( (分离分离) )的能力。的能力。特异性特异性: :函盖二者函盖二者, ,以验证所测定的物质与待测以验证所测定的物质与待测药物的同一性。药物的同一性。2021/3/2631 1. 1. 内源性物质的干扰内源性物质的干扰 考查考查待测药物或其活性代谢产物检测信号待测药物或其活性代谢产物检测信号 比较

26、对照品（或标准品）比较对照品（或标准品）, ,空白生物基质空白生物基质, ,模模拟生物样品（空白生物基中加对照品）信号。拟生物样品（空白生物基中加对照品）信号。如如 H P L CH P L C 色 谱 峰 的色 谱 峰 的 t tR R、 n n 和和 T T 是 否 一 致是 否 一 致 , , 及与内源性物质色谱峰的及与内源性物质色谱峰的R R 确证确证: :内源性物质对分析方法有无干扰内源性物质对分析方法有无干扰2021/3/26322. 2. 代谢产物的干扰代谢产物的干扰 比较模拟生物样品和用药后的实际生物样品的比较模拟生物样品和用药后的实际生物样品的检测信号与代谢产物的检测信号与代

27、谢产物的R R值值。确证确证: :其它代谢产物对分析方法有无干扰其它代谢产物对分析方法有无干扰 结构已知的特定活性代谢物的测定结构已知的特定活性代谢物的测定必要时通过必要时通过HPLC-DADHPLC-DAD或或LC-MSLC-MS确证色谱峰的单纯确证色谱峰的单纯性和同一性性和同一性 对于结构未知的代谢产物的测定对于结构未知的代谢产物的测定, ,可采用可采用LC-LC-LC-LC-NMRNMR进行结构的初步推测后进行结构的初步推测后, ,考察其干扰情况。考察其干扰情况。2021/3/26333. 3. 伍用药物的干扰伍用药物的干扰 进行进行TDMTDM时时, ,还要考虑患者可能同时服用药物还要

28、考虑患者可能同时服用药物( (通常为数有限通常为数有限) )的干扰。的干扰。 比较待测药物及可能同时服用药物的模拟生比较待测药物及可能同时服用药物的模拟生物样品的检测信号物样品的检测信号确证确证: :同时服用药物对分析方法的干扰情况同时服用药物对分析方法的干扰情况2021/3/26344. 4. 与参比方法的相关性与参比方法的相关性 参比方法一般选用特异性强、准确度高、线性参比方法一般选用特异性强、准确度高、线性关系良好的色谱法关系良好的色谱法 如在如在TDMTDM中使用中使用UV(UV(或或RIA)RIA)时时, , 可以用可以用HPLC(HPLC(或或GC)GC)为参比为参比; ;以参比方

29、法测定结果为横坐标以参比方法测定结果为横坐标(X); (X); 拟拟定方法测定结果为纵坐标定方法测定结果为纵坐标(Y)(Y)用最小二乘法计算回归方程用最小二乘法计算回归方程 Y Ya abX (bX (坐标标坐标标度相等度相等) )和相关系数和相关系数( (r r) )表示两种方法测得结果表示两种方法测得结果的一致性。的一致性。2021/3/2635 Y Ya abXbX 截距截距(a)(a): :表示拟定方法受到恒定干扰的程度表示拟定方法受到恒定干扰的程度: :内内源性物质源性物质(UV)(UV) 斜率斜率(b)(b): :表示拟定方法受到比例干扰的程度：标表示拟定方法受到比例干扰的程度：标

30、记抗原不纯记抗原不纯(RIA)(RIA) 与参比方法的相关性比较与参比方法的相关性比较: :除显示分析方法的特除显示分析方法的特异性外异性外, ,斜率斜率b b表示两种方法测得结果的一致性表示两种方法测得结果的一致性 若截距若截距a0, a0, 则拟定方法的准确度则拟定方法的准确度( (回收率回收率) )为为100b(%)100b(%)2021/3/2636（二）标准曲线和定量范围（二）标准曲线和定量范围 标准曲线标准曲线(standard curve)(standard curve), ,oror叫校正曲线叫校正曲线(calibration curve)(calibration curve)

31、, ,or working curveor working curve生物样品中所测定药物浓度与响应的相关性生物样品中所测定药物浓度与响应的相关性 通常用回归分析方法所得的回归方程来评价通常用回归分析方法所得的回归方程来评价除少数方法（免疫分析法）外除少数方法（免疫分析法）外, ,标准曲线通常为标准曲线通常为线性模式线性模式回归分析法为最小二乘法（回归分析法为最小二乘法（least squaresleast squares）或加权最小二乘法（或加权最小二乘法（weighted least squaresweighted least squares1 1使用与待测样品相同的生物介质。使用与待测样

32、品相同的生物介质。22标准曲线点数标准曲线点数66，线性线性范围包含全部待测浓度。范围包含全部待测浓度。2021/3/2637v 3. 3.标准曲线的高低浓度范围叫定量（线性）范围标准曲线的高低浓度范围叫定量（线性）范围（quantification rangequantification range）, ,应能覆盖全部生物样品应能覆盖全部生物样品中的药物浓度中的药物浓度v 4.4.以待测药物的检测响应以待测药物的检测响应( (如色谱峰面积或峰高如色谱峰面积或峰高) ) 或与内标物质的检测响应的比值或与内标物质的检测响应的比值( (内标法内标法)()(因变量因变量,y),y)对标准样品中药物浓

33、度对标准样品中药物浓度( (自变量自变量, ,x x) ), ,进行线性回归进行线性回归, ,求求得回归方程得回归方程(y(ya abx)bx)及其相关系数及其相关系数( ( ) )，最高浓，最高浓度应高于达峰浓度度应高于达峰浓度( (C Cmax)max); ;最低浓度应低于最低浓度应低于C Cmaxmax的的10%10%5%5%，并应为方法的，并应为方法的LOQLOQ，回归方程的截距应接近，回归方程的截距应接近于零，相关系数要求于零，相关系数要求 0.99(0.99(色谱法色谱法) )或或0.98(0.98(生生物学方法物学方法) )2021/3/26385.5.标准系列模拟生物样品的制备

34、标准系列模拟生物样品的制备 空白生物基质空白生物基质( (如血浆如血浆)加入标准系列溶液加入标准系列溶液适量适量, ,涡旋混匀涡旋混匀, ,防止在标准溶液加入及涡旋混合时防止在标准溶液加入及涡旋混合时造成损失造成损失 先加入标准溶液先加入标准溶液 再加入空白生物基质再加入空白生物基质 涡旋混匀涡旋混匀 2021/3/2639v （三）定量下限（三）定量下限（LLOQLLOQ）v 标准曲线上的最低浓度点标准曲线上的最低浓度点, ,表示方法的灵敏度表示方法的灵敏度（sensitivitysensitivity）, ,即测定样品中符合准确度和精密即测定样品中符合准确度和精密度要求的最低药物浓度。度要

35、求的最低药物浓度。v 应能满足测定应能满足测定3 35 5个消除半衰期后生物样品中个消除半衰期后生物样品中的药物浓度的药物浓度v 准确度在准确度在80%80%120%(120%(或或RERE在在20%20%的范围内的范围内) )vRSDRSD应应20%20%2021/3/2640 （四）精密度（四）精密度precisionprecision与准确度与准确度accuracyaccuracy 高中低高中低三个浓度的三个浓度的QCQC样品样品, ,LOQLOQ附近附近, ,标准曲线上标准曲线上限及中间各一个浓度各限及中间各一个浓度各5 5个样。个样。 日内日内, ,日间精密度的日间精密度的RSDRS

36、D15%15%，LOQLOQ附近附近20%20%，加，加样回收率样回收率85115%,LOQ85115%,LOQ附近附近80120%80120%。2021/3/2641准确度以准确度以测定值测定值M M (measured)(measured)的平均值与理论浓度的平均值与理论浓度( (加入值加入值) )A A(added)(added)的比值表示的比值表示相对回收率相对回收率相对误差相对误差 限度要求限度要求: :相对回收率应在相对回收率应在85%85%115% (LOQ115% (LOQ附近附近80%80%120%),RE120%),RE在在15% (LOQ15% (LOQ附近为附近为20%

37、)20%)）（%100AMRR）（）（%100%100RRAAMRE2021/3/2642方 法 精 密 度 一 般 用 标 准 偏 差方 法 精 密 度 一 般 用 标 准 偏 差 ( s t a n d a r d ( s t a n d a r d deviationdeviation, ,SDSD) )或相对标准偏差或相对标准偏差(relative standard (relative standard deviationdeviation, ,RSDRSD) )表示表示 SDSD= =RSDRSD= = = = 包括批内包括批内(within-run(within-run或或intr

38、a-assay)intra-assay)RSDRSD( (日内日内) ) 和批间和批间(between-run(between-run或或inter-assay)inter-assay)RSDRSD( (日间日间) )112nXXniii）（%100XSD）（%100112XnXXniii2021/3/2643方差分析法方差分析法 批间批间RSDRSD = =批内批内RSD RSD = = =(%)1001)(%)100112 XIXXnXISSIiiA）（%100(%)100 XINSSSSXINSSAtote）（）（%100)(11212 XINXXnXXIiIiinjij2021/3/2

39、644v SS SSe e: :批内方差批内方差; ;SSSSA A: :批间方差批间方差; ;SSSStottot: :总方差总方差; ;X Xijij：第第i i批第批第j j次测定；次测定；X Xi i.:.:第第i i批批n n次测定平均值次测定平均值; X:N; X:N次次测定总平均值测定总平均值;I:;I:测定批数测定批数;n:;n:每批测定次数每批测定次数;N:;N:总总测定次数测定次数2021/3/2645( (五）五）样品稳定性样品稳定性 室温及冷冻下室温及冷冻下, ,测测A A（吸收度或峰面积）以考察（吸收度或峰面积）以考察不同条件下不同条件下, ,样品的可保存时间及稳定性

40、样品的可保存时间及稳定性 QCQC样品穿插于实际样品测定全过程样品穿插于实际样品测定全过程模拟模拟( (或实际或实际) )生物样品及其预处理后的待测溶生物样品及其预处理后的待测溶液进行考察液进行考察 要求要求: :准确度准确度85%85%115%(115%(RERE在在15%15%范围范围内内) ), ,RSDRSD15% 15% 2021/3/2646（六）（六）提取提取回收率（回收率（extraction recoveryextraction recovery） 考察样品处理过程的回收率考察样品处理过程的回收率 重现性好重现性好 v提取回收率一般应提取回收率一般应50%50%v高、中浓度的高、中浓度的RSDRSD应应1