第四章核酸操作基本技术

1、前言前言 q 基因组基因组DNA的提取的提取 CTAB法法 SDS法法 其它其它 组份组份 Tris-HCl （pH 8.0）EDTA （pH 8.0） NaCl CTAB-巯基乙醇巯基乙醇 终浓度终浓度 100 mM 20 mM 1.4M2%(W/V)0.1 %（V/V）使用前加入使用前加入 组份组份 Tris-HCl （pH8.0）EDTA （pH8.0）NaCl CTAB PVP40-巯基乙醇巯基乙醇 终浓度终浓度 100 mM 20 mM1.4M3%(W/V)5%(W/V)2%（V/V）使使用前加入用前加入植物材料植物材料裂解液裂解液上层溶液上层溶液液氮研磨液氮研磨抽提抽提细胞裂解细胞

2、裂解干燥溶解干燥溶解离心洗涤离心洗涤酒精沉淀酒精沉淀DNA溶液溶液SDS法流程图法流程图 （以动物组织为例）（以动物组织为例） 动物组织动物组织细胞裂解细胞裂解上层溶液上层溶液组织匀浆组织匀浆抽提抽提干燥溶解干燥溶解离心洗涤离心洗涤酒精沉淀酒精沉淀DNA溶液溶液菌体菌体溶液溶液III中和中和溶液溶液I充分重悬充分重悬溶液溶液II裂解裂解上清液上清液抽提抽提离心洗涤离心洗涤酒精沉淀酒精沉淀干燥溶解干燥溶解沉淀沉淀质粒质粒DNA溶液溶液I.I.材料准备材料准备II.II.破碎细胞或包膜内容物释放破碎细胞或包膜内容物释放III.III.核酸分离、纯化核酸分离、纯化IV.IV.沉淀或吸附核酸，并去除杂

3、质沉淀或吸附核酸，并去除杂质 V.V.核酸溶解在适量缓冲液或水中核酸溶解在适量缓冲液或水中最好使用新鲜材料，低温保最好使用新鲜材料，低温保存的样品材料不要反复冻融存的样品材料不要反复冻融提取血液基因组提取血液基因组DNA时，要时，要选择有核细胞（白细胞）选择有核细胞（白细胞）组培细胞培养时间不能过长，组培细胞培养时间不能过长，否则会造成否则会造成DNA降解降解含病毒的液体材料含病毒的液体材料DNA含量含量较少，提取前先富集较少，提取前先富集质粒质粒DNA的提取的提取使用处于对数期的新鲜菌体使用处于对数期的新鲜菌体（老化菌体导致开环质粒增加）（老化菌体导致开环质粒增加）培养时应加入筛选压力，否则

4、培养时应加入筛选压力，否则菌体易污染，质粒易丢失菌体易污染，质粒易丢失尽量选择高拷贝的质粒，如为尽量选择高拷贝的质粒，如为低拷贝或大质粒，则应加大菌低拷贝或大质粒，则应加大菌体用量体用量菌株不要频繁转接（质粒丢失）菌株不要频繁转接（质粒丢失）质粒质粒DNA的提取的提取菌体量适当菌体量适当培养基去除干净，同时保证菌培养基去除干净，同时保证菌体在悬浮液中充分悬浮体在悬浮液中充分悬浮变性的时间不要过长（变性的时间不要过长（5分钟），分钟），否则质粒易被打断否则质粒易被打断复性时间也不宜过长，否则会复性时间也不宜过长，否则会有基因组有基因组DNA的污染的污染G菌、酵母质粒的提取，应先菌、酵母质粒的提取

5、，应先用酶法或机械法处理，以破壁用酶法或机械法处理，以破壁采用吸附材料吸附的方式分离采用吸附材料吸附的方式分离DNA时，应提供相时，应提供相应的缓冲体系；应的缓冲体系；采用有机（酚采用有机（酚/氯仿）抽提时应充分混匀，但动作氯仿）抽提时应充分混匀，但动作要轻柔；要轻柔；离心分离两相时，应保证一定的转速和时间；离心分离两相时，应保证一定的转速和时间；针对不同材料的特点，在提取过程中辅以相应的针对不同材料的特点，在提取过程中辅以相应的去杂质的方法；去杂质的方法；基因组基因组DNA的提取的提取质粒质粒DNA的提取的提取q 蛋白质的去除：蛋白质的去除：酚酚/氯仿抽提氯仿抽提使用变性剂变性（使用变性剂变

6、性（SDS、异硫氰酸胍等）异硫氰酸胍等）高盐洗涤高盐洗涤蛋白酶处理蛋白酶处理q 多糖的去除：多糖的去除：高盐法：用乙醇沉淀时，在待沉淀溶液中加入高盐法：用乙醇沉淀时，在待沉淀溶液中加入1/2体积的体积的5M NaCl，高盐可溶解多糖。高盐可溶解多糖。用多糖水解酶将多糖降解。用多糖水解酶将多糖降解。在提取缓冲液中加一定量的氯苯在提取缓冲液中加一定量的氯苯(1/2体积体积)，氯苯可以与多糖的，氯苯可以与多糖的羟基作用，从而去除多糖羟基作用，从而去除多糖 。用用PEG8000代替乙醇沉淀代替乙醇沉淀DNA：在：在500L DNA液中加入液中加入200l 20% PEG8000 (含含1.2 M Na

7、Cl) ，冰浴冰浴20min。当沉淀时间有限时，用预冷的乙醇或异丙醇沉淀，沉淀会更充分当沉淀时间有限时，用预冷的乙醇或异丙醇沉淀，沉淀会更充分沉淀时加入沉淀时加入1/10体积的体积的NaAc（pH5.2，3M），），有利于充分沉淀有利于充分沉淀沉淀后应用沉淀后应用70的乙醇洗涤，以除去盐离子等的乙醇洗涤，以除去盐离子等晾干晾干DNA，让乙醇充分挥发（不要过分干燥）让乙醇充分挥发（不要过分干燥）若长期储存建议使用若长期储存建议使用TE缓冲液溶解缓冲液溶解TE中的中的EDTA能螯和能螯和Mg2+或或Mn2+离子，抑制离子，抑制DNasepH值为值为8.0，可防止，可防止DNA发生酸解发生酸解 基因

8、组基因组DNA的提取的提取质粒质粒DNA的提取的提取q问题一：问题一：DNA样品不纯，抑制后续酶解和样品不纯，抑制后续酶解和PCR反应。反应。q问题二：问题二：DNA降解。降解。1.材料不新鲜或反复冻材料不新鲜或反复冻融融2.未很好抑制内源核酸未很好抑制内源核酸酶的活性酶的活性3.提取过程操作过于剧提取过程操作过于剧烈，烈，DNA被机械打断被机械打断4.外源核酸酶污染外源核酸酶污染5.反复冻融反复冻融1.尽量取新鲜材料，低温保存材料避尽量取新鲜材料，低温保存材料避免反复冻融免反复冻融2.液氮研磨或匀浆组织后，应在解冻液氮研磨或匀浆组织后，应在解冻前加入裂解缓冲液前加入裂解缓冲液3.在提取内源核

9、酸酶含量丰富的材料在提取内源核酸酶含量丰富的材料的的DNA时，可增加裂解液中螯合剂时，可增加裂解液中螯合剂的含量的含量4.细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔5.所有试剂用无菌水配制，耗材经高所有试剂用无菌水配制，耗材经高温灭菌温灭菌6.将将DNA分装保存于缓冲液中，避免分装保存于缓冲液中，避免反复冻融反复冻融对对策策 原原因因对对策策 原原因因第三部分：第三部分：RNA提取方法简介提取方法简介q RNA 的降解的降解 q OD260 /OD280 比值偏低比值偏低q 电泳带型异常电泳带型异常q 下游实验效果不佳下游实验效果不佳 OD260 /OD280 比值偏低比值偏

10、低q 蛋白质污染：蛋白质污染：不要吸入中间层及有机相不要吸入中间层及有机相，加入氯仿后首先混匀，并且离心分加入氯仿后首先混匀，并且离心分层的离心力和时间要足够。层的离心力和时间要足够。减少起始样品量，确保裂解完全、彻底减少起始样品量，确保裂解完全、彻底解决办法解决办法:重新抽提一次，再沉淀，溶解。重新抽提一次，再沉淀，溶解。q 苯酚残留：苯酚残留：不要吸入中间层及有机相，加入氯仿后首先混匀，并且离心分不要吸入中间层及有机相，加入氯仿后首先混匀，并且离心分层的离心力和时间要足够。层的离心力和时间要足够。解决办法解决办法:重新抽提一次，再沉淀，溶解。重新抽提一次，再沉淀，溶解。 q RNA 降解降

11、解 q 抽提试剂的残留抽提试剂的残留 75% 乙醇洗涤乙醇洗涤 q 样品中杂质的残留样品中杂质的残留 多糖等杂质，再次沉淀多糖等杂质，再次沉淀 q DNA 污染污染 使用使用RNase-Free 的的 DNase I 消化抽提消化抽提RNA RNA降解降解分离无污染，高质量的分离无污染，高质量的RNA；防止防止RNA降解降解RNA中含逆转录酶抑制剂中含逆转录酶抑制剂70（v/v）乙醇清洗乙醇清洗RNA沉淀，除去抑制剂沉淀，除去抑制剂起始起始RNA量太低量太低增加增加RNA的量的量 多糖同多糖同RNA共沉淀共沉淀用氯化锂沉淀用氯化锂沉淀RNA以除去多糖以除去多糖合成合成cDNA第一链合成的引物第

12、一链合成的引物退火失败退火失败确定退火温度适合所用的引物确定退火温度适合所用的引物RNA模板存在较多二级结构模板存在较多二级结构将将RNA和引物在不含盐及缓冲液条件下变性和引物在不含盐及缓冲液条件下变性/退火，退火，提高逆转录反应温度提高逆转录反应温度反转录成功，反转录成功，PCR失败失败PCR步骤中使用超过步骤中使用超过1/5的逆转录反应产物的逆转录反应产物v 核酸样品的浓度的测定，一般采用紫外光谱分析、荧光分核酸样品的浓度的测定，一般采用紫外光谱分析、荧光分析、水平式琼脂糖凝胶电泳法、聚丙烯酰胺凝胶电泳法和析、水平式琼脂糖凝胶电泳法、聚丙烯酰胺凝胶电泳法和脉冲电泳法等。脉冲电泳法等。 v紫外光谱分析法的原理基于紫外光谱分析法的原理基于DNA(或或RNA)分子在分子在260nmm处有特异的紫外吸收峰处有特异的紫外吸收峰且吸收强度与系且吸收强度与系统中统中DNA或或RNA的浓度成正比。的浓度成正比。v分子形状、双链与单链之间的转换也会导致吸收分子形状、双链与单链之间的转换也会导致吸收水平的改变，但是这种偏差可以用特定的公式来水平的改变，